80]I. 2. 4PCR产物与T载体的连接
[0081] 按照TaKaRa公司T载体试剂盒说明进行，连接产物通过电转导入大肠杆菌感受态 中，将电转后的细菌涂于LB/Ampicillin/IPTG/X-Gal的培养基平板上，通过蓝白斑筛选获 得阳性克隆。
[0082]试剂：Amp(50mg/ml):IOOmgAmp加 2ml去离子水 500ml，过滤灭菌。
[0083] IPTG(0. 1M) :1. 2g IPTG加水50ml，过滤，4°C贮存。
[0084]X-Gal(50mg/ml) :100mg5_ 溴-4-氯 _3H引噪-{3-D-半乳糖苷溶于 2ml二甲基
[0085] 甲酰胺溶液。用铝箱包裹以防因光照而被破坏，_20°C贮存，须过滤。
[0086]在LB/Amp上加100y1的0? IM IPTG和20y1的50mg/ml X-Gal使用。
[0087] 1. 2. 5油菜的遗传转化和阳性苗的PCR鉴定
[0088]I. 2. 5. 1无菌苗的获得
[0089] 种子用75%的酒精表面消毒30s，用无菌水冲洗2-3次，再用2%的次氯酸钠消毒 12-14min，用无菌水清洗5-6次，然后接种于MS固体培养基，在25°C，光照16h条件下培 养成苗，苗龄3-4d的子叶柄和下胚轴切段用于转化试验。（子叶柄去生长点，下胚轴切成 0? 5cm左右的小段）
[0090]1. 2. 5. 2根癌农杆菌的活化
[0091] 将_80°C保存的含构建好质粒的农杆菌菌液解冻，涂于含有抗生素的YEB固体培 养基28°C暗培养。2d后挑取单菌落于含有抗生素的YEB液体培养基，在28°C，转速200r/ min摇床上培养至0D600值为0. 6-1. 0备用。
[0092] 1. 2. 5. 3根癌农杆菌的培养及转化
[0093]离心收集活化的农杆菌（5000r/min，8min)，用MS+lmg/L2,4_D+500mg/L MES+200 ymol/L AS重悬培养液稀释至0D600值为0. 2左右用于浸染。
[0094] 将切好的子叶柄与下胚轴于农杆菌浸染液中浸泡8min(其间不断振荡以均匀 浸染）。于MS+lmg/L2,4-D+500mg/LMES+200ymol/LAS中暗培养 2d，转入MS+3mg/ L6-BA+0.lmg/LNAA+5mg/LAgN03+400mg/LCar延迟筛选培养基中培养 5-7d，25 °C，光照 16h。再转入MS+3mg/L6_BA+0.lmg/LNAA+5mg/LAgN03+400mg/LCar+筛选抗生素的筛选培 养基中，外植体在上述培养基中，每隔20d用原培养基（筛选培养基）继代培养一次。待 分化出绿色小芽后转入新鲜培养基（筛选培养基）中培养，待分化出的绿芽长到3cm左右 时，移入MS+0. 2mg/LNAA+400mg/LCar+筛选抗生素的生根培养基中生根。
[0095] 待再生的植株在生根培养基中根系发育良好后，经过逐步炼苗后移入温室生长。
[0096] 注：筛选培养基中卡那霉素浓度为13mg/L，生根培养基中卡那霉素浓度为15mg/ L0
[0097] 1. 2. 5. 4阳性苗的PCR快速检测
[0098] 1.称取约50mg的叶片，用70%的乙醇擦洗叶片，放入Eppendorf管中，用钻头研 磨。
[0099] 2.加入600yIDNA提取液，混勾，室温放置Ih。
[0100]DNA提取液
[0101] 500mM NaCl
[0102] 50mM EDTA
[0103] 0.38% (ff/V) Sodium bisulfate
[0104] 1.25% (ff/V)SDS
[0105] IOOmM Tris-HCl (pH8. 0)
[0106] 8. 3mMNaOH
[0107] 3. 12000rpm离心lOmin，取上清，移入新的Eppendorf管中，加入等体积的酸/氯 仿（1 : 1V/V)，混匀。
[0108] 4. 12000rpm离心5min，取上清，移入新的Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇， 放置IOmin。
[0109] 5. 12000rpm离心 5min。
[0110] 6.弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤一次。
[0111]7.沉淀干燥后用20 y ITE(pH7. 5)溶解。以0. 5 y 1为模板进行PCR扩增筛选阳 性植株。
[0112] 1. 2. 6阳性转基因植株Cre酶表达水平的RT-PCR分析
[0113] 1. 2. 6. 1幼叶总RNA的提取
[0114] 步骤按上海生工公司Trizol试剂盒说明书进行：
[0115] 1.称取约0.1 Og植物材料，液氮中将组织碾磨成粉末，趁液氮尚未挥发完全时，将 粉末转移到I. 5ml离心管中。
[0116] 2.在样品中加入ImlTrizol，震荡混匀。室温放置5min。加入200yl氯仿，剧烈 振荡混勾3〇86〇。然后于室温放置5111；[11，12,000印111，4°(^离心10111；[11。
[0117] 3.将上清液小心转移到RNase-freel. 5ml离心管里，加入等体积的异丙醇，室温 下放置 5min。12,000rpm，4°C离心lOmin。
[0118] 4.移去上清液，保留RNA沉淀。用70%酒精洗涤两次，每次700y1，12000rpm，4°C 离心5min〇
[0119] 5.空气干燥RNA。用30~50yIDEPC-H2O溶解，置于-70 °C保存备用。
[0120] 6?测定样品在260nm和280nm的吸收值确定RNA的质量。按IOD= 40ygRNA计 算RNA的产率。0D26Q/2S。在1. 8~2.O视为RNA的纯度很高。
[0121] 7.进行甲醛变性琼脂糖电泳，确定RNA的完整性和污染情况。如果出现两条清晰 的条带（由于胶的浓度与上样量的不同有时呈现3条带），且最大两条条带（28SRNA:18S RNA)的亮度比约为2 : 1时，则总RNA的完整性良好。
[0122]L2. 6. 2cDNA第一链的合成
[0123] eDNA第一链的合成步骤按美国Promega公司反转录试剂盒说明书进行。
[0124] 1.将I y g总RNA加入微量离心管，用水补充体积至10 y 1，70°C温育lOmin，短暂 离心后置于冰上。
[0125] 2.依照所列顺序加入以下试剂以建立一个20y1的反应体系（依据RNA的量，反 应体积可以增减）：见表1
[0126]
[0127]表1
[0128] 3.将反应体系混匀后42°C温育Ih;95°C加热5min，冷却到4°C，存于_20°C备用。
[0129]L2. 6. 3RT-PCR表达分析
[0130] 以目的基因序列为引物，以PDS基因作内标来确定PCR时的模板量，进行半定量 RT-PCR表达分析。
[0131] 2结果与分析
[0132] 以植物表达载体pBI121 (图1)为基础构建含有Cre/loxP位点特异性重组系统的 表达质粒。
[0133] 2. 1包含Cre/loxP位点特异性重组系统的载体Cre40的构建
[0134] 以双元载体pBI121为基础，将lox66_Cre片段替换pBI121的⑶S基因即获得载 体Cre40 (图 2)。
[0135] 2.I.llox66_Cre片段的获得
[0136] 以Iox66-Cre-5' （5,-TAACCCGGGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAACGGTACC ATGTCCAATTTACTGACCGTACACC-3'）和SacI-cre-3'-new(5'-TAAGAGCTCTAATCGCCATCTTCC AGCAGGCGCAC-3'）为一对引物，利用La-Taq酶扩增J20(Pc_cre，包含有Cre基因序列）获 得lox66_C;re片段。
[0137] 2.I. 21ox66_Cre片段与PBI121 载体的连接
[0138] 电泳并回收片段，用SacI和SmaI双酶切，同时pBI121质粒也用SacI和Sma I双酶切，切除GUS基因，分别回收片段和载体，利用NEB的T4连接酶连接过夜，连接产物 2yL电转Epl300感受态，37°C复苏lh，涂板Kan/LB平板。
[0139] 2. 1.3阳性克隆的筛选
[0140] 用引物lox66-Cre_5'和SacI-cre-3'-newPCR筛选阳性克隆，以J20为阳性对 照。在阳性克隆中随机挑选三个克隆进行酶切鉴定。
[0141] 酶切鉴定20, 29,40号克隆，通过SacI和SmaI双酶切后电泳检测（图3)。
[0142] 在图3中，1-3