一种以葡萄糖为底物筛选富集嗜盐高聚pha混合菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种选择富集具有聚羟基脂肪酸酯(PHA)积累能力的混合菌群的方法，尤其是以葡萄糖为底物以天然入海口底泥为接种物在高盐条件下选择富集具有PHA积累能力嗜盐混合菌的方法。该方法作为两步法生产PHA的第一步，可以为后续发酵生产PHA提供菌群，降低PHA生产成本。该方法属于生物生产PHA技术领域。
【背景技术】
[0002]目前，以石油为原料生产的塑料已经广泛应用于各个行业中。然而废弃塑料带来的“白色污染”和垃圾围城现象以及塑料燃烧产生的大气污染、水污染严重地影响了人们的生活环境。因此，生物可降解塑料作为以石油为原料生产的塑料的替代品受到了广泛的关注。聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类微生物在体内积累碳源形成的胞内聚合物。PHA具有良好的物理特性、生物相容性和生物可降解性，被认为是未来替代化工塑料的重要物质。目前，工业生产PHA多以纯菌发酵，其高昂的成本限制了其广泛应用。底物成本、细胞内PHA含量以及PHA提取方法是影响生物生产PHA成本的最主要因素。为此，可以通过使用廉价发酵底物、提高细胞内PHA含量、减少或者取消灭菌程序、简化提取PHA程序等方式降低PHA的生产成本。嗜盐微生物是生长在高盐环境中的一类特殊微生物，具有特殊的细胞结构、生理机能、遗传基因和适应机制。研宄已经发现了很多嗜盐菌具有高的PHA积累能力。高盐环境阻止了其他非嗜盐微生物的生长，菌种保持不需要灭菌程序，可以以开放的方式进行PHA生产；此外，由于嗜盐微生物细胞内部具有高渗透压，一旦进入淡水低渗环境就会迅速导致细胞壁的破裂，实现快速的PHA释放。不使用药剂破壁回收PHA降低了 PHA成本；最后，嗜盐微生物可以利用多种废弃有机物发酵生产PHA，降低PHA生产的底物成本。综上可以看出，嗜盐菌生产PHA在成本上具有较大的优势。
[0003]目前，生物生产PHA普遍采用两步法。即第一步实现对PHA积累菌群的选择富集，第二步利用这些微生物发酵底物生产PHA。在两步法工艺中，第一步富集高聚PHA能力的菌群是最关键一步。这一步将直接影响后续发酵生产PHA的产量以及能否使用廉价废弃物作为底物生产PHA。目前对PHA积累微生物的选择富集通用的方式是以乙酸作为底物采用动态生产(ADF)的方式选择种群。但是，以这种方式筛选的种群在第二步发酵时只能使用乙酸作为底物生产PHA，无法使用其他底物。乙酸是一种价格昂贵的底物。如果以乙酸为底物生产PHA，PHA生产成本中乙酸的成本就贡献了 40%。为此，在两步法生产PHA的工艺中，在第一步建立一种PHA积累菌群的选择方法，实现在第二步利用低成本底物甚至废弃物发酵PHA是非常重要的。这样的方法可以大大降低PHA的生产成本。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种以葡萄糖为底物以天然入海口底泥为接种物选择富集积累PHA嗜盐混合菌的方法。该方法最大可能地提高了 PHA产量，降低了 PHA生产成本。
[0005]以葡萄糖为底物筛选嗜盐PHA积累混合菌的方法，主要包括以下步骤:
[0006]步骤I，采集入海口底泥接种到公知的SBR反应器中，接种的污泥混合液占SBR总体积的1/4-1/5 ；
[0007]步骤2，向反应器中注满底物溶液:该底物每升水溶液中含:0.5-2.0g葡萄糖，微生物生长必需的其他元素，如底物每升水溶液中采用以下物质提供微生物生长必须的其他元素:0.1 Ig NH4Cl, 30.0g NaCl，45.0mg MgCl2.6H20，113.3mg NH4Cl, 26.0mg KH2PO4, 7.6mgKCl，3.0mg FeSO4.7Η20，1.5mg ZnSO4.7Η20，8.0mg CaCl2.2Η20，1.2mg MnSO4.H2O ；
[0008]步骤3，采用间歇方式运行SBR反应器，启动SBR反应器的搅拌转置和曝气装置，搅拌速率为60-120r/min，向反应器中匀速注入空气，控制底物溶液中溶解氧在2_4mg/L，连续运行10-12h，pH范围为6.5-7.5，运行过程中不调节pH，反应器以控温设备控制温度在30±0.10C ；
[0009]步骤4，关闭搅拌装置和曝气装置，静置10min-60min ；
[0010]步骤5，排除SBR反应器中的上清液，保留活性污泥；
[0011]步骤6，排除SBR反应器中的污泥的1/10 ；
[0012]步骤7，步骤2-步骤6为一周期，重复步骤2-步骤6，直到周期内微生物细胞内PHA最大质量百分含量达到20%以上且连续5-10周期保持稳定，完成筛选。
[0013]本发明基于的硬件系统为公知的SBR反应器。所述的天然接种物是入海口底泥，将其直接接种到反应器中。
[0014]本发明具有以下优点:
[0015](I)该方法采用葡萄糖为底物驯化菌群，葡萄糖廉价易得，可以降低菌群选择时的底物成本；
[0016](2)筛选嗜盐混合微生物在进行第二步发酵生产中其细胞内PHA的含量和产率都较高；
[0017](3)筛选的嗜盐混合微生物在进行第二步发酵生产中可以以廉价的葡萄糖为底物生产的PHA为PHBV共聚物，该共聚物增加其下游的商业利用价值；
[0018](4)筛选嗜盐混合微生物在进行第二步发酵生产中可以使用乙酸、葡萄糖甚至是淀粉、纤维素等大分子有机物作为发酵底物，实现对一些低价底物的利用；
[0019](5)该方法筛选嗜盐混合微生物在进行两步法PHA生产中不需要灭菌，可以进行开放式生产。
【附图说明】
[0020]图1:以葡萄糖为底物筛选嗜盐PHA积累混合菌的方法图框。
【具体实施方式】
[0021]以下结合【附图说明】和【具体实施方式】对本发明作进一步的详细说明，但本发明并不限于以下实施例。
[0022]实施例1
[0023]以有效容积为2L的SBR反应器，利用本发明方法进行嗜盐PHA积累菌的筛选，【具体实施方式】:
[0024]步骤1，在河北省秦皇岛市汤河河口采集河口底泥，采样地点位于渤海600米处。经过去除沙粒后得到0.4L底泥，接种到SBR反应器内。向SBR反应器里注入底物水溶液至2L，此时接种物浓度为0.102g/L ；
[0025]步骤2，向反应器中注满以葡萄糖为主的底物溶液，该底物溶液的配比包括:每升底物水溶液含:0.87g 葡萄糖，0.1lg NH4Cl, 30.0g NaCl, 45.0mg MgCl2.6H20，113.3mgNH4Cl, 26.0mg KH2PO4, 7.6mg KCl，3.0mg FeSO4.7Η20，1.5mg ZnSO4.7Η20，8.0mg CaCl2.2Η20，
1.2mg MnSO4.Η20，余量为水；
[0026]步骤3，采用间歇方式运行反应器，启动反应器的搅拌转置和曝气装置，搅拌速率为100r/min，向反应器中勾速注入空气，控制底物溶液中溶解氧在3mg/L，连续运行12h，pH为6.8，运行过程中不调节pH，反应器以控温设备控制温度在30±0.10C ;
[0027]步骤4，关闭搅拌装置和曝气装置，静置30min ;
[0028]步骤5，排除反应器中的上清液，保留活性污泥；
[0029]步骤6，排除SBR反应器中的污泥的1/10 ；
[0030]步骤7，步骤2-步骤6为一周期，重复步骤2-步骤6。100个周期后周期内微生物细胞内PHA最大质量百分含量达到20%且连续10周期保持稳定，完成筛选。
[0031]本实施例中底物中使用的所有化学试剂均为化学纯级。
[0032]按照上述步骤筛选的嗜盐混合菌分别以1500mg/LC0D的乙酸、葡萄糖、淀粉为底物进行发酵生产PHA，获