一种用于筛选抗骨质疏松药物的细胞共培养模型及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞体外培养技术领域，具体涉及一种骨髓间充质干细胞/破骨前体细胞/卵泡颗粒细胞共培养模型进行抗骨质疏松药物筛选的模型及其应用
【背景技术】
[0002]随着社会老龄化的进程，骨质疏松的发病率呈上升趋势，目前全球有2亿骨质疏松患者，并且女性多于男性。中国老年人居于世界首位，现有骨质疏松患者9000万，占总人口的7.1%。预计到2050年，全球骨质疏松患者将增加到2.21亿，那时全世界一半以上的骨质疏松性骨折将发生在亚洲，绝大部分在中国。日趋严峻的骨质疏松发病情况提示，临床现用的抗骨质疏松药物效果并不理想，因此开发新的抗骨质疏松药物的任务迫在眉睫。
[0003]近年来研究资料表明，骨重建失衡是骨质疏松的关键致病因素。当破骨细胞介导的骨吸收超过成骨细胞介导的骨形成，致使骨量减少、骨多孔、脆性增加，导致骨质疏松。国内外大量研究结果表明成骨细胞和破骨细胞通过相互耦联促进彼此功能。破骨细胞表面表达RANK，与成骨细胞表达的RANKL结合，促进破骨细胞分化，激活骨吸收功能。除了细胞间受体和配体的直接相互作用外，一些分泌型的调控因子也间接调控彼此活性。如破骨细胞的两个分泌蛋白BMP6和WntlOb增加，促进了成骨细胞成熟。在去势大鼠模型上证明雌激素缺乏，导致成骨和破骨细胞表达的雌激素受体α、β比例发生改变。成骨和破骨细胞的相互作用并非成熟阶段开始，对于它们来源的前体骨髓细胞，这种相互调控机理既已发生。破骨细胞自身能够表达磷酸鞘胺醇(SlP)和ΒΜΡ6，刺激成骨细胞前体一骨髓间充质干细胞MSC Wnt/BMP信号途径，促使MSC募集，定向成骨细胞分化，促进骨形成。考虑到维持骨重建的稳定并非由成骨或破骨细胞各自独立完成，而是由骨组织调节成骨和破骨细胞功效的前体细胞共同参与，卵巢组织的卵泡颗粒细胞释放雌激素的间接调控作用亦日益受到人们的关注。
[0004]目前,抗骨质疏松药物主要有骨吸收抑制剂,包括双磷酸盐、雌激素、雌激素受体调节剂等，骨形成制剂，包括甲状腺旁激素。但是，由于成骨和破骨细胞的耦联作用，单独抑制骨吸收或骨形成均会引起副作用。长期服用双磷酸盐会进一步导致骨丧失。长期服用甲状腺旁激素会增加骨癌的危险性。因此开发既能抑制骨吸收又能增强骨形成的多靶点药物备受关注，但是一直没有取得突破。
[0005]已有文献报道中抗骨质疏松药物体外评价模型主要以单细胞为主，如鼠成骨细胞增殖分化模型、RANKL诱导的破骨细胞分化模型、骨髓间充质干细胞模型等。以及以酶学研究为基础的模型，如组织蛋白酶K(cath印sin K)等。上述体外模型并不能较为全面的模拟体内骨重建耦联情况，作为药物筛选的评价手段有所缺陷。而调节骨重建药物的体内动物模型评价方法主要采用:如灌服糖皮质激素、灌胃维甲酸诱导法或双侧卵巢切除法诱导骨质疏松模型等，动物模型虽然能够更为贴切的模拟骨重建异常的情况，但是周期长、花费大，不适合药物的前期发现阶段的快速评估研究，本领域急需建立新的筛选方式。
【发明内容】
[0006]发明目的本发明提供一种能够快速筛选抗骨质疏松药物的细胞模型。
[0007]技术方案
[0008]一种抗骨质疏松药物筛选的骨髓间充质干细胞/破骨前体细胞/卵泡颗粒细胞共培养模型，其特征在于包括骨髓间充质干细胞和破骨前体细胞直接接触共培养，卵泡颗粒细胞非接触式共培养，按如下步骤制得:
[0009]A、取骨髓间充质干细胞，在300 μ L培养容器中，培养容器中部横向设有直径为
0.4-3微米的带孔半透膜，分为上下两层培养室，下室中加入80-120 μ L的含体积浓度10?20%胎牛血清的a-MEM培养液，细胞密度为0.1?I X 15个/ml的骨髓间充质干细胞，待其贴壁后换为含10?100nM地塞米松、I?1mM β -甘油磷酸钠、5?50 μ M磷酸维生素c及含体积浓度20%胎牛血清的a -MEM培养液进行培养；再培养7?8d后，弃上清，加入破骨前体细胞RAW264.7培养液，培养液加入量80-120 μ L，细胞密度为0.1?I X 15个/ml，待其贴壁后换为含10?100nM地塞米松、I?1mMβ-甘油磷酸钠、5?50 μ M磷酸维生素C、20?100ng/ml RANKL及含体积浓度10?20%胎牛血清的a -MEM培养液进行培养；继续培养2?4d后，再将细胞密度为0.1?I X 15个/ml的50-120 μ L的卵泡颗粒细胞培养液加入上层培养室，将培养容器中所有的培养液换为无血清的a -MEM培养液，置35?37°C，于通入有体积分数为5%的CO2空气的培养箱内培养I?2d。
[0010]一种权利要求1所述的细胞共培养模型在进行抗骨质疏松药物筛选中的应用，
[0011 ] 在骨髓间充质干细胞/破骨前体细胞/卵泡颗粒细胞共培养模型的共培养细胞的培养液内，在骨髓间充质干细胞贴壁后给予0.01?200μ g/ml的待筛选药物，以未加药组作为空白对照组；
[0012]在培养箱中35?37°C，通入有体积分数为5%的CO2空气进行静置培养12?14d后，收集40?100 μ L上清液和上层培养室的卵泡颗粒细胞裂解液10?20 μ L，检测50?120 μ L溶液的雌二醇的含量；
[0013]下层培养室的骨髓间充质干细胞和破骨细胞前体用柠檬酸-丙酮溶液固定，染色法检测碱性磷酸酶ALP表达阳性细胞数；细胞再次洗涤后，以ρΝΡΡ作为底物检测抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP活力；
[0014]与未加药组相比，第一种情况:增加ALP值、同时减少或不影响TRAP值、升高或不影响雌二醇值；第二种情况:减少TRAP值，同时增加或不影响ALP值、升高或不影响雌二醇值；以上两种情况可认定具有调节骨重建活性，可作为骨质疏松的候选药物。否则不能作为骨质疏松的候选药物；此模型可应用于中药提取物或任一化合物的筛选。
[0015]待筛选药物于培养液内中的浓度在0.001?200 μ g/ml范围内取4_10个以上的不同剂量值分别进行细胞共培养模型的药物筛选，且每个剂量值取2个以上的细胞共培养模型做为重复的平行实验组。
[0016]按照权利要求2所述的应用，其特征在于:检测指标的含量范围为雌二醇50-120pg/ml,下层培养室底面积为0.32cm2的培养容器中ALP阳性细胞数为1_40个/培养容器，培养容器底面积为0.32cm2的培养容器中405nm波长下TRAP吸光度值为0.1-2.0。
[0017]有益效果
[0018]1、本发明提供的骨髓间充质干细胞/破骨前体细胞/卵泡颗粒细胞共培养体系，是在上下两层培养系统中，骨髓间充质干细胞和破骨前体细胞培养在下层培养室的底面上，卵泡颗粒细胞培养在上层培养室的半透膜上:该培养体系是在体外条件下模拟卵巢组织对骨重建的调控作用，并以药物对雌二醇、碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶的影响，应用于抗骨质疏松药物的快速筛选。
[0019]本发明提供的骨髓间充质干细胞/破骨前体细胞/卵泡颗粒细胞共培养体系作为筛选模型，与整体动物模型相比，具有快速培养的优点；与单种细胞模型相比，在保持了快速培养的基础上，不但同时提供了多个调节骨重建的相关靶点用于筛选药物，又较为真实地模拟了体内骨重建及其卵巢组织对骨组织的调控作用，有效避免了漏筛某些通过卵巢组织间接调控骨重建的药物。
[0020]2、通过采用临床抗骨质疏松一线药物阿伦磷酸钠和甲状腺旁激素PTHh4和已知活性化合物淫羊藿苷对该模型进行测试，我们认定药物作用效果与体内作用效果更为接近。共培养体系中，与未加药组相比，增加ALP值、同时又能减少TRAP值、升高或不影响雌二醇值可认定具有调节骨重建作用。
【附图说明】
[0021]图1为上下两层培养室中共培养的示意图，其中I为两层培养室的上层，2为两层培养室的下层；
[0022]图2原代培养的小鼠骨髓间充质干细胞和大鼠卵泡颗