264.7，待其贴壁后加入(0、0.1、1.25,2.5、5、10μ g/ml)，继续培养至14d。骨形成药物PTiV34在第2d埋入骨髓间充质干细胞待其贴壁后，加入(0、2.5、25、50、100、200叩/1111)，刺激4(1后，撤除药物4d，再重新加入PTH1-34继续培养至14d。中药单体淫羊藿苷在第2d埋入骨髓间充质干细胞待其贴壁后，加入(0、0.25,2.5、5、10、20μ g/ml)，继续培养至14d。
[0050]指标测定方案:培养14d后，收集80 μ L上清液和上层培养室的卵泡颗粒细胞裂解液20 μ L，采用ELISA试剂盒按说明书方法测定雌二醇的含量；下层培养室的骨髓间充质干细胞和破骨细胞前体用柠檬酸-丙酮溶液(40ml30mM柠檬酸溶液与60ml丙酮混合，PH3.0)固定30s，用ALP染色试剂盒染色检测碱性磷酸酶ALP表达阳性细胞数；细胞经去离子水洗涤3次后，以ρΝΡΡ作为底物100 μ L，包含1mM pNPP、1mM酒石酸钠、50mM柠檬酸缓冲液(PH4.6)，在37°C反应Ih。吸取上清至另一板，加入100 μ LlN氢氧化钠，405nm测定吸光度。即为检测抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP活力。
[0051]同时，将骨髓间充质干细胞、破骨前体细胞RAW264.7、卵泡颗粒细胞平行作单培养，刺激条件和加药方案与共培养相同，分别测定骨髓间充质干细胞ALP表达阳性细胞数；破骨前体细胞RAW264.7抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP活力；卵泡颗粒细胞雌二醇的含量。将此单细胞筛选结果与共培养模型筛选结果相互比较。
[0052]结果显示:阳性对照药阿伦磷酸钠无论在单培养模型或共培养模型上均抑制了TRAP活力，但与单培养模型相比，在共培养模型上对ALP的抑制作用更强(见图7)。骨形成药物PTH增加了 ALP活力，但与单培养模型相比，在共培养模型上也明显刺激了 TRAP活力升高(见图8 )。与之相比，淫羊藿苷不仅抑制了 TRAP活力，在共培养模型上，明显升高了 ALP活力，并刺激了雌二醇的产生(见图9)。阳性药阿伦磷酸钠和PTH对雌二醇含量无影响。
[0053]阿伦磷酸钠为临床一线抗骨质疏松药物，其为法尼基焦磷酸合酶抑制剂，可抑制破骨细胞的骨吸收功能，为骨吸收抑制剂。文献资料表明，虽然阿伦磷酸钠其能够抑制骨吸收，但长期使用，也能够降低骨形成作用。PTHh4在美国用于治疗低骨密度病人。PTH能够影响多种骨细胞功能，包括成骨细胞、破骨细胞、骨细胞等。动物实验的资料表明，长期应用PTH能够增加骨癌发生的危险性。持续升高病人的PTH水平，会导致骨分解，造成骨丢失。
[0054]淫羊藿苷为中药淫羊藿的活性成分。淫羊藿是用于防治骨质疏松的主要中药之一。淫羊藿苷被认为是植物雌激素。文献资料表明，淫羊藿苷可增加成骨细胞增殖、分化活性；抑制破骨细胞分化活性。
[0055]体外共培养细胞模型实验表明:阿伦磷酸钠无论在单培养模型或共培养模型上均抑制了 TRAP活力，但与单培养模型相比，在共培养模型上对ALP的抑制作用更强。PTH增加了 ALP活力，但与单培养模型相比，在共培养模型上也明显刺激了 TRAP活力升高。提示在共培养模型上，能反映出阿伦磷酸钠和PTH的副作用，与体内作用接近。淫羊藿苷不仅抑制了 TRAP活力，在共培养模型上，明显升高了 ALP活力，并刺激了雌二醇的产生，提示淫羊藿苷具有多靶点效果，在共培养模型上更有利于多靶点药物的筛选。
[0056]上述实验结果表明，建立骨髓间充质干细胞/破骨前体细胞/卵泡颗粒细胞共培养模型可以较为真实的模拟了体内骨组织骨重建过程，采用该共培养模型筛选抗骨质疏松的药物，不但可以同时快速筛选涉及多个细胞的靶点，还有效避免了漏筛某些通过卵巢组织间接调控骨组织的药物。
【主权项】
1.一种用于筛选抗骨质疏松药物的细胞共培养模型，其特征在于:其包括骨髓间充质干细胞和破骨前体细胞直接接触培养，卵泡颗粒细胞非直接接触培养，按如下步骤制得: 于300 μ L培养容器中，培养容器中部横向设有带孔的半透膜，将培养容器分隔成上下两层培养室，半透膜上孔的直径为0.4-3微米； 取骨髓间充质干细胞于容积80-150 μ L下层培养室培养，于下室中加入80-120 μ L的含体积浓度10?20%胎牛血清的a -MEM培养液，细胞密度为0.1?I X 15个/ml的骨髓间充质干细胞，待其贴壁后换为含10?100nM地塞米松、I?1mM β-甘油磷酸钠、5?50 μ M磷酸维生素c及含体积浓度20%胎牛血清的a -MEM培养液进行培养；再培养7?8d后，弃上清，加入破骨前体细胞RAW264.7培养液，培养液加入量50-120 μ L，细胞密度为0.1?I X 15个/ml，待其贴壁后换为含10?100nM地塞米松、I?1mM β -甘油磷酸钠、5?50 μ M磷酸维生素C、20?100ng/ml RANKL及含体积浓度10?20%胎牛血清的a -MEM培养液进行培养；继续培养2?4d后，再将细胞密度为0.1?I X 15个/ml的100-120 μ L的卵泡颗粒细胞培养液加入上层培养室，将培养容器中所有的培养液换为无血清的a -MEM培养液，置35?37°C，于通入有体积分数为5%的CO2空气的培养箱内培养I?2d。
2.—种权利要求1所述的细胞共培养模型在进行抗骨质疏松药物筛选中的应用，其特征在于: 在骨髓间充质干细胞/破骨前体细胞/卵泡颗粒细胞共培养模型的共培养细胞的培养液内，在骨髓间充质干细胞贴壁后给予0.001?200μ g/ml的待筛选药物，以未加药组作为空白对照组； 在培养箱中35?37°C，通入有体积分数为5%的CO2空气进行静置培养12?14d后，收集40?100 μ L上清液和上层培养室的卵泡颗粒细胞裂解液10?20 μ L，检测50?120 μ L溶液的雌二醇的含量； 下层培养室的骨髓间充质干细胞和破骨细胞前体用柠檬酸-丙酮溶液固定，染色法检测碱性磷酸酶ALP表达阳性细胞数；细胞再次洗涤后，以ρΝΡΡ作为底物检测抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP活力； 与未加药组相比，第一种情况:增加ALP值、同时减少或不影响TRAP值、升高或不影响雌二醇值；第二种情况:减少TRAP值，同时增加或不影响ALP值、升高或不影响雌二醇值；以上两种情况可认定具有调节骨重建活性，可作为骨质疏松的候选药物。否则不能作为骨质疏松的候选药物；此模型可应用于中药提取物或任一化合物的筛选。
3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于: 待筛选药物于培养液内中的浓度在0.01?200 μ g/ml范围内取4-10个以上的不同剂量值分别进行细胞共培养模型的药物筛选，且每个剂量值取2个以上的细胞共培养模型做为重复的平行实验组。
4.按照权利要求2所述的应用，其特征在于:检测指标的含量范围为雌二醇50-120pg/ml,下层培养室底面积为0.32cm2的培养容器中ALP阳性细胞数为1_40个/培养容器，培养容器底面积为0.32cm2的培养容器中405nm波长下TRAP吸光度值为0.1-2.0。
【专利摘要】本发明属于细胞体外培养技术领域，建立了骨髓间充质干细胞/破骨前体细胞/卵泡颗粒细胞共培养模型，应用于抗骨质疏松药物的快速筛选。本发明提供的共培养体系，是在上下两层培养系统中，骨髓间充质干细胞和破骨前体细胞在下层培养室直接接触培养，卵泡颗粒细胞贴壁培养在上层培养室的半透膜上：该培养体系是在体外条件下模拟骨组织的骨重建过程；并以药物对碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶和雌激素释放的影响，应用于抗骨质疏松药物的快速筛选。
【IPC分类】C12Q1-02, C12N5-0775, C12N5-071
【公开号】CN104694468
【申请号】CN201310684073
【发明人】肖红斌, 刘艳秋, 程孟春
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2013年12月10日