人或哺乳动物正常上皮细胞的培养基、培养方法、正常上皮细胞及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞生物学和毒理学领域，具体涉及人或哺乳动物正常上皮细胞的培养基、原代分尚培养、传代培养、气-液3D培养及基质胶3D培养方法，以及上述培养基、培养方法所生成的正常上皮细胞及其在毒理学评价系统中的应用。
【背景技术】
[0002]环境污染已经严重危害人们的身体健康，由此引发的呼吸系统疾病也不断出现。人的上皮细胞首当其冲成为主要的损害靶点。器官特异性分化的上皮细胞行使着重要的功能，如肺的气体交换、肾脏的滤过作用、肝脏的解毒和结合作用、胰岛细胞分泌胰岛素作用以及皮肤抵抗有害环境的作用。因此，基于上皮细胞的体外模型已经用来探宄毒性物质职业暴露机制。在这些研宄中用到了肺癌细胞系A549、结肠癌细胞系HT-29和染色体变异的细胞株，导致这些研宄得到的结果相互间产生明显差异而引起争议。为了避免应用癌细胞带来的不利影响，学者们建立了各种细胞永生化的方法，他们试着在体外通过病毒或癌基因转导的方式建立了所谓“正常”的细胞系。然而，基因操作改变了细胞的遗传背景和真实的生理状态，不能反映正常上皮细胞的真实功能，因此得到的实验数据可靠性大大降低。
[0003]人体器官特异性分化的上皮细胞很难在体外进行培养。从组织样品中直接分离获得的上皮细胞产量和细胞纯度很低，这些原代和传代上皮细胞的增殖速度也极为有限，经过有限次的细胞传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡，这就限制细胞培养技术的进一步应用。如何获得来源于人体重要器官的正常细胞，是国内外基础与临床医学研宄迫切需要解决的难题。虽然目前建立了很多细胞永生化方法，但大部分都是通过病毒导入、基因转染的方式将外源性病毒、原癌基因导入目的细胞，其基因组合是随机的，其表达产物可干扰细胞内生理途径，细胞发生非预期的改变，和正常细胞相比，其生物学性状如细胞核型、血清依赖型等可能发生改变，有的甚至表现出了肿瘤细胞的特性，建立的永生化细胞不能保持其原有的正常表型。然而迄今为止，在毒理学中还无法建立一种无基因导入永生化的正常细胞株作为研宄模型。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于为克服现有技术的缺陷，而提供一种人或哺乳动物正常上皮细胞的培养基、原代分离培养、传代培养、气-液3D培养及基质胶3D培养方法，以及上述培养基、培养方法所生成的正常上皮细胞及其在毒理学评价系统中的应用。
[0005]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:一种用于培养人或哺乳动物的正常上皮细胞的培养基，所述培养基成分包括:DMEM与Ham’ s F-12NUTRIENT MIX按体积比3:1混合的培养基，同时添加4-6 %胎牛血清、l_3nM tri1dothyronine, 0.4-0.65 %insulin-transferrin-selenium试剂、4-6 μ g/ml transferrin、9_llng/mL表皮生长因子、0.3-0.5 μ g/mL 氢化可的松、0.5-1.5nM霍乱毒素、0.4-0.6 μ g/mL 两性霉素 Β、35_45 μ g/mL庆大霉素、45_55nM calpeptin、35_45ng/ml 重组人 IL-1RA 及 3ug/ml 重组人 R-Spondin-l。
[0006]一种人或哺乳动物的正常上皮细胞的原代分离培养方法，包括如下步骤:
[0007]S1、收集临床患者手术切除的正常细胞组织样品；或收集哺乳动物的正常细胞组织样品；
[0008]S2、配制消化液:所述消化液为含胶原酶/透明质酸酶混合液的权利要求1所述培养基;
[0009]S3、依次用乙醇和PBS缓冲液清洗分离的正常细胞组织样品，然后将正常细胞组织样品放入含预冷PBS缓冲液的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖工具去除正常细胞组织样品中残留的脂肪；
[0010]S4、将正常细胞组织样品放入含步骤S2所配制消化液的离心管中消化；
[0011]S5、将消化后的正常细胞组织样品低速离心去除上清；
[0012]S6、将步骤S5处理后的正常细胞组织样品沉淀重悬于胰酶/EDTA中消化；
[0013]S7、然后再行加入含FBS的DMEM培养基，低速离心去除上清；
[0014]S8、加入分散酶和DNase I，用无菌的一次性塑料枪头反复吹打正常细胞组织样品;
[0015]S9、再行加入含FBS的DMEM，用过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速离心，去除上清；
[0016]S10、重悬步骤S9中的细胞沉淀于权利要求1所述的培养基中，接种于培养瓶培养。
[0017]具体的，人或哺乳动物的正常上皮细胞的原代分离培养方法
[0018]步骤S2中所述胶原酶/透明质酸酶是终浓度为IX的混合液；
[0019]步骤S3中先用95-100%的乙醇洗分离的新鲜组织I次，再用PBS缓冲液清洗2次；
[0020]步骤S4中在离心管中消化的条件为37°C，时长1-3小时；
[0021]步骤S5中低速离心条件为低速为lOOOprm，时长为5分钟；
[0022]步骤S6中胰酶/EDTA为2_5ml，浓度为0.25%，置于冰上I小时或室温10分钟条件下重悬；
[0023]步骤S7的低速离心条件为低速为lOOOprm，时长为5分钟；
[0024]步骤S8中分散酶为2ml温浴的5mg/ml分散酶，DNase I为200 μ L的lmg/mL DNaseI，吹打时长为I分钟；
[0025]步骤S9中所述DMEM为加入1ml含10% FBS的DMEM，低速离心条件为低速为lOOOprm,时长为5分钟；
[0026]步骤SlO中培养条件为37°C，5% CO2.
[0027]一种人或哺乳动物的正常上皮细胞的传代培养方法，包括如下步骤:
[0028]S1、当人或哺乳动物的正常上皮细胞增殖至70 - 90%丰度时，用IxPBS缓冲液洗涤细胞，再用胰酶/EDTA消化单层细胞；
[0029]S2、再用DMEM培养基中和消化反应；
[0030]S3、低速离心去除上清；
[0031]S4、以一定比例重悬细胞沉淀于权利要求1所述培养基中接种培养。
[0032]具体的，人或哺乳动物的正常上皮细胞的传代培养方法
[0033]步骤S3处理后的细胞沉淀重悬于的细胞冻存液中，储存于液氮中备用。
[0034]具体的，人或哺乳动物的正常上皮细胞的传代培养方法
[0035]步骤S2中用IxPBS缓冲液洗涤细胞两次，所述胰酶/EDTA浓度0.05%，消化时长2-5分钟；
[0036]步骤S3中，低速离心条件为低速为lOOOprm，时长为5分钟；
[0037]步骤S4中，所选比例为1: 2，1: 3，1:4或1: 5，只要维持细胞贴壁和正常生长即可。
[0038]一种人或哺乳动物的正常上皮细胞的气-液3D培养方法，包括如下步骤:
[0039]步骤S1、将插入式细胞培养皿内置物放入培养皿；
[0040]步骤S2、用权利要求1所述培养基重悬2xl05正常上皮细胞，然后接种到插入式细胞培养皿内置物中；
[0041]步骤S3、培养皿中加入合适的生长培养基；
[0042]步骤S4、将放有内置物的培养皿放入湿热培养箱中培养；
[0043]步骤S5、将内置物内部及外围培养皿中的培养基更换为分化培养基；
[0044]步骤S6、将步骤S5中放有内置物的培养皿放入湿热培养箱中使细胞之间形成紧密连接；
[0045]步骤S7、移除内置物内部及外围所有的培养基，外围培养皿中加入分化培养基，开始3D分化培养；
[0046]步骤S8、在湿热培养箱中培养细胞14至21天，每2_3天更换内置物外围的培养基。
[0047]具体的，人或哺乳动物的正常上皮细胞的气-液3D培养方法
[0048]步骤S4中培养条件为37°C,5% CO2,培养时长为48小时；
[0049]步骤S6中培养时长为15-17小时；
[0050]步骤S8中培养条件为37°C，5% CO2.
[0051]一种人或哺乳动物的正常上皮细胞的基质胶3D培养方法，包括如下步骤:
[0052]步骤S1、将基质胶低温放置自然融化；
[0053]步骤S2、在预冷的孔板表面铺一薄层基质胶，将基质胶加入表面并用枪头均匀涂抹；
[0054]步骤S3、将孔板放置使基质胶凝固；
[0055]步骤S4、消化正常上皮细胞至单个并离心；
[0056]步骤S5、将正常上皮细胞重悬至基质胶中；
[0057]步骤S6、用枪头将基质胶与正常上皮细胞混匀，将混合物加入到预先铺有基质胶的孔板中，将孔板放置使基质胶凝固再加入权利要求1所述培养基加入F培养基；
[0058]步骤S7、将所述孔板放于湿热培养箱恒温培养。
[0059]具体的，人或哺乳动物的正常上皮细胞的基质胶3D培养方法
[0060]步骤SI中低温放置自然融化为在4°C条件下过夜融化；
[0061]步骤S3中放置条件为37 °C，时长为15-30分钟；
[0062]步骤S6中，基质胶放置凝固条件为37 0C，时长为30分钟；
[0063]步骤S7中培养条件为:37°C ,5% CO2,恒温培养10天，每两天更换I次培养基。
[0064]上述人或哺乳动物的正常上皮细胞的培养基、原代、传代、气-液3D或基质胶3D培养方法所培养的人或哺乳动物的正常上皮细胞，
[0065]所述正常上皮细胞分离培养自人或哺乳动物的不同类型的正常组织，所述正常上皮细胞未导入任何外源基因，为正常二倍体细胞，具有正常分化的生理功能。
[0066]进一步，人或哺乳动物的不同组织来源的正常上皮细胞，在环境毒物的毒性检测和建立毒理学评价系统中的应用。
[0067]本发明与现有技术相比的有益效果是:
[0068]1.本发明提供的一种培养基，可用于分离培养、传代培养人或哺乳动物多种组织来源的正常上皮细胞。
[0069]2.本发明提供的一种正常上皮细胞分离培养、传代培养方法，可以体外快速增殖人或哺乳动物的正常上皮细胞并建立细胞系。
[0070]3.本发明提供的人和哺乳动物的正常