粒细胞的形态学观察图，其中A为小鼠骨髓间充质干细胞，B为大鼠卵泡颗粒细胞。
[0023]图3鉴定骨髓间充质干细胞成骨分化功能和破骨前体RAW264.7细胞的破骨分化功能，其中A为骨髓间充质干细胞成骨分化功能，B为RAW264.7细胞的破骨分化功能。
[0024]图4为细胞共培养与单培养比较碱性磷酸酶表达的变化。
[0025]图5为细胞共培养与单培养比较抗酒石酸酸性磷酸酶活力的变化。
[0026]图6为细胞共培养与单培养比较雌二醇含量的变化。
[0027]图7为阿伦磷酸钠在共培养与单培养模型上对碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶和雌二醇含量的影响。
[0028]图8为甲状腺旁激素PTH在共培养与单培养模型上对碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶和雌二醇含量的影响。
[0029]图9为淫羊藿苷在共培养与单培养模型上对碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶和雌二醇含量的影响。
【具体实施方式】
[0030]实施例1:
[0031]材料:
[0032]实验动物:BALB/c小鼠，体重25_30g，雌雄各半。SD大鼠，体重60_80g，雌性，均购于大连医科大学实验动物中心。
[0033]实验试剂:Transwell双层培养室购于Corning公司，雌二醇测定试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司；TRAP和ALP染色试剂盒购于sigma公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；a-MEM培养基和M199培养基购于Gibco公司。RANKL，磷酸维生素c购于sigma公司；骨髓间充质干细胞分离液购于天津灏洋生物公司；PTH购于Prospec-TanyTechnogene, Israel。阿伦磷酸钠购于中国药检所。20%胎牛血清的a-MEM培养基的配方:每10mL a -MEM培养基中加入20mL胎牛血清。
[0034]方法:
[0035]1、骨髓间充质干细胞/破骨前体细胞/卵泡颗粒细胞共培养模型的建立
[0036]1.1BALB/c小鼠原代骨髓间充质干细胞的分离和SD大鼠卵泡颗粒细胞的分离
[0037]脱颈椎处死BALB/c小鼠(25_30g)，于75%乙醇中浸泡消毒15min后，无菌条件下取股骨、肱骨、胫骨，剥离骨周围肌肉组织，用PBS冲洗后，剪去包括骺板在内的两侧骺端，用ImL注射器抽取适量a-MEM培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养瓶。细胞悬液离心，1000rpm，5min后收集细胞进行密度梯度离心。将细胞重悬于2ml胎牛血清+2ml PBS，混匀，轻轻铺于4mL骨髓间充质干细胞分离液的液面，离心，离心参数为340g，20min, 20°C。吸出中间骨髓间充质干细胞层，PBS洗涤I次，1500rpm, 5min。洗涤后的细胞培养于含体积浓度20%胎牛血清的a -MEM培养基中，置37°C，通入体积分数5%C02空气培养箱内培养。小鼠骨髓间充质干细胞形态学观察如图2A所示。
[0038]SD大鼠^0_80g)皮下注射孕马血清促性腺激素100IU/只，36h后脱颈椎处死SD大鼠，于75%乙醇中浸泡消毒15min后，无菌条件下取两侧卵巢组织，剥离卵巢周围组织及表面包膜。用不锈钢针刺破卵巢表面成熟的卵泡，用200目尼龙网过滤，将颗粒细胞释放在M199培养基中。在37°C，通入5%C02空气培养箱内培养。大鼠卵泡颗粒细胞形态学观察如图2B所示。
[0039]取3代内生长良好的骨髓间充质干细胞，常规消化埋板于96孔板，用含体积浓度20%胎牛血清的a -MEM培养基培养24h后，加入成骨诱导剂OS，包含10nM地塞米松、ImM β -甘油磷酸钠、5 μ M磷酸维生素c及含体积浓度20%胎牛血清的a -MEM培养基进行培养，每4d进行一次换液，分化到14d的细胞，用ALP染色试剂盒按照说明书方法染色，鉴定骨髓间充质干细胞能够向成骨分化作用，观察结果如图3A所示。
[0040]取生长良好的破骨前体细胞RAW264.7，常规消化埋板于96孔板，孔板容积为300 μ L，用含体积浓度10%胎牛血清的DMEM培养基培养24h后，加入破骨诱导剂20ng/mlRANKL及含体积浓度20%胎牛血清的a -MEM培养基进行培养，每3d进行一次换液，分化到6d的细胞，用TRAP染色试剂盒按照说明书方法染色，鉴定破骨前体细胞能够向成熟破骨细胞分化功能，观察结果如图3B所示。
[0041]1.2骨髓间充质干细胞/破骨前体细胞/卵泡颗粒细胞共培养模型的建立
[0042]取前3代的小鼠骨髓间充质干细胞，用细胞刮刮下后，在transwell (中间半透膜的微孔直径为3 μ m)双层培养室的下室(下室容积为300 μ L)中加入100 μ L密度为IXlO5个/ml的骨髓间充质干细胞，待其贴壁后换为10nM地塞米松、ImM β-甘油磷酸钠、5μΜ磷酸维生素c及含体积浓度20%胎牛血清的a-MEM培养基进行培养。8d后，弃上清，加入破骨前体细胞RAW264.7100μ?，密度为I X 15个/ml，待其贴壁后换为10nM地塞米松、ΙπιΜβ-甘油磷酸钠、5μΜ磷酸维生素c，20ng/ml RANKL及含体积浓度20%胎牛血清的a -MEM培养基进行培养。继续培养4d后，再将50 μ L的卵泡颗粒细胞以I X 15个/ml的密度加入transwell上层小室(上室容积为75 μ L)，将所用的培养基换为无血清的a -MEM培养基，总体积为200 μ L，置37°C，通入体积分数为5%的CO2空气培养箱内培养。
[0043]指标测定方案:培养14d后，收集80 μ L上清液和上层培养室的卵泡颗粒细胞裂解液20 μ L，采用ELISA试剂盒按说明书方法测定雌二醇的含量；下层培养室的骨髓间充质干细胞和破骨前体细胞用柠檬酸-丙酮溶液(40ml30mM柠檬酸溶液与60ml丙酮混合，PH3.0)固定30s，用ALP染色试剂盒染色检测碱性磷酸酶ALP表达阳性细胞数；细胞经去离子水洗涤3次后，以ρΝΡΡ作为底物100 μ L，包含1mM pNPP、1mM酒石酸钠、50mM柠檬酸缓冲液(PH4.6)，在37° C反应lh。吸取上清至另一板，加入100 μ LlN氢氧化钠，405nm测定吸光度。即为检测抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP活力。
[0044]同时，将骨髓间充质干细胞、破骨前体细胞RAW264.7、卵泡颗粒细胞平行作单培养，刺激条件和加药方案与共培养相同，分别测定骨髓间充质干细胞ALP表达阳性细胞数；破骨前体细胞RAW264.7抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP活力；卵泡颗粒细胞雌二醇的含量。将此单细胞结果与共培养结果相互比较。
[0045]结果显示细胞共培养后，与单细胞培养相比，通过成骨诱导剂OS诱导的骨髓间充质干细胞ALP表达数目增加。加入RANKL诱导破骨细胞成熟后，骨髓间充质干细胞ALP表达数目进一步增加。(结果见图4)。虽然破骨前体RAW264.7细胞经RANKL诱导后TRAP活力升高，但共培养对TRAP活力影响不大(结果见图5)。卵泡颗粒细胞与骨髓间充质干细胞和RAW264.7细胞共培养后刺激了雌二醇的产生，当两细胞向成熟的成骨和破骨分化后，进一步刺激了雌二醇的产生，结果如图6所示。
[0046]文献资料表明，成骨细胞和破骨细胞前体细胞通过直接接触或通过分泌的因子可促进彼此的分化活性。共培养模型显示骨髓间充质干细胞和破骨前体RAW264.7细胞共培养促进了 ALP活力。Transwell培养卵泡颗粒细胞后，雌二醇含量提高，提示共培养促进了彼此活力，较为真实模拟了骨重建相关细胞的偶联作用以及骨细胞所处的雌激素微环境。
[0047]2、采用共培养模型对部分样品进行初步筛选
[0048]受试样品如下:阿伦磷酸钠、甲状腺旁激素PTiV34、淫羊藿苷，将上述样品以适量二甲基亚砜助溶(含量小于0.1%)，a-MEM培养基稀释成不同浓度溶液，得到样品溶液。
[0049]加药方案如下:抗骨吸收药物阿伦磷酸钠在第8d加入破骨前体细胞RAW