;步骤(e)所述的重悬免疫细胞是将步骤(c)获得的细胞沉淀按照2 X 105-2 X 109/ml的密度用冻存液充分混勾，优选2 XlOVml的密度； 步骤(e)所述的程序降温是将冻存容器放入程序降温装置(优选程序降温盒)中，放Λ 0-70C (优选4°C)冰箱中备用，转移至-100°C至-40°C (优选_80°C)的冰箱中储存20-36小时(优选24小时)，再将冻存容器从程序降温装置中取出； 步骤(g)所述补加培养基是补加X-VIVO无血清培养基至5-15ml (优选1ml)； 步骤(g)所述离心洗涤是设置水平离心机升速为9，降速为9，转速为1000-3000rpm，离心时间为5-20min，离心温度为15-30°C，优选转速为1500_2500rpm，优选转速为1800rpm，优选离心时间为lOmin，优选离心温度为20°C ； 步骤(i)所述细胞培养液为含有X-VIVO无血清培养基及10%的自体人血清； 步骤(i)所述重悬培养是将细胞密度为4 X 104-4 XlO8 (优选4 X 16)的免疫细胞置于体温条件下(优选37°C )，在2-10% (优选5% )的二氧化碳培养箱中孵育1-4小时(2小时)； 步骤(i)所述重悬未成熟树突状细胞(iDC)通过施加l_5ml的X-VIVO无血清培养基重悬，优选2-3ml ； 步骤⑴所述细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞计数为吸取20 μ I细胞，加入180 μ I台盼兰染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数和活率； 步骤(i)所述未成熟树突状细胞(iDC)细胞计数为单个核细胞总数减去细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)总数； 步骤(i)所述未成熟树突状细胞(iDC)的培养为第I天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液、粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF) 1000U/ml和白细胞介素4 (IL-4) 500U/ml ;第4天，半量换液；第5天，加入抗原负载；第6天，加入人肿瘤坏死因子a (TNF- a ) 1000U/ml过夜；第7天，DC第一次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；第9天，DC第二次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；第11天，DC第三次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；第13天，DC第四次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；和/或 步骤(i)所述细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的培养为第I天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液及细胞因子INF-γ 1000U/ml ;第2天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液及细胞因子CD3单抗375ng/ml、白细胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白细胞介素la (IL-1 a ) 500U/ml ;第4天，半量换液；第6天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液、白细胞介素2 (IL-2) 1000U/ml、白细胞介素la (IL-la)500U/ml ;第8天，补加一倍含有X-VIV0无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液、白细胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白细胞介素la (IL-la)500U/ml ;第 12 天，CIK 第一次收获，计数，测定 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD19+、⑶4/⑶8等细胞表面抗原的表达量；第14天，CIK第二次收获，计数，测定⑶3+、⑶3+⑶4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD19+、CD4/CD8 等细胞表面抗原的表达量。
6.根据权利要求1-5任一项的方法，该方法包括以下步骤: (a)全血样本预处理:将采集的成人外周血血样，转移至AXP处理袋中，加入羟乙基淀粉溶液放置在摇床上充分混匀，其中血样与羟乙基淀粉溶液的混合体积比为2?6:1，例如3?5:1，例如4:1，该羟乙基淀粉溶液是将羟乙基淀粉添加到0.9%氯化钠溶液中配制得到的； (b)自动分离:将AXP处理袋放入AXP全自动细胞分离设备后，进行自动分离； (c)单个核细胞收集:由AXP全自动细胞分离设备自动分离得到的免疫细胞自动收集于AXP全自动细胞分离设备内所附的冻存袋中； (d)单个核细胞计数:重悬所收集的单个核细胞，于细胞沉淀中加入20ml生理盐水，用1ml移液管反复吹吸细胞，充分混匀；细胞计数，吸取20 μ I细胞，加入180 μ I台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数与活率，记录结果。
7.根据权利要求6的方法，进一步包括以下对提取的免疫细胞进行冻存的步骤: (e)单个核细胞冻存:按照50%X-VIVO无血清培养基+40%人血白蛋白+10% DMSO的配方配制冻存液15ml，放置4°C冰箱中备用，将上述获得的细胞沉淀按照2X107/ml的密度用冻存液充分混匀重悬，将细胞转移至2ml冻存管中，用封口膜封口并贴上客户标签，将冻存管放入程序降温盒中，放入40C冰箱储存一个小时，转移至-800C冰箱储存过夜，次日，从程序降温盒中取出冻存管，转至液氮罐内进行储存，同时程序降温盒放入4°C冰箱以备下一次使用，冻存管在液氮罐中长期储存； (f)记录步骤(e)的冻存样本储存的位置，建立免疫细胞的数据库。
8.根据权利要求7的方法，进一步包括以下对冻存的免疫细胞进行复苏的步骤: (g)细胞复苏:从液氮罐中取出单个核细胞冻存管，迅速放入预先准备的37°C的水浴锅中，反复振荡8-10次，时间控制在2min以内，直至看到冻存管中只剩下一团冰晶后从水浴锅中取出冻存管，用蘸有75%酒精的无尘布将冻存管表面水滴擦拭后，迅速转移至生物安全柜中，用Iml移液枪将冻存管中复苏后的免疫细胞迅速吸出转移至一装有5ml X-VIVO无血清培养基的15ml离心管中重悬，并用枪头反复吹洗混匀3-5次，补加X-VIVO无血清培养基至10ml，离心洗涤，水平离心机升速为9，降速为9，转速为1800rpm，离心时间为lOmin，离心温度为20 °C ； (h)单个核细胞计数:重悬，于细胞沉淀中加入20ml生理盐水，用1ml移液管反复吹吸细胞，充分混匀；细胞计数，吸取20 μ I细胞，加入180 μ I台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数、活率及复苏率。
9.根据权利要求8的方法，进一步包括以下对复苏的免疫细胞进行扩增的步骤: (i)细胞扩增:用含有X-VIVO无血清培养基及10%的自体人血清的细胞培养液对复苏后的单个核细胞进行重悬培养，细胞密度为4X 16个细胞，置于37°C温度条件下，5%的二氧化碳培养箱中孵育2小时，2小时后，取出细胞培养瓶，将细胞培养液吸出，转移至50ml离心管中，剩下瓶中的贴壁细胞用生理盐水反复吹洗2-3遍，直至贴壁细胞完全不被吹洗下来，此时的细胞为未成熟树突状细胞(iDC)，添加2-3ml的X-VIVO无血清培养基重悬未成熟树突状细胞(iDC)，将上述转移至50ml的离心管中的细胞培养液进行离心，获得的细胞沉淀为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，吸取20 μ I细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，加Λ 180 μ I台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞总数和活率，单个核细胞总数减去细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)总数为未成熟树突状细胞(iDC)细胞计数，然后分别针对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)和未成熟树突状细胞(iDC)进行细胞培养。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于: 未成熟树突状细胞(iDC)的培养步骤如下: 第I天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液、粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF) 1000U/ml和白细胞介素4 (IL_4) 500U/ml ； 第4天，半量换液；第5天，加入抗原负载； 第6天，加入人肿瘤坏死因子a (TNF- a ) 1000U/ml过夜； 第7天，DC第一次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量； 第9天，DC第二次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量； 第11天，DC第三次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量； 第13天，DC第四次收获，计数，测定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量； 细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的培养步骤如下: 第I天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液及细胞因子INF-γ 1000U/ml ； 第2天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液及细胞因子CD3 单抗 375ng/ml、白细胞介素 2(IL-2) 1000U/ml、白细胞介素 la (IL-1 a ) 500U/ml ； 第4天，半量换液； 第6天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液、白细胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白细胞介素 la (IL-1 a ) 500U/ml ； 第8天，补加一倍含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液、白细胞介素 2(IL-2) 1000U/ml、白细胞介素 la (IL-1 a ) 500U/ml ； 第 12 天，CIK 第一次收获，计数，测定 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、⑶3-⑶19+、⑶4/⑶8等细胞表面抗原的表达量； 第 14 天，CIK 第 二次收获，计数，测定 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、⑶3-⑶19+、⑶4/⑶8等细胞表面抗原的表达量。
【专利摘要】本发明涉及一种简单有效的从成人外周血中自动化提取免疫细胞的方法，特别是涉及一种使用AXP全自动细胞分离设备来从成人外周血中自动化提取免疫细胞的方法，以及相配套使用的冻存和复苏的方法，以及复苏后免疫细胞扩增的方法，其包括如下步骤：全血样本预处理、自动分离、单个核细胞收集和任选的对所得免疫细胞检测以下项目的至少一项：单个核细胞总数、单个核细胞活率、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。本发明发现使用特定操作步骤的提取、冻存、复苏以及扩增，可以有效地获得免疫细胞，该免疫细胞可用于治疗肿瘤。
【IPC分类】C12N5-0783, C12N5-0784
【公开号】CN104694473
【申请号】CN201510112515
【发明人】许晓椿, 周丹, 王芳, 肖海蓉
【申请人】江苏博雅再生医学科技有限公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月14日