专利名称：一种基于羊传染性脓疱病毒b2l基因的dna疫苗载体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA疫苗载体及其制备方法和应用，特别设计一种可用于预防羊传染性脓疱的DNA疫苗载体及其制备方法和应用，属于生物药物领域。
背景技术：
羊传染性脓疱(俗称“羊口疮”)是由痘病毒科，副痘病毒属羊传染性脓疱病毒(Orfvirus, 0RFV)引起的一种人畜共患传染病。该病主要危害3 6月龄羔羊和部分成年羊，临床症状表现为嘴唇、口黏膜部分皮肤红疹、脓疱、溃疡和结痂；羔羊表现为齿唇部破溃，不能吃奶,若继发或混合感染其他病原微生物死亡率较高。本病可以通过伤口感染饲养人员 表现为手背、指间和前臂部疱疹和破溃。该病世界范围内发生且广泛流行，因此，羊传染性脓疱的爆发和流行不但严重危害羊产业的健康发展而且威胁人们的身体健康，是一种危害较为严重的人畜共患传染病。临床上尚无有效的药物用于羊传染性脓疱病的防治，疾病处于自限性时，通常使用抗生素阻止细菌继发感染；处于并发症时，常使用局部冷敷疗法或切除法；疾病较为严重时，可进行必要的切除进行治疗。目前，用于生产羊口疮疫苗的毒株是在20年前制备的，随着病毒的变异，保护效率不高。更为严重的是由于羊口疮疫苗制作工艺复杂，市场需求量较其他动物疫苗小等原因，很多动物疫苗企业不愿意进行羊口疮疫苗的生产，导致市场上无羊口疮疫苗供应。因此急需一种制作简单能够预防羊口疮的新型疫苗来进行羊口疮的防控。随着养羊业规模化的快速发展，羊传染性脓疱危害越来越严重，如何提高疫苗的免疫保护效率、降低生产成本、简化免疫程序等成为迫切需要解决的问题，开发研制一种安全、高效、经济、实用的新型疫苗对羊传染性脓疱病的防治意义重大。B2L基因编码42kDa的蛋白，该蛋白是病毒囊膜的成分之一，可刺激机体产生强烈的抗体反应，并刺激淋巴细胞释放(是羊口疮病毒的保护性抗原之一，诱导的免疫反应足以抵抗强毒的攻击。真核表达载体PVAXl是在PcDNA3. I的基础上开发的具有CMV启动子和BGHpoly (A)信号序列，通过了食品与药物管理局批准的可用于DNA疫苗研究的载体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够有效用于羊传染性脓疱病的防治的新型疫苗，本发明的疫苗不仅具有高的免疫保护效率，而且具有生产成本低，可大规模生产的特点，能基本满足当前对于羊传染性脓疱病的防治的需要。为达到本发明所述的目的，本发明采用了以下技术方案本发明的一种基于羊传染性脓疱病毒B2L基因的DNA疫苗载体，其特征在于所述的载体是通过将羊传染性脓疱病毒的主要免疫原性基因B2L基因插入到真核表达载体PVAXl内构建得到的。
所述的用于基因疫苗的真核表达载体pVAXl是常用的基因疫苗载体，其特征是在其多克隆位点上游引入人巨细胞病毒的立即早期启动子序列，在其多克隆位点下游引入可以有效终止转录和mRNA聚腺苷酸化的牛生长因子(BGH)聚腺苷酸化信号序列，真核表达载体pVAXl的载体图谱如图I所示。在本发明中，优选的，所述的B2L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。进一步的，本发明还提供了一种宿主细胞，其特征在于含有本发明所述的DNA疫苗载体。在本发明中，优选的，所述的宿主细胞为大肠杆菌DH5 a。再进一步的，本发明提供了一种构建以上所述的DNA疫苗载体的方法，其特征在于包括以下步骤
I(GGATCC)和Xho I (CTCGAG)酶切位点，所述的引物序列如下所示上游引物Pl TTTGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTC下游引物P2 TTTCTCGAGTTAATTTATTGGTTTGC(2)用引物P1，P2，在高保真DNA聚合酶作用下，以羊传染性脓疱病毒DNA为模板，扩增B2L基因，电泳检测并纯化回收该片段；(3)将步骤(2)得到的片段与pVAXl载体分别用限制性内切酶BamH I和Xho I进行酶切，分别获得带有粘性末端的B2L基因片段和PVAXl质粒片段；(4)将步骤(3)得到的两段片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，鉴定正确后，通过小量提取或大量提取制备得到所述的DNA疫苗载体。在本发明中，优选的，步骤(2)中的扩增条件为95°C预变性5min后进入循环，循环参数为 95°C lmin、57.5°C lmin、72°C lmin，35 个循环后 72°C延伸 lOmin。在本发明中，优选的，扩增得到的B2L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。更进一步的，本发明还提出了所述的DNA疫苗载体在制备预防羊传染性脓疱疾病疫苗中的应用。最后，本发明提出了一种用于预防羊传染性脓疱的DNA疫苗，其特征在于含有本发明所述的DNA疫苗载体。将本发明制备得到DNA疫苗用于动物免疫，结果发现，与对照组相比，注射了本发明的DNA疫苗的动物能够有效抵抗羊传染性脓疱病毒的感染，其免疫保护效率达90%以上，因此本发明的一种DNA疫苗在防治羊传染性脓疱疾病方面将具有广阔的应用前景。
图I为真核表达载体pVAXl的载体图谱；图2为B2L基因的PCR扩增电泳结果；M:DL2000DNA分子质量标准；1:PCR产物；2 ;空白对照图3为pVAXl-B2L的PCR鉴定和酶切鉴定结果；M:DNA DL2000分子质量标准；I :PCR检测结果；2:双酶切鉴定结果；3:空白对照。
具体实施例方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。实施例I 一种基于羊传染性脓疱病毒B2L基因的DNA疫苗载体的制备一、通过基因工程技术克隆B2L基因I、引物的设计根据B2L基因完整编码区设计一对引物，上下游引物Pl和P2分别引入BamH I(GGATCC)和 Xho T (CTCGAG)酶切位点。 上游引物PI : TTTGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTC下游引物P2 : TTTCTCGAGTTAATTTATTGGTTTGC2、PCR 扩增 B2L 基因用引物P1，P2，在高保真DNA聚合酶作用下，以羊传染性脓疱病毒DNA为模板，扩增B2L基因。扩增条件为95°C预变性5min后进入循环，循环参数为95°C lmin,57. 5°C lmin、72°C lmin, 35个循环后72°C延伸lOmin。反应结束后于I. 0%的琼脂糖凝胶中检测大小为1137bp的扩增DNA片段。扩增结果见图2所示。3、B2L基因扩增片段的酶切及回收经电泳检测后大小合适的DNA片段和pVAXl载体(购自Invitrogen公司)各I微克，分别加入10单位的限制性内切酶BamH I和Xho I，混于50微升的反应缓冲液中，于37°C酶切I小时，经常规的琼脂糖凝胶电泳分离和胶中DNA回收方法(按J.萨姆布鲁克，D. W.拉塞尔著，黄培堂等译“分子克隆实验指南”，第三版，387-399页，404-407页2002年8月，科学出版社出版，北京)分别获得粘性末端的B2L基因片段和PVAXl质粒片段。4、B2L基因片段与pVAXl质粒片段连接将纯化后的B2L基因片段与真核表达载体pVAXl质粒片段连接，目的基因片段与质粒载体片段按摩尔比3:1混合，10 μ I反应体系如下
2X反应缓冲液5 μ
P VAX I质粒片段I μ
B2L基因片段Ιμ
T4DNA连接酶I μ I
超纯水补至LO μ 5、大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备将_80°C冻存的菌种DH5 a溶解，于LB平板划线活化，37°C培养过夜，挑取单菌落，接种于5mL LB培养液中，置37°C恒温摇床中于200rpm培养过夜；次日按体积比1/100转种于IOOml LB培养液中，置37°C恒温摇床中于200rpm培养2_3h，待菌液浓度OD6tltl为O. 6 O. 8时，在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的用冰预冷的大离心管中，4°C、4000rpm、离心IOmin,弃上清液，尽量流尽残留培养液；加20mL冰预冷的O. lmol/L CaCl2重悬沉淀，冰浴30min ;于4°C 6000r/min离心IOmin0弃上清；用4mL冰预冷的O. lmol/L CaCl2重悬沉淀，置4°C冰箱放置过夜；次晨加入ImL无菌甘油，吹打混匀，每100 μ I分装于I. 5ml的离心管中，置于_80°C冰箱保存备用。6、连接产物的转化将B2L基因片段与pVAXl质粒片段的连接产物各5 μ I分别加入含有100 μ I大肠杆菌DH5a感受态细胞的离心管中，冰浴O. 5h ;放 入42°C水浴热激90s，迅速取出冰浴3min，加入LB培养液400μ 1，37°C恒温摇床培养Ih ;取出200-400 μ I涂布于含卡那霉素的LB平板上。倒置平板，置于37°C恒温培养箱培育14h ；7、质粒提取挑取平板上的单菌落6个，分别接种到5mL含卡那霉素的LB培养液中，37°C 200r/min振摇培养过夜，根据《分子克隆》碱裂解法小量提取质粒。( I)质粒小量提取试剂的配制溶液I:25mmol/L Tris · Cl (pH 8. O), 10mmol/L EDTA (PH 8.0)，在 IOlbf/in2 (6. 895 X 10V)高压蒸汽灭菌15min后置4°C保存备用，使用前加RNAse。溶液11:0. 2mol/L NaOH, 1%SDS,临用前配制。溶液III 5mol/L乙酸钾，冰醋酸11. 5ml，超纯水28. 5ml，调pH值至4. 8。贮存于
4°C备用。(2)小量提取质粒分别取约3ml菌液置离心管中，12000r/min离心lmin，收集菌体，加入100 μ I预冷的溶液I，涡旋至菌体充分悬浮；加入新鲜配制的溶液II 200 μ 1，颠倒混匀，冰浴5min ；加入预冷的溶液III 150 μ I,混勻后冰浴5min, 12000r/min离心5min,上清转移至另一离心管中，加入等量异丙醇室温沉淀lOmin, 12000r/min离心IOmin,弃上清，沉淀重悬于200 μ I TE中，加100 μ I即1/2倍体积冰预冷的7. 5moI/LNH4Ac,混匀后冰浴IOmin,40C 12000r/min离心lOmin。将上清转移至另一离心管中，加I倍体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇室温沉淀30min, 12000r/min离心5min,沉淀用75%冷乙醇漂洗后,抽干,溶于含20 μ g/ml RNA酶的ddH20或TE (pH 8. O)中，37°C温育lh，取样电泳检查，其余置_20°C冰箱保存备用。8、鉴定重组质粒(I)PCR扩增鉴定以挑选的菌落质粒DNA为模板，P1、P2为引物，进行PCR扩增鉴定。扩增产物于1%的琼脂糖凝胶电泳中检测，阳性质粒命名为PVAX1-B2L。鉴定结果见图3中第I泳道。(2)酶切鉴定取经PCR鉴定为阳性的质粒5 μ 1，分别用限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切2h ;于1%的琼脂糖凝胶电泳中检测，以DNA分子标准及扩增产物为对照，酶切后产生两个片段，一个与载体片段大小一致，一个与扩增片段大小一致。鉴定结果见图3中第2泳道。(3)序列测定；随意选取3个阳性克隆测序，测序结果与报道的序列一致，其中B2L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，从而获得基因疫苗载体PVAX1-B2L。二、质粒pVAXl-B2L的大量制备(I)将含有质粒重组pVAXl-B2L的菌菌液转接种于75mL LB培养液，37°C 200r/min培养过夜,6000r/min 5min,收集细胞沉淀,用3mL溶液I (50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA, 25mmol/L Tris-Cl (pH8. 0)，高压蒸汽灭菌后置4°C保存备用)悬浮(吹散或涡旋)。(2)加入 6mL 溶液 II (O. 2mol/LNa0H, 1%SDS，现配现用)，冰浴 7-lOmin。(3)加入4. 5mL溶液III (3mol/L乙酸钾，冰醋酸调pH值至4. 8)，冰浴7-lOmin。4 °C 10000r/min 10_15min。(4)取上清，加O. 6倍体积的异丙醇，混匀，-20 V 30min或室温5min。室温，10000r/min 6-15min。(5)弃上清，用75%乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加I. 5mL TE (10. Ommol/L Tris-HCl, I. 0mmol/L EDTA)悬浮(洗壁 20min 左右)。(6)加 1.5ml 即 I 倍体积冰预冷的 5mol/LNH4Ac,混勻。4°C 10000r/min IOmin0 (7)将上清转移至7mL的离心管，加I倍体积(3mL)的异丙醇混匀，_20°C作用30mino 12000r/m 15min。(8)弃上清，用75%乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加500 μ L TE悬浮(洗壁20min左右)，并转移至I. 5mL的离心管。(9) 40 μ g/ml RNA 酶，37°C lh，去除 RNA。(10)加 I 倍体积的 13% 的 PEG8000 (含 I. 6mol/L NaCl)，混匀，-20。。30min (可以过夜)。离心，弃上清，用400 μ L TE重溶。(11)加等体积酚仿异戊醇抽提2次，氯仿异戊醇抽提I次。(12)加100 μ I 10mol/LNH4Ac,充分混匀后，加入2倍体积的无水乙醇，_20°C沉淀30min。4°C 12000r/min 离心 5-lOmin。(13)弃上清，用75%乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加50 μ L ΤΕ*Η20重溶，置-20°C备用。三、质粒浓度的测定利用分光光度计测定大提质粒的浓度，且保证0D260/280比值在I. 8 2. O之间。四、基因疫苗载体的制备与贮存用磷酸盐缓冲液(PBS pH7. 4)将其稀释到I μ g/μ 1，或制备成冻干制剂贮存，用前溶解于生理盐水中。实施例2 DNA疫苗载体的免疫效果验证I、用于动物免疫的DNA疫苗的制备将大量提取的DNA疫苗质粒溶解于磷酸盐缓冲液(PBS ρΗ7. 4)后和常规氢氧化铝疫苗佐剂等体积混合，充分震荡后，使DNA质粒在疫苗的终浓度为lmg/mL，放置4度冰箱，保质期12个月。2、动物免疫试验利用本发明制备得到的DNA疫苗载体制备得到的DNA疫苗，在多个不同地区的羊场进行了免疫效果实验，将其中发生羊口疮疾病的三个羊场的患病情况统计如下试验组I2011年3月，安徽肥东县某羊场有80只羔羊分两组，一组40只免疫本发明疫苗，肌肉注射ImL/只，另一组不做任何免疫设为对照组，免疫一个月后，该羊场发生羊口疮，结果免疫组40只羔羊只有3只发生轻微的口疮症状，免疫保护率92. 5%，而对照组则全部发病。
试验组22011年9月山东东营某羊场100只羊分两组，一组50只免疫本发明疫苗，肌肉注射ImL/只，另一组不做任何免疫设为对照组，免疫后45天，该羊场发生羊口疮，结果免疫组50只羔羊只有I只发生轻微的口疮症状，免疫保护率98. 0%，而对照组则50只羊有48只表现为不同程度的口疮症状。试验组32012年3月甘肃永昌某羊场有40只羊分两组，一组20只免疫本发明疫苗，肌肉注射ImL/只，另一组不做任何免疫设为对照组，免疫后60天，该羊场发生羊口疮，结果免疫组20只羔羊只有2只发生轻微的口疮症状，免疫保护率90. 0%，而对照组的20只羊其中19只 表现为不同程度的口疮症状。
权利要求
1.一种基于羊传染性脓疱病毒B2L基因的DNA疫苗载体,其特征在于所述的疫苗载体是通过将羊传染性脓疱病毒主要免疫原性基因B2L基因插入到真核表达载体pVAXl内构建得到的。
2.如权利要求I所述的DNA疫苗载体，其特征在于所述的B2L基因的核苷酸序列如SEQID NO. I 所示。
3.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求I或2所述的DNA疫苗载体。
4.如权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于其为大肠杆菌DH5ci。
5.一种构建权利要求I或2所述的DNA疫苗载体的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)根据B2L基因完整编码区设计一对引物，上下游引物Pl和P2分别引入BamHI(GGATCC)和Xho I (CTCGAG)酶切位点，所述的引物序列如下所示上游引物 PI : TTTGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTC下游引物 P2 TTTCTCGAGTTAATTTATTGGTTTGC (2)用引物P1，P2，在高保真DNA聚合酶作用下，以羊传染性脓疱病毒DNA为模板，扩增B2L基因，电泳检测并纯化回收该片段； (3)将步骤(2)得到的片段与pVAXl载体分别用限制性内切酶BamHI和Xho I进行酶切，分别获得带有粘性末端的B2L基因片段和PVAXl质粒片段； (4 )将步骤(3 )得到的两段片段连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，鉴定正确后，通过小量提取或大量提取制备得到所述的DNA疫苗载体。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(2)中的扩增条件为95°C预变性5min后进入循环，循环参数为95°C lmin、57.5°C lmin、72°C lmin，35个循环后72°C延伸lOmin。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于扩增得到的B2L基因的核苷酸序列如SEQIDNO. I所示。
8.权利要求I或2所述的DNA疫苗载体在制备预防羊传染性脓疱疾病药物中的应用。
9.一种用于预防羊传染性脓疱的DNA疫苗，其特征在于含有权利要求I或2所述的DNA疫苗载体。
全文摘要
本发明公开了一种基于羊传染性脓疱病毒B2L基因的DNA疫苗载体及其制备方法和应用，属于生物药物领域。本发明的一种基于羊传染性脓疱病毒B2L基因的DNA疫苗载体，其特征是将羊传染性脓疱病毒主要免疫原性基因B2L插入到真核表达载体pVAX1内经大量制备后得到的。将本发明的制备得到DNA疫苗用于动物免疫，结果发现，与对照组相比，注射了本发明的DNA疫苗的动物能够有效抵抗羊传染性脓疱病毒的感染，其免疫保护效率达90%以上，因此本发明的一种DNA疫苗在防治羊传染性脓疱疾病方面将具有广阔的应用前景。
文档编号A61K48/00GK102888422SQ20121036130
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月25日 优先权日2012年9月25日
发明者刘湘涛, 张克山, 刘永杰, 孔汉金, 尚佑军, 田宏, 尹双辉, 逯忠新 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所