专利名称：一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的TaqMan Real-time试剂盒及其检测方法，具体涉及用TaqMan实时荧光定量PCR检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒及其检测方法。
背景技术：
羊传染性脓疱皮炎病毒简称“羊口疮”病毒(Orf Virus，0RFV)，能引起羊属动物和人类接触性感染，甚至引发养羊业发展和环境安全问题。ORFV污染的环境对于幼年羊只和泌乳母羊存在极高的感染风险，它们主要侵害宿主皮肤或黏膜，并可导致其严重的持续性感染和继发性感染。ORFV拥有鲜明的种属特性和丰富的功能性基因，其基因组属于两端闭合的双股DNA，长约138kb，中央为核心区(88kb)，两端为反向重复序列(Invertedterminal repeat, ITR),冠以环状发夹结构。中央核心区基因相对保守,主要调控病毒的复制、包装和输出。其编码的主要蛋白有dUTPase、42KDa蛋白、20KDa蛋白、DNA聚合酶、RNA螺旋酶、RNA聚合酶、RAP94、病毒粒子蛋白、后期基因转录蛋白、拓扑异构酶、后期基因反式作用子、核心蛋白等。近年该病在我国广泛流行，对养羊业及人类健康构成威胁。目前对ORFV难以防控的原因是多方面的，感染早期的诊断技术薄弱是主要原因。就目前ORFV的流行特点，要使其在流行病学方面得到控制，开展一系列的防控和净化工作势在必行。从经济角度上讲，国外检测试剂检测一份样品的价格往往是几十元甚至上百元人民币，成本过高导致养羊业主无法接受。目前检测羊传染性脓包皮炎病毒仅有普通PCR试剂盒，该试剂盒操作相对复杂，结果判定需靠电泳条带来确定，费时费力，而且电泳时凝胶中加入的溴化乙锭危害人体健康，操作时需格外小心
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种简便、准确、快速、特异性和灵敏性好以及低成本的用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒及其检测方法，本试剂盒及检测方法还适用于检测低微含量的羊传染性脓疱皮炎病毒。本发明提供了一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的检测方法，其特征在于，通过针对羊传染性脓疱皮炎病毒保守区域H2L基因设计一对引物和一条探针对样品的DNA模板进行实时荧光定量PCR检测，所设计引物和和探针序列如下:上游引物:5，-TCCACGCTGCCGACGCCAAAGT-3’下游引物:5，-GCACCGCATCGAGAACGCCAAGAA-3’探针:5’-FAM-TCGAGGCTGCGCGCGGCCGAGACC-TAMRA-3’。所述样品的DNA模板使用宝生物工程有限公司的型号为D824A的基因组DNA提取试剂盒进行提取。所述实时荧光定量PCR的反应体系为:
I) Premix Ex Taql2.5 μ L ；2)上下游引物及探针，其浓度均为10 μ Μ，各取IyL;3)样品的DNA模板3 μ L ;4)无 RNA 酶水 6yL;5) 50XROX Reference Dye0.5 μ L0所述实时荧光定量PCR的反应条件如下:94°C预变性2min ；94°C 40s, 54°C 40s，72°C 50s, 40 个循环。本发明还提供了一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒，包括Premix ExTaq ;阳性对照；阴性对照；扩增引物与探针的混合物和50 X ROX Reference Dye ；所述扩增引物与探针的混合物的序列如下:上游引物:5’ -TCCACGCTGCCGACGCCAAAGT-3 ’下游引物:5’ -GCACCGCATCGAGAACGCCAAGAA-3 ’探针:5，-FAM-TCGAGGCTGCGCGCGGCCGAGACC-TAMRA-3，。所述阴性对照为无RNA酶水。所述阳性对照为含有羊传染性脓疱皮炎病毒H2L基因的质粒。试剂盒中上下游引物及探针的浓度均为ΙΟμΜ，体积配比为1:1:1。
本发明设计了针对ORFV的保守区域H2L设计扩增引物I对，探针I条，用于羊传染性脓疱皮炎病毒Taqman实时定量PCR检测，H2L基因高度保守，针对该基因建立的实时定量方法特异性高，稳定性好；本发明用来检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒，操作简便，用户只需将待检样品的DNA加入反应管中，根据扩增曲线即可得出检测结果，省时省力，成本较低，时间由原来的3-4小时缩短到1-2小时；并且比普通PCR的灵敏度高，可用于检测低微含量的羊传染性脓包皮炎病毒，可适用于我国各级防控单位，基层兽医站，大中型养殖场等，具有较好的应用前景。
图1为3.1的分别以待检样品DNA、阴性对照和阳性对照为模板的实时荧光定量PCR结果。图2为3.2的分别以羊口疮原代牛睾丸细胞毒、羊口疮病毒田间样品2份、羊痘牛睾丸细胞毒提取的DNA以及阴性对照无RNA酶水为模板的实时荧光定量PCR结果。图3为3.3的以阳性对照为模板进行6个重复实时荧光定量PCR结果。图4为3.4的以阳性对照构建的浓度为2.81 X IO7Copies/ μ L的pMD_H2L质粒做10倍递减梯度稀释，以6个稀释度的质粒作为模板的实时荧光定量PCR结果。
具体实施例方式本发明提供了一种用于羊传染性脓疱皮炎病毒的检测试剂盒，由以下组分组成:(I)Premix Ex Taq，购自宝生物工程(大连)有限公司，型号为RR390Q。(2)阳性对照本试剂盒发明的阳性对照为含有羊传染性脓疱皮炎病毒H2L基因的质粒，所述含有羊传染性脓疱皮炎病毒H2L基因的质粒的制备方法如下:从细胞分离的羊传染性脓疱皮炎病毒中扩增得到H2L基因，克隆至PMD-18T，转化大肠杆菌感受态细胞JM109感受态细胞，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板上，37°C培养12 16小时。经蓝白斑筛选后，用质粒(小量)提取试剂盒提取质粒，将序列测定为阳性的质粒命名PMD-H2L，应用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度计测出该质粒的浓度为90ng/l.! L，计算出其拷贝数浓度为2.81 X IO7Copies/μ Ucopies/μ L即拷贝/微升，下同)，本发明的试剂盒所用阳性对照质粒浓度为 2.81 X IO4Copies/ μ L。(3 )阴性对照:无RNA酶水。(4)扩增弓I物与探针的混合物。上下游扩增弓I物及探针的浓度均为10 μ Μ，体积配比为1:1:1。(5) ROX Reference Dye (50X)。使用上述试剂盒检测羊传染性脓疱皮炎病毒的方法:1.引物设计与制备参照GenBank查找多个毒株，进行序列比对，根据比对结果并参照文献[徐洪庆，陈俊芳，陆则基.羊口疮病毒的病原特性及诊断.畜禽业，2012，274:81]说明，针对ORFV的保守区域H2L基因设计了一对特异引物和一条探针，引物和探针的信息如表I所示:
表I
权利要求
1.一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的检测方法，其特征在于，通过针对羊传染性脓疱皮炎病毒的保守区域H2L基因设计一对引物和一条探针对样品的DNA模板进行实时荧光定量PCR检测，所设计引物和和探针序列如下: 上游引物:5 ’ -TCCACGCTGCCGACGCCAAAGT-3， 下游引物:5’ -GCACCGCATCGAGAACGCCAAGAA-3’ 探针:5’ -FAM-TCGAGGCTGCGCGCGGCCGAGACC-TAMRA-3’。
2.根据权利要求1所述的用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的检测方法，其特征在于，所述样品的DNA模板使用宝生物工程有限公司的型号为D824A的基因组DNA提取试剂盒进行提取。
3.根据权利要求2所述的用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应体系为:1)PremixEx Taql2.5 μ L ； 2)上下游引物及探针，其浓度均为ΙΟμΜ，各取IyL; 3)样品的DNA模板3μL ; 4)无RNA酶水6μ L ;5)50XROX Reference Dye0.5 μ L0
4.根据权利要求3所述的用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应条件如下:94°C预变性2min ；94°C 40s, 54°C 40s, 72°C 50s, 40个循环。
5.一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒，其特征在于，包括Premix Ex Taq、阳性对照、阴性对照、扩增引物与探针的混合物以及50 X ROX Reference Dye ； 所述扩增弓I物与探针的混合物的序列如下: 上游引物:5’ -TCCACGCTGCCGACGCCAAAGT-3’ 下游引物:5’ -GCACCGCATCGAGAACGCCAAGAA-3’ 探针:5’ -FAM-TCGAGGCTGCGCGCGGCCGAGACC-TAMRA-3’。
6.根据权利要求5所述的用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为无RNA酶水。
7.根据权利要求6所述的用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有羊传染性 脓疱皮炎病毒H2L基因的质粒。
8.根据权利要求7所述的用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒，其特征在于，试剂盒中上下游引物及探针的浓度均为ΙΟμΜ，体积配比为1:1:1。
全文摘要
本发明提供了一种用于检测羊传染性脓疱皮炎病毒的检测方法，通过设计一对引物和一条探针对样品的DNA模板进行实时荧光定量PCR检测，本发明还提供了利用上述检测方法检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒。本发明针对ORFV的保守区域H2L基因建立的实时定量方法特异性高，稳定性好；本发明用来检测羊传染性脓疱皮炎病毒的试剂盒，操作简便，用户只需将待检样品的DNA加入反应管中，根据扩增曲线即可得出检测结果，省时省力，成本较低，时间由原来的3-4小时缩短到1-2小时；并且比普通PCR的灵敏度高，可用于检测低微含量的羊传染性脓包皮炎病毒，可适用于我国各级防控单位，基层兽医站，大中型养殖场等，具有较好的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK103255234SQ20131019921
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月27日 优先权日2013年5月27日
发明者刘湘涛, 田宏, 吴锦艳, 陈妍, 尚佑军, 张克山, 尹双辉, 王光祥, 杨顺利, 刘永杰 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所