专利名称：一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法
技术领域：
本发明涉及一种手性胺，尤其是涉及一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法。
背景技术：
手性胺是重要的医药和精细化工中间体，也可用作金属手性配体和手性助剂的手性源[Applied Organometallic Chemistry, 2011，25:110-116],催化羰基的不对称还原。手性胺还可以作为手性拆分试剂用于外消旋体拆分。手性胺可通过化学合成和生物催化制备。手性胺的化学制备方法主要有:氨基酸或其衍生物的还原、醛或酮与亚胺的偶合以及环氧化合物的氨基化开环等。生物法制备手性胺主要通过酶催化拆分或不对称还原实现。用于制备手性胺的酶主要有脂肪酶、转胺酶和氧化还原酶。脂肪酶(Lipase)可催化拆分消旋胺获得手性胺，理论产率为50%，并存在后续分离的问题[Journal of theAmerican Chemical Society, 2010，132:14179-14190]。利用转氨酶(Transaminases)催化羟酮发生氨基转移反应是目前制备手性氨基醇的主要方法。转氨酶可催化氨基供体(氨基酸或胺)与氨基受体( 酮)之间氨基转移。该反应是可逆反应，由于生成的酮和胺均对转胺酶有较严重的抑制作用，必须除去产物酮以降低其对酶抑制，促使反应正向进行，时空产率较低[Chemical Communications, 2010，46:5569-5571]。催化酮基不对称还原胺化获得手性胺，并以NAD(P)H为辅酶的胺脱氢酶，是理想的制备手性氨基醇的生物催化剂，其反应路线简洁，易实现辅酶再生。Abrahamson等对来源于Bacillus stereothermophiIus的亮氨酸脱氢酶进行多轮定点突变,获得新型胺脱氢酶，可选择性还原甲基异丁基酮为(R)-1，3-二甲基丁基胺。该酶催化不对称胺还原，转化率可达 92%,活性为 0.69U/mg,产物 ee 值为 99.8%[Angewandte Chemie InternationalEdition.201251:3969-3972]。Itoh 等人从 Streptomyces virginiae IF012827 中分离纯化得到依赖辅酶NADH的胺脱氢酶，在pHIO的条件下催化系列羟酮还原胺化生成氨基醇，pH7时反方向催化氨基醇生成相应的轻酮[Journal of Molecular CatalysisB-Enzymatic, 2000, 10:281-290.]。但该酶的反应选择性尚属较低，且无基因和蛋白结构等信息的报道。因此，筛选含有催化不对称还原胺化高活性高选择性的胺脱氢酶的菌株是实现手性胺有效制备的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法。本发明包括以下步骤:I)细胞液制备:将菌种接入216L培养基中培养，再将培养后获得的发酵液离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配制成细胞液；2)全细胞催化反应:在步骤I)得到的细胞液中，加入酮作为底物，再加入氨基供体和辅助底物，用于辅酶循环再生，利用细胞催化不对称还原胺化得到产物手性胺。
在步骤I)中，所述菌种为基尔假单胞菌(Pseudomonas kilonensis),基尔假单胞菌(Pseudomonas kilonensis)从中国海洋微生物菌种保藏管理中心获得，该中心的保藏编号为MCCC N0.1A06062 ;所述将菌种接入216L培养基中培养的菌种接种量可为1% ;所述216L培养基的组成为10.0g/L蛋白胨，5.0g/L酵母粉，0.5g/L牛肉膏，0.5g/L柠檬酸钠，0.2g/LNH4N03, 1.0g/L NaAc，用海水配制；所述培养的条件可为:起始pH7.0，装液量体积分数为10%，培养温度30°C，摇床转速150rpm，培养时间72h ;所述离心可采用冷冻离心机，离心的条件可为4°C，lOOOOrpm，15min，获得细胞；所述用缓冲液重悬、洗涤可弃上清液，缓冲液重悬，洗涤后离心，重复操作3次；所述细胞液的浓度可为0.025 100g/L ;所述缓冲液可选自0.01 0.2mol/L的pH为7 13的Tris-盐酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸钾等中的至少一种，优选pH9的Tris-盐酸缓冲液。在步骤2)中，所述酮可选自0.001 0.5mol/L的碳链长度2 10的脂肪族酮、芳香酮、羟基酮等中的一种；所述氨基供体可选自0.002 lmol/L的丙氨酸、氨水、NH4Cl,NH4NO3、氨基烷烃等中的一种，优选氨水或NH4Cl ;所述辅助底物可选自0.001 lmol/L的葡萄糖、甘油、乙醇、甲酸、异丙醇、仲丁醇等中的至少一种，优选葡萄糖、甘油等中的至少一种；所述利用细胞催化不对称还原胺化的条件是PH7 13，反应温度O 70°C，震荡速率100 300rpm，反应时间30 180h。本发明从海洋微生物筛选获得含有依赖NADH的胺脱氢酶的不同以往报道的新菌株。本发明还考察了氨基供体、反应缓冲液、pH、温度等影响，优化了该菌株全细胞催化酮不对称还原胺化制备手性胺的反应体系和反应条件。所获产物手性胺的光学纯度达到90%以上，收率达70%以上。本发明操作方便，具有产品光学纯度高、收率高等优点，设备简单，在生物催化制备手性胺领域具有较好的工业应用前景。
图1为酮的色谱 分析图。图2为产物胺的手性色谱分析图。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做详细说明。实施例1(I)基尔假单胞菌(Pseudomonas kilonensis)的培养:以1%的接种量,将菌种接入50L216L培养基中。216L培养基组成为10.0g/L蛋白胨，5.0g/L酵母粉，0.5g/L牛肉膏，0.5g/L柠檬酸钠，0.2g/L NH4NO3, 1.0g/L NaAc，用海水配制。培养条件为:起始pH7.0，装液量体积分数为10%，培养温度30°C，摇床转速150rpm，培养时间72h。细胞的制备:培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4 °C，IOOOOrpm,15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH7.6)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次获得细胞。(2)全细胞催化反应:反应体系为0.5mol/L4-甲基2_戍酮，lmol/L丙氨酸，Imol/L甘油，0.01mol/L的Tris-盐酸缓冲液，ρΗ9.0,反应体积100L, 100g/L的细胞，反应体积50mL，在(TC反应温度下，IOOrpm震荡反应反应时间180h。
(3)分离与检测:用6mol/L的NaOH调节pH至14,再用50L的甲基叔丁基醚萃取，分离出的甲基叔丁基醚层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥，将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9: I)溶解，用高效液相色谱检测，产物R-4-甲基2-戊胺光学纯度为 e.e99.0%，产率 84.7%。产物质谱分析数据为 IH NMR(400MHz, CDC13) δ 2.94 (sex, 1H, J=6.4Hz)，1.65 (sep, 1H, 6.8Hz)，1.24-1.02 (m, 2H)，1.04 (d, 3H, 6.4Hz)，0.89 (d, 6H, 6.8Hz)。实施例2(I)实验步骤如实施例1的(I) (2)。(2)全细胞催化反应:反应体系为 0.02mol/L2-丁酮，0.2mol/L NH4Cl, 0.2mol/L葡萄糖，0.01mol/L的乙酸钠缓冲液，1.5g/L的细胞，反应体系pH13，反应体积500mL，在50°C下，200rpm震荡反应，反应时间30h。(3)分离与检测:用6mol/L的NaOH调节pH至14,再用250mL的甲基叔丁基醚萃取，分离出的甲基叔丁基醚层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥，将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9: I)溶解，用高效液相色谱检测，计算产物胺R-2-丁胺的收率为 72.1%, e.e.值为 92.7%。实施例3(I)实验步骤如实施例1的(I) (2)。(2)全细胞催化反应:反应体系为0.01mol/L苯乙酮，0.02mol/L氨水，0.01mol/L异丙醇，0.2mol/L的Tris-盐酸缓冲液，0.025g/L的细胞，反应体积20L，反应体系pH7，反应体积5L，在10°C下，300rpm震荡反应，反应时间180h。(3)分离与检测:用6mol/L的NaOH调节pH至14,再用10L的甲基叔丁基醚萃取，分离出的甲基叔丁基醚层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥，将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9: I)溶解，用高效液相色谱检测，产物S-苯乙胺收率为80.7%,e.e.值为 90.2%。实施例4(I)实验步骤如实施例1的(I) (2)。(2)全细胞催化反应:反应体系为0.01mol/L5-癸酮，0.01mol/L2_氨基丙烷，
0.02mol/L仲丁醇，0.2mol/L的磷酸钾缓冲液，pH10，50g/L的细胞，反应体积50L，在50°C反应温度下，300rpm震荡反应，反应时间30h。(3)分离与检测:用6mol/L的NaOH调节pH至14,再用25L的甲基叔丁基醚萃取，分离出的甲基叔丁基醚层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥，将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9: I)溶解，用高效液相色谱检测，产物S-5-癸胺收率为88.6%,e.e.值为 95.5%。实施例5(I)实验步骤如实施例1的(I) (2)。(2)全细胞催化反应:反应体系为0.05mol/L2_羟基-3-丁酮，0.lmol/L丙氨酸，
0.05mol/L乙醇，0.2mol/L的碳酸钠缓冲液，pH9.0，250mg/L的细胞，反应体积1L，在70°C反应温度下，300rpm震荡反应，反应时间30h。
(3)分离与检测:用6mol/L的NaOH调节pH至14,再用0.5L的甲基叔丁基醚萃取，分离出的甲基叔丁基醚层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥，将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9: I)溶解，用高效液相色谱检测，R-2-羟基-3-丁胺收率为80.1%, e.e.值为 98.5%。实施例6(I)实验步骤如实施例1的(I) (2)。(2)全细胞催化反应:反应体系为0.04mol/L3-羟基-5-庚酮，0.2mol/L NH4NO3,
0.001- 0.2mol/L甲酸，0.01mol/L的Tris-盐酸缓冲液，1000mg/L的细胞，反应体积1.5L，反应体系PH11，在70°C反应温度下，100-300rpm震荡反应，反应时间30 180h。(3)分离与检测:用6mol/L的NaOH调节pH至14,再用40mL的甲基叔丁基醚萃取，分离出的甲基叔丁基醚层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥，将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9: I)溶解，用高效液相色谱检测，产物S-3-羟基-5-庚胺收率为 89.9%, e.e.值为 98.4%。实施例7(I)实验步骤如实施例1的(I) (2)。 (2)全细胞催化反应:反应体系为 0.2mol/L3-己酮，0.2mol/L NH4Cl70.2mol/L甘油，0.4mol/L的乙酸钠缓冲液，50g/L的细胞，反应体系pH12，反应体积80L，在70°C下，200rpm震荡反应，反应时间95h。用6mol/L的NaOH调节pH至14，再用400mL的甲基叔丁基醚萃取，分离出的甲基叔丁基醚层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥，将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9: I)溶解，用高效液相色谱检测，计算产物R-3-己胺的收率为71.5%, e.e.值为92.7%实施例8(I)实验步骤如实施例1的(I) (2)。(2)全细胞催化反应:反应催化体系为0.001mol/L2-异辛酮，0.002mol/L氨水，
0.002mol/L乙醇，0.01-0.2mol/L的乙酸钠缓冲液，1.5g/L的细胞，反应体系pH8，反应体积2L，在50°C下，200rpm震荡反应，反应时间30h。(3)分离与检测:用6mol/L的NaOH调节pH至14,再用400mL的甲基叔丁基醚萃取，分离出的甲基叔丁基醚层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥，将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9: I)溶解，用高效液相色谱检测，计算产物S-2-异辛胺胺的收率为 91.5%, e.e.值为 95.7%。本发明所制得的产物手性胺的分离与检测如下:用NaOH调节pH值，再用甲基叔丁基醚萃取，分离出的甲基叔丁基醚层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥。将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液溶解，酮的浓度用高效液相色谱检测，产物胺的浓度和对映体过剩值用高效液相色谱测定。所述分离条件为用6mol/L的NaOH调节pH至14,再用甲基叔丁基醚萃取，分离出的甲基叔丁基醚层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥。所述检测条件为酮的浓度用高效液相色谱检测，色谱柱为C18柱，检测波长210nm ;所述产物胺的浓度和对映体过剩值(e.e.值),高效液相色谱检测,色谱柱为Chiracel-OD column (Daicel),检测波长214nm。酮的浓度用高效液相检测，色谱柱为C18柱，检测波长210nm (图1)。产物胺用高效液相色谱检测ee值,色谱柱为Chiracel-OD column(Daicel),检测波长214nm (图2)。本发明所述菌株全细胞催化酮不对称还原胺化制备，是利用全细胞中胺脱氢酶的高度对映体选择性，催化酮的不对称还原胺化，获得R-胺或S-胺，葡萄糖等辅助底物加入用于辅酶NADH的循环再生。其以葡萄糖为辅助底物的化学反应式如下:
权利要求
1.一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法，其特征在于包括以下步骤: 1)细胞液制备:将菌种接入216L培养基中培养，再将培养后获得的发酵液离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配制成细胞液； 2)全细胞催化反应:在步骤I)得到的细胞液中，加入酮作为底物，再加入氨基供体和辅助底物，用于辅酶循环再生，利用细胞催化不对称还原胺化得到产物手性胺。
2.如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法，其特征在于在步骤I)中，所述菌种为基尔假单胞菌(Pseudomonas kilonensis),基尔假单胞菌(Pseudomonas kilonensis)已保藏于中国海洋微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为MCCCN0.1A06062。
3.如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法，其特征在于在步骤I)中，所述将菌种接入216L培养基中培养的菌种接种量为1%;所述216L培养基的组成为10.0g/L蛋白胨，5.0g/L酵母粉，0.5g/L牛肉膏，0.5g/L柠檬酸钠，0.2g/LNH4NO3, 1.0g/LNaAc，用海水配制。
4.如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法，其特征在于在步骤I)中，所述培养的条件为:起始PH7.0，装液量体积分数为10%，培养温度30°C，摇床转速150rpm，培养时间72h。
5.如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法，其特征在于在步骤I)中，所述离心采用冷冻离心机，离心的条件为4°C, IOOOOrpm, 15min,获得细胞。
6.如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法，其特征在于在步骤I)中，所述用缓冲液重悬、洗涤的方法是弃上清液，缓冲液重悬，洗涤后离心，重复操作3次。
7.如权利要求1所述一种海洋菌`株催化不对称还原制备手性胺的方法，其特征在于在步骤I)中，所述细胞液的浓度为0.025 100g/L ;所述缓冲液可选自0.01 0.2mol/L的pH为7 13的Tris-盐酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸钾中的至少一种，优选pH9的Tris-盐酸缓冲液。
8.如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法，其特征在于在步骤2)中，所述酮选自0.001 0.5mol/L的碳链长度2 10的脂肪族酮、芳香酮、羟基酮中的一种；所述氨基供体可选自0.002 lmol/L的丙氨酸、氨水、NH4CUNH4NO3、氨基烷烃中的一种，优选氨水或NH4Cl。
9.如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法，其特征在于在步骤2)中，所述辅助底物选自0.001 lmol/L的葡萄糖、甘油、乙醇、甲酸、异丙醇、仲丁醇中的至少一种，优选葡萄糖、甘油中的至少一种。
10.如权利要求1所述一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法，其特征在于在步骤2)中，所述利用细胞催化不对称还原胺化的条件是PH7 13，反应温度O 70°C，震荡速率100 300rpm，反应时间30 180h。
全文摘要
一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法，涉及一种手性胺。将菌种接入216L培养基中培养，再将培养后获得的发酵液离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配制成细胞液；在得到的细胞液中，加入酮作为底物，再加入氨基供体和辅助底物，用于辅酶循环再生，利用细胞催化不对称还原胺化得到产物手性胺。从海洋微生物筛选获得含有依赖NADH的胺脱氢酶的不同以往报道的新菌株，优化该菌株全细胞催化酮不对称还原胺化制备手性胺的反应体系和反应条件。所获产物手性胺的光学纯度达到90％以上，收率达70%以上。操作方便，具有产品光学纯度高、收率高等优点，设备简单，在生物催化制备手性胺领域具有较好的工业应用前景。
文档编号C12P13/00GK103224963SQ201310198839
公开日2013年7月31日 申请日期2013年5月24日 优先权日2013年5月24日
发明者王世珍, 方柏山 申请人:厦门大学