专利名称：一种利用天津短杆菌和植物乳杆菌混合发酵高产gaba的方法
技术领域：
一种利用安全高效的天津短杆菌和植物乳杆菌混合发酵高产GABA的方法，属于发酵工程和酶工程领域。
背景技术：
Y-氨基丁酸(GABA)是天然存在于某些生物体的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统重要的抑制性神经递质，在食品、饲料、医药等领域具有广泛的应用。Y-氨基丁酸具有抗焦虑、降血压、镇定安神、增强记忆、调节激素分泌、促进生殖、利尿，镇痛等生理功倉泛。Y-氨基丁酸的制备主要通过化学合成法和生物法。其中生物法又包括植物富集法和微生物发酵法。化学法主要是通过邻苯二甲酞亚氨钾和Y-氯丁氰在强烈条件下(180°c )反应，然后产物与浓硫酸水解得到；另一种方法是以吡咯烷酮作为原料，经氢氧化钙、碳酸氢铵水解制得Y-氨基丁酸。总体而言，化学合成法虽然具有反应迅速的优点，但是反应条件苛刻、能耗大、成本高、得率低，反应条件剧烈，污染严重，存在着一定的安全隐患。植物富集主要是利用内源性谷氨酸脱羧酶(EC4.1.1.15)催化谷氨酸制备Y-氨基丁酸。这是植物组织对外界条件的应激反应。这些外界应激条件包括温度、压力、研磨、破碎、酸碱性以及钙离子浓度和氧浓度等。植物富集Y-氨基丁酸虽然制备工艺简单，环境副作用小，但是植物富集Y-氨基丁酸含量较低，不适于规模化生产Y-氨基丁酸。目前，Y-氨基丁酸的生产主要是微生物发酵法，通过微生物中的谷氨酸脱羧酶催化L-谷氨酸的α-羧 基脱羧来生产Y-氨基丁酸。谷氨酸脱羧酶是作用于这一过程的唯一酶，已经在细菌、古生菌和真菌微生物中发现了谷氨酸脱羧酶的存在。微生物发酵法是以谷氨酸或其钠盐或含谷氨酸的物质为原料，利用酵母菌、乳酸菌和曲霉菌等食品安全级微生物发酵制得，具有良好的开发前景。利用微生物将谷氨酸脱羧转化成Y-氨基丁酸具有高度专一性，且发酵法反应条件温和、反应速率快、设备简单、公害少、安全、成本较低等优点。利用微生物转化合成Y-氨基丁酸的研究并将其产业化具有现实需求性。传统的微生物发酵需要添加外源的谷氨酸或谷氨酸钠盐作为底物，而谷氨酸也是需要以糖质为原料经微生物发酵，采用等电点提取加上离子交换树脂分离的方法而制得。所以添加外源谷氨酸为底物在一定程度上增加了 Y-氨基丁酸的制备成本。天津短杆菌SW07-1是一株谷氨酸生产菌的变异株，保存于江南大学生物工程学院(《生物加工过程》，2009年第7卷第6期74-78页)。该菌株缺少Y -氨基丁酸合成途径，但能高效转化葡萄糖为谷氨酸。另外，本研究室前期经诱变筛选获得一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)GB01-21(中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号:CCTCCM209102)，此菌株缺少谷氨酸合成途径，但具有较高的谷氨酸脱羧酶活力，能高效催化Y-氨基丁酸的合成。在此基础上，本发明建立了一个有效的转化体系，前期利用天津短杆菌SW07-1进行谷氨酸发酵，再利用植物乳杆菌GB01-21将发酵液中的谷氨酸转化为Y -氨基丁酸，减少底物谷氨酸的添加量，节约了 Y-氨基丁酸的制备成本。
发明内容
本发明的目的是利用相对廉价的葡萄糖为原料，通过两步发酵连续发酵生产
Y-氨基丁酸，即第一步采用谷氨酸生产菌株将葡萄糖转化为谷氨酸，第二步采用全细胞转化的方法，将能产生谷氨酸脱羧酶的菌株添加到谷氨酸发酵液，建立稳定的转化体系，催化谷氨酸脱羧形成Y-氨基丁酸，为微生物发酵法生产Y-氨基丁酸提供了一个新思路以及一个切实可行的新工艺，从而可以降低Y-氨基丁酸的生产成本。本发明的技术方案:本发明提供了一种利用天津短杆菌SW07-1和植物乳杆菌GB01-21混合发酵高产Y-氨基丁酸的方法。首先利用天津短杆菌SW07-1将葡萄糖转化为谷氨酸，再通过植物乳杆菌GB01-21将上步发酵液中的谷氨酸转化为Y-氨基丁酸。具体过程为先将第一步谷氨酸发酵所得发酵液的PH调到谷氨酸脱羧酶的最适pH，添加缓冲成分，构成稳定的转化体系；再将第二步发酵液经过滤或者离心的方法得到谷氨酸脱羧酶生产菌株植物乳杆菌GB01-21的菌体，将其添加到谷氨酸发酵液转化体系中进行全细胞转化。实现本发明方法的步骤如下:(1)培养基的制备:培养基中必须具备微生物生长所需的营养成分，即碳源、氮源、无机盐、生长因子等。碳源主要有葡萄糖、糖蜜、淀粉、淀粉水解物等；氮源主要有玉米浆、酵母膏、酵母粉、蛋白胨、酪蛋白水解物、其他含氮有机物尿素、氨基酸等以及含氮无机物氨水、硫酸铵和氯化铵等。以及磷酸盐(磷源)和硫酸盐(硫源)等。另外，培养基中除加入以上碳源和氮源等外，还需适量加入所使用微生物必须的金属离子、维生素和氨基酸等。金属离子等微量元素的含量大约在0.01mg/L-50mg/L的范围内。以糖质为原料生产谷氨酸的棒杆菌一般都是生物素要求性的，所以为了大量积累谷氨酸就必须严格控制增值环境，把生物素限定在菌体生长的亚适量范围内，培养基需要在115°C下灭菌15-20min方能使用。 (2)种子培养:种子培养在摇瓶中进行，将保存菌种分别接入各自的活化培养基，每种微生物在各自的最适培养条件下培养相应时间，再以2%的接种量接种至种子培养基，适宜条件下培养。(3)谷氨酸的发酵:在发酵罐中进行，以10%接种量接种至5L发酵罐。发酵罐中装液量为2L-2.5L，通气量1.5-2L/(min *L)，氨基酸的发酵可通过流加氨水来控制pH，根据溶氧需求调节转速，培养温度一般控制在30°C左右。谷氨酸的发酵对于通风量以及pH的控制要求是比较严格的。通风量的不足会大大降低溶氧，从而导致其他有机杂酸生成量增加。谷氨酸的发酵需要添加NH4+源(氨水)，若NH4+供给量不足会大量积累α-酮戊二酸、柠檬酸及琥珀酸等有机酸，而不合成谷氨酸。(4) Y-氨基丁酸生产菌株植物乳杆菌的培养及收集:植物乳杆菌属于乳酸菌类，一般适宜的培养基为MRS培养基。因此可将保藏的植物乳杆菌经MRS培养基进行活化，再接种至菌株适合表达谷氨酸脱羧酶的培养基中进行培养。植物乳杆菌为厌氧细菌(兼性好氧)，培养时可静置培养。培养后的菌体经离心收集备用。(5)谷氨酸发酵液直接转化:寻找适宜谷氨酸脱羧酶作用的缓冲液，按照缓冲液的配制方法向谷氨酸发酵液中加入对应量缓冲物质，构成缓冲体系。同时，将前一步收集到的植物乳杆菌加入到缓冲体系中，作为转化体系，在谷氨酸脱羧酶的最适温度、pH等条件下进行转化，定时检测发酵液中残留谷氨酸含量以间接估算Y-氨基丁酸的合成情况。(6)底物与产物的的定性与定量分析:葡萄糖和谷氨酸的实时检测通过生物传感器进行测定。Y-氨基丁酸通过氨基酸测定仪测定。利用氨基酸测定仪分别测定标准样品
Y-氨基丁酸和转化液各自的出峰时间和峰面积，即可以对转化液中Y -氨基丁酸进行定性与定量检测。本发明的有益效果:本发明提供了一种利用天津短杆菌和植物乳杆菌混合发酵高产Y-氨基丁酸的方法，建立了一种能够直接将谷氨酸发酵液中的谷氨酸转化Y-氨基丁酸的稳定的转化体系。本发明可利用廉价的葡萄糖为原料，通过两步连续发酵生产Y-氨基丁酸，即第一步采用谷氨酸生产菌株将葡萄糖转化为谷氨酸，第二步采用全细胞转化的方法，将能产生谷氨酸脱羧酶的菌株添加到谷氨酸发酵液，催化谷氨酸脱羧形成Y -氨基丁酸，为微生物发酵法生产Y-氨基丁酸提供了一个新思路以及一个切实可行的新工艺，从而可以降低Y-氨基丁酸的生产成本。同时，本发明可应用到味精厂等，充分利用谷氨酸发酵液，开拓新工艺，提高生产效益。此发明中使用的菌株均为食品安全菌株，提高了安全性。
图1谷氨酸发酵液原有谷氨酸直接转化过程中底物与产物含量变化曲线图中实线为L-谷氨酸变化曲线，虚线为Y-氨基丁酸变化曲线。图2氨基酸测定仪测定转化液中底物与产物的含量图谱具体实施方法
实施例1:培养基，分述如下:(I)天津短杆菌SW07-1①活化培养基:蛋白胨1，酵母膏0.5，NaCll，葡萄糖0.5，115°C灭菌15min种子培养基:葡萄糖30，玉米浆25，KH2PO4.3Η201.5，MgSO4.7Η200.4，尿素6 (分消)，PH7.0-7.2，115°C灭菌15min ;③发酵培养基(g/L):葡萄糖140，玉米浆3，尿素5.5 (分消)，KH2PO4.3Η201.5，MgSO4.7Η200.8，MnSO4.H2O0.02，FeSO4.7Η200.02，生物素 8Χ 10_5，L-组氨酸 5Χ 1θΛ ρΗ7.0-7.2，115°C灭菌 15min。(2) L.plantarum GBO1-21①活化培养基(g/L):MRS培养基。酪蛋白胨10，牛肉提取物10，酵母提取物5，葡萄糖5，乙酸钠5，柠檬酸二胺0.2，吐温0.1，磷酸氢二钾0.2，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，碳酸钙20，pH6.5，115°C灭菌15min;②种子培养基(g/L):TYG液体培养基。胰蛋白胨5，酵母膏5，葡萄糖 10, 丁二酸钠 5, pH6.5,115°C灭菌 15min。实施例2:天津短杆菌SW07-1的谷氨酸发酵及L.plantarum GBO1-21的收集谷氨酸生产菌株天津短杆菌SW07-1的培养:将保存菌种接入活化培养基，30°C，220r/min往复式摇床振荡培养12h，再以2 %的接种量接种至种子培养基，30°C，220r/min往复式摇床培养12h。再以10%接种量接种至5L发酵罐。发酵罐中装液量为2.5L，通气量
3.5L/min，流加氨水控制pH7.0-7.2，根据溶氧需求调节转速400_600r/min，30°C培养36h。通过流加适量葡萄糖，最终发酵液中谷氨酸含量约90g/L左右。
植物乳杆菌的收集:将保存菌种接入活化培养基MRS培养基，300C，静置培养ld，再以12%的接种量接种至装有3L无菌TYG液体培养基的5L发酵罐中，搅拌速度和通气量分别为 300r/min、1.25L/min, 30°C培养 36h。4000r/min 离心 IOmin 收集菌体。实施例3:谷氨酸发酵液直接转化按照醋酸缓冲液的配制方法向天津短杆菌SW07-1谷氨酸发酵液中加入对应量的无水乙酸钠和冰醋酸，构成0.2mol/L, pH5.0的醋酸缓冲体系。同时，将前一步收集到的植物乳杆菌加入到缓冲体系中(添加的菌体量按照植物乳杆菌培养液体积:谷氨酸发酵液体积=3: 2来计算)，作为转化体系，搅拌速度和通气量分别为150r/min、0.5L/min，30°C进行转化，定时检测发酵液中残留谷氨酸含量。如图1所示为转化过程中谷氨酸发酵液中原有谷氨酸含量变化曲线，曲线显示，发酵液中原有谷氨酸在转化20h时基本转化完毕。转化液中Y-氨基丁酸为59.2g/L,摩尔转化率为93.6%。实施例4:添加外源谷氨酸继续转化
根据研究室先前对L.P lantarum GBO1-21转化谷氨酸为Y _氨基丁酸的能力的研究，单单利用谷氨酸发酵液中原有的90g/L的谷氨酸作为底物还远远不够。本发明继续向转化体系中加入60g/L的外源谷氨酸作为底物继续转化。最终转化液中Y-氨基丁酸含量为96.5g/L，摩尔转化率为91.8 %。转化液用氨基酸测定仪测定Y-氨基丁酸含量，如图2所示，转化液中对应的出峰时间2.659min的物质为L-谷氨酸，对应的出峰时间10.119的物质为Y-氨基丁酸。
权利要求
1.一种利用天津短杆菌和植物乳杆菌混合发酵高产Y-氨基丁酸的方法，其特征是:利用廉价的葡萄糖为原料，通过两步连续发酵生产Y -氨基丁酸，第一步采用谷氨酸生产菌株天津短杆菌SW07-1将葡萄糖转化为谷氨酸，第二步采用全细胞转化的方法，将能产生谷氨酸脱羧酶的菌株L.Plantarum GB01-21添加到谷氨酸发酵液,建立稳定的转化体系,催化谷氨酸脱羧形成Y-氨基丁酸。
2.权利要求1中第一步用天津短杆菌SW07-1的发酵谷氨酸的方法，其特征是:将保存菌种接入活化培养基，30°C，220r/min往复式摇床振荡培养12h，再以2%的接种量接种至种子培养基，30°C，220r/min往复式摇床培养12h，再以10%接种量接种至5L发酵罐，发酵罐中装液量为2.5L，通气量3.5L/min，流加氨水控制pH7.0-7.2，根据溶氧需求调节转速400-600r/min，30°C培养36h ;最终发酵液中谷氨酸含量约90g/L左右。
3.权利要求1中第二步植物乳杆菌的培养与菌体收集方法，其特征是:将保存菌种接入活化培养基MRS培养基，30°C，静置培养ld，再以12%的接种量接种至装有3L无菌TYG液体培养基的5L发酵罐中，搅拌速度和通气量分别为300r/min、1.25L/min, 30°C培养36h，4000r/min离心IOmin收集菌体。
4.权利要求1中第二步全细胞转化方法，其特征是:按照醋酸缓冲液的配制方法向天津短杆菌谷氨酸发酵液中加入对应量的无水乙酸钠和冰醋酸，构成0.2mol/L, pH5.0的醋酸缓冲体系，同时，将前一步收集到的植物乳杆菌加入到缓冲体系中(添加的菌体量按照植物乳杆菌培养液体积:谷氨酸发酵液体积=3: 2来计算)，作为转化体系，搅拌速度和通气量分别为150r/min、0.5L/min，30°C进行转化20h，发酵液中原有谷氨酸转化完毕，继续向转化体系中加入60g/L的外源谷氨酸作为底物，继续转化。
5.权利要求4中的底物与产物的定性与定量分析以及菌体生长情况的监测方法，其特征是发酵液中葡萄糖和 谷氨酸的实时检测通过SBA-40B生物传感分析仪测定；Y -氨基丁酸通过氨基酸测定仪测定；利用氨基酸测定仪分别测定标准样品Y-氨基丁酸和转化液各自的出峰时间和峰面积，即可以对转化液中Y -氨基丁酸进行定性与定量检测。
全文摘要
一种利用天津短杆菌和植物乳杆菌混合发酵高产γ-氨基丁酸的方法，属于发酵工程和酶工程领域。本发明利用天津短杆菌SW07-1将葡萄糖转化为谷氨酸，再经植物乳杆菌GB01-21将上步发酵液的谷氨酸转化为γ-氨基丁酸。转化前，谷氨酸发酵液调到谷氨酸脱羧酶最适pH，建立转化体系，第二步发酵液经过滤或离心的方法得到植物乳杆菌GB01-21的菌体，将其添加到转化体系进行全细胞转化。发酵液原有谷氨酸转化完毕时转化液γ-氨基丁酸为59.2g/L，摩尔转化率为93.6％。继续添加外源谷氨酸转化完毕后GABA含量为96.5g/L，摩尔转化率为91.8％。
文档编号C12P13/00GK103243128SQ20131019628
公开日2013年8月14日 申请日期2013年5月24日 优先权日2013年5月24日
发明者饶志明, 孙红梅, 李秀鹏, 徐美娟 申请人:江南大学