专利名称：羊传染性脓疱病毒pcr诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种羊传染性脓疱病毒PCR诊断试剂盒。
背景技术：
羊传染性脓疱病(Contagious ethyma )俗称羊口疮,是由羊传染性脓疱病毒(.0rf 引起的一种接触性、嗜上皮性人畜共患传染病。该病毒主要危害3 6月龄羔羊和部分成年羊，羔羊发病率可高达100%，临床症状表现为嘴唇、口黏膜部分皮肤红疹、脓疱、溃疡和结痂。近年来随着全国各地肉羊产业的发展，引羊频繁，该病成暴发趋势，给养羊业带来了巨大的经济损失。
发明内容
本发明的目的是:提供一种羊传染性脓疱病毒PCR诊断试剂盒，它可以快速检测羊传染性脓疱病毒，并且简便、灵敏、准确、特异性强。本发明是这样实现的:羊传染性脓疱病毒PCR诊断试剂盒，它包括250 μ L的PCR premix 缓冲液，150 μ L 超纯水，50 μ L 的 Marker DL2000，40 μ L 浓度为 IOMmol/L的上引物及40yL浓度为10Mmol/L的下引物，20 μ L阴性对照以及20 μ L阳性对照；上游引物的序列为:5' -AGTCCGCGAAGAAGTTTTTGTAC-3' ;下游引物的序列为:5' -TTCATGAGGTCCCAGGCCAGGT-3'。阴性对照为超纯水。阳性对照为标准羊传染性脓疱病毒的PCR产物。
PCR premix 缓冲液由 3 mmol/ul 的 MgCl2, 500pmol/ul 的 dNTP 2.0 μ L, 25mmol/μ L 的 Tris-HCl 及 0.2 μ L Taq 酶组成，其 PH 值为 ρΗ8.3。试剂盒的保存期检测:
将试剂盒保存在4°C、_20°C分别于I月、3月、6月、I年，对阳性样品进行检测，4°C保存I年条带较淡，一 20°C保存I月、3月、6月、I年条带亮度无影响。本发明根据GenBank中的羊传染性脓疱病毒(ORFV) B2L基因序列，设计合成I对引物，通过对PCR条件的优化，敏感性、特异性试，成功建立了羊传染性脓疱病毒的PCR诊断方法。CBP基因是对宿主有致病性的毒力因子和免疫调节作用的细胞因子，它主要通过与一些免疫调节因子结合并降低其活性，进而干扰或破坏宿主的免疫反应，阻碍获得性免疫的产生,导致机体的免疫力下降,从而对宿主产生致病性。本发明根据GenBank中的ORFV的CBP基因的序列，设计合成I对特异性引物，以ORFV贵州分离株作为模板，成功克隆出ORFV的CBP基因，同时进行同源性分析与抗原指数预测，为ORFV的流行病学调查和CBP基因表位疫苗研究奠定基础。为了验证本发明的技术效果，进行了以下实验:
羊传染性脓疱病毒PCR诊断方法的建立I材料与方法
1.1病毒和细菌
羊传染性脓疱病毒贵州分离株、丝状霉形体山羊亚种为本研究室保存。口蹄疫灭活疫苗，购自金宇保灵生物药品有限公司；山羊痘病毒标准弱毒株(B株)，购自中国兽医药品监察所。1.2主要试剂
Goldview、Tris、EDTA、DL2000、PCR premix缓冲液等购自宝生物(大连)工程有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由宝生物(大连)工程有限公司合成。1.3引物设计
根据GenBank中的羊传染性脓疱病毒(ORFV) B2L基因序列，设计合成I对引物，引物序列为上游引物:5'-AGTCCGCGAAGAAGTTTTTGTAC-3' ;下游引物:5'_TTCATGAGGTCCCAGGCCAGGT-3'，预计扩增目的片段大小为361bp。1.4病毒核酸的抽提
羊传染性脓疱病毒、山羊痘病毒以及口蹄疫灭活疫苗在-80°C反复冻融3次，12000 r/min离心5 min，取上清用于病毒核酸的提取。临床样品:取0.5 g病羊脓疱和疣状痂皮加入0.5 mL 0.1 mo I/L PBS -80°C反复冻融3次，研磨制成悬液，然后转移至1.5 mL离心管中。12000 r/min离心5 min，取上清液用于病毒核酸的提取。病毒DNA/RNA的提取参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA和RNA于_70°C保存。丝状霉形体山羊亚种参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行，将提取的DNA -20°C保存。 1.5 PCR反应条件的优化 对？0 反应条件，包括退火温度(501:、551:、60°0，引物浓度(5 Mmol/LUO Mmol/L、
20 Mmol/L),PCR premix 12.5μ 进行优化，以确定最佳反应条件，同时以ddH20作为阴性对照。PCR 反应在 25 PL 反应体系中进行，引物 2 μ (5 Mmol/L、10 Mmol/L,20 Mmol/L),PCRpremix 12.5PL、模板 μ L,用 ddH20 补足至 25 PL。反应条件为:94°C 5 min ；94°C I min,退火温度(501:、551:、60°0 I min,72°C I min，30 个循环；最后 72°C延伸 10 min。取 5μ PCR扩增产物于15 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。1.6敏感性试验
将提取的羊传染性脓疱病毒核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后，经10倍系列稀释的病毒核酸用于PCR反应，以确定建立的PCR反应的敏感性。1.7特异性试验
以提取的羊传染性脓疱病毒、山羊痘病毒、丝状霉形体山羊亚种DNA为模板分别进行PCR反应，FMDV反转录为cDNA进行PCR反应，用ddH20作为空白对照，以确定建立的PCR反应的。1.8重复性试验
应用建立PCR方法，重复检测ORFV DNA 3次以检验结果的可靠性。1.9 PCR对临床样品的检测
对2009年至2012年贵州省贵阳市、遵义市、安顺市、六盘水市、铜仁地区养羊场和养羊专业户采集的92份病料应用建立的PCR诊断方法进行检测。2 结果
2.1 PCR检测方法的建立
PCR检测方法在25 PL反应体系中最佳反应条件为，退火温度55°C，PCR premix12.5μ ，引物浓度10 Mmol/L，扩增目的片段大小为361 bp，PCR扩增片段经胶回收，送大连宝生物工程有限公司测序，结果表明，扩增片段为ORFV的特异性条带，结果见图1。2.2敏感性试验
将提取的羊传染性脓疱病毒核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后，经10倍系列稀释的病毒核酸用于PCR反应，病毒的最低检测量为1.2 fg/^L，结果见图2。2.3特异性试验
以提取的羊传染性脓疱病毒、山羊痘病毒、丝状霉形体山羊亚种DNA为模板分别进行PCR反应，FMDV反转录为cDNA进行PCR反应，用ddH20作为阴性对照，均未扩增出条带，而ORFV DNA扩增出特异性条带，结果见图3。2.4重复性试验
应用建立的PCR方法，重 复检测ORFV DNA样品3次，结果均一致。2.5多重PCR对临床样品的检测
对2009年至2012年贵州省贵阳市、遵义市、安顺市、六盘水市、铜仁地区、瓮安县养羊场和养羊专业户采集的92份病料应用建立的PCR诊断方法进行检测，92份病料中有84份为阳性，阳性率，为91.3% (84/92)。3 讨论
目前检测羊传染性脓疱病毒的方法很多，如电镜观察、病毒分离、接种试验、血清学、琼脂免疫扩散法[4_5]。B2L基因编码42ku蛋白，该蛋白可刺激机体产生强烈的抗体反应，该基因具有较高的保守性常用于病毒分子诊断方法的建立和遗传进化关系分析[6_8]。本研究根据GenBank中的羊传染性脓疱病毒(0RFV)B2L基因序列，设计合成I对引物，通过对PCR条件的优化，敏感性、特异性试验，成功建立了羊传染性脓疱病毒的PCR诊断方法。特异性与敏感性结果显示，最低核酸检测量为1.2 fg/^L，而口蹄疫病毒、山羊痘病毒、丝状霉形体山羊亚种的扩增结果均为阴性，表明该本发明的特异性好、敏感性高，可对临床病料进行快速检测。目前在我国县级畜牧兽医站基本都配备了 PCR检测相关仪器设备，本研究建立的PCR检测方法能够在省地县级畜牧兽医站进行推广应用。目前有很多关于羊传染性脓疱病毒的病例诊断及治疗报道，但是该病毒CBP基因的基因研究报道较少。王改丽等参照GenBanK中ORFV的CBP基因的核苷酸序列设计合成I对特异性引物，采用PCR方法扩增该基因片段，并克隆入原核表达载体PGEX-4T-1中进行诱导表达，抗原性分析表明该融合表达蛋白具有良好的免疫原性，但该研究未进行该基因和编码的蛋白的同源性分析。向智龙等利用贵州株的B2L基因进行同源性分析表明该贵州株与湖北株亲缘关系较近。赵魁等利用长春地方株的FlL基因进行同源性分析，表明该长春地方株ORFV与ORFV C2和ORFV mi_90株的亲缘关系较近。本研究同源性分析表明，核苷酸与GenBank中ORFV的CBP基因的相似性99.4% 88.8%，氨基酸序列相似性99.2% 88.6%。遗传进化树结果表明，ORFV贵州分离株与ORFV OV SAOO株的亲缘关系较近，这为ORFV分子流行病学研究以及疫苗毒株的使用奠定了基础。
由于采用了上述技术方案，本发明采用对CBP基因编码的氨基酸序列进行抗原指数预测，主要区域为 His7 Trp59、Leu74 Serl24、Asnl35 Alal48、Hisl50 Leul64,这些区域可能是B细胞表位优势区域，具有良好的免疫原性，为ORFV CBP基因的克隆表达以及表位疫苗研究奠定了基础。根据以上研究设计的引物，将其应用在PCR快速检测试剂盒中，可快速检测出羊传染性脓疱病毒，并且具有良好的特异性及敏感性。本发明检测结果准确，并且快捷、灵敏，检测方式简单，使用效果好。
附图1为PCR检测方法的建立；
M: DL2000 ；1:0RFV PCR 产物；2:空白对照；
附图2为ORFV PCR敏感试验；
M: D2000 ;1 8:1.2X IO6 fg/μ 1.2X KT1 fg/μ 的病毒 DNA PCR 结果；
附图3为ORFV PCR特异性试验；
M: DL2000 ；1:0RFV P CR产物；2:GPV PCR产物；3 -Mccp PCR产物；4: FMDV PCR产物；5: ddH20。
具体实施例方式本发明的实施例:羊传染性脓疱病毒PCR诊断试剂盒，它包括250yL的PCR premix 缓冲液，150 μ L 超纯水，50 μ L 的 Marker DL2000，40 μ L 浓度为 IOMmol/L的上引物及40 μ L浓度为10Mmol/L的下引物，20 μ L阴性对照以及20 μ L阳性对照；上游引物的序列为:5' -AGTCCGCGAAGAAGTTTTTGTAC-3' ;下游引物的序列为:5' -TTCATGAGGTCCCAGGCCAGGT-3' ；阴性对照为超纯水；阳性对照为标准羊传染性脓疱病毒的PCR 产物；PCR premix 缓冲液由 3 mmol/ul 的 MgCl2, 500pmol/ul 的 dNTP 2.0 μ L, 25mmol/μ L 的 Tris-HCl 及 0.2 μ L Taq 酶组成，其 PH 值为 ρΗ8.3。
权利要求
1.一种羊传染性脓疱病毒PCR诊断试剂盒，其特征在于:它包括250 μ L的PCR premix缓冲液，150 μ L超纯水，50 μ L的Marker DL2000，40 μ L浓度为IOMmoI/L的上引物及40 μ L浓度为lOMmol/L的下引物，20yL阴性对照以及20yL阳性对照；上游引物的序列为:.5' -AGTCCGCGAAGAAGTTTTTGTAC-3' ;下游引物的序列为:5'_ TTCATGAGGTCCCAGGCCAGGT-3'。
2.根据权利要求1所述的羊传染性脓疱病毒PCR诊断试剂盒，其特征在于:阴性对照为超纯水。
3.根据权利要求1所述的羊传染性脓疱病毒PCR诊断试剂盒，其特征在于:阳性对照为标准羊传染性脓疱病毒的PCR产物。
4.根据权利要求1所述的羊传染性脓疱病毒PCR检测试剂盒，其特征在于:PCRpremix缓冲液由 3 mmol/ul 的 MgCl2, 500pmol/ul 的 dNTP 2.0 μ L, 25mmol/μ L 的 Tris-HCl 及.0.2yL Taq酶 组成，其PH值为ρΗ8.3。
全文摘要
本发明公开了一种羊传染性脓疱病毒PCR诊断试剂盒，它包括PCRpremix缓冲液，超纯水，MarkerDL2000，上引物及、下引物，阴性对照以阳性对照；上游引物的序列为5`-AGTCCGCGAAGAAGTTTTTGTAC-3`；下游引物的序列为5`-TTCATGAGGTCCCAGGCCAGGT-3`。本发明采用对CBP基因编码的氨基酸序列进行抗原指数预测，主要区域可能是B细胞表位优势区域，具有良好的免疫原性，为ORFVCBP基因的克隆表达以及表位疫苗研究奠定了基础。根据以上研究设计的引物，将其应用在PCR快速检测试剂盒中，可快速检测出羊传染性脓疱病毒，并且具有良好的特异性及敏感性。
文档编号C12Q1/68GK103225003SQ20131018217
公开日2013年7月31日 申请日期2013年5月17日 优先权日2013年5月17日
发明者余波, 冉懋韬, 谭诗文, 徐景峨 申请人:贵州省畜牧兽医研究所