专利名称：一种小麦白粉病菌菌株的长期保存方法
技术领域：
本发明涉及作物病原菌保存方法的技术领域，尤其涉及一种小麦白粉病菌单孢菌株的长期保存方法。
背景技术：
小麦(Triticum aestivum L.)是现今世界上最重要的粮食作物之一，其产量和品质极易受细菌、真菌、病毒等病害影响。在小麦病害中，白粉病是发生范围最广、对产量影响较大的病害之一。小麦受白粉菌危害后，在叶片和穗子上出现粉状斑点，严重时叶片发黄早枯，植株矮小细弱，光合作用降低，呼吸作用加强，分蘖数减少，成穗率降低，千粒重下降，一般可减产5% 10%，流行时可使小麦减产10% 30%。小麦白粉病是由白粉菌(Blumeria graminis f.sp.tritici, Bgt)引起的真菌病害，其病原菌是专化型的活体寄生菌，不能在人工培养基上生长。病菌的繁殖转接均需在小麦活体幼苗上每隔10天左右进行一次(常规保存方法)。此外，分生孢子的繁殖收集耗时长，工作量大，另一方面往往会产生交互污染，致使特定致病性菌株的丢失。因此，建立长期保存方法可以该病菌种群遗传多样性、分子抗药性监测大大缩减时间加快实验进度。同时，保存的不同白粉病菌致病型菌株接种小麦品种，可全面、准确评价品种的抗病性，为小麦育种提供辅助。
因此，人们迫切希望在实验室条件下,寻求一种操作简便、省时省力、节能、并能减少交互感染，延长小麦白粉病菌株保存时间的方法，以便于开展小麦白粉菌毒性变异及寄主与病原菌互作关系的研究。
发明内容
本发明的目的是，针对现行小麦白粉病原菌在小麦活体保存上所存在的保存期短、费时、费工及在频繁转接过程中易产生交互污染等的缺陷，提出一种操作简便、省时省力、并能较少不同菌株间的交互污染，能较长时间保存小麦白粉病菌株的方法，以保证小麦白粉病原菌相关研究工作的正常开展。本发明目的通过以下技术方案来实现:本发明一方面涉及一种小麦白粉病菌菌株的长期保存方法，其特征在于包括如下步骤:(I)单孢菌株的采集:从田间采集仅带有单个孢子堆的小麦叶片，叶片正面朝上放在含苯骈咪唑的琼脂保鲜培养基上，在超净台中用牙签挑取孢子轻轻涂抹叶片上，置于生长间培养(17 土 IV，17-19h光照/天)8-10天，待产生大量新鲜分生孢子，作为初繁菌株备用;(2)单孢菌株的扩繁:将上述小麦植株第一叶剪成2.5-3.5cm长叶段摆满在含有苯并咪唑的保鲜培养基上，在接种塔内对上述离体叶段接种预先初繁繁殖好的新鲜分生孢子，置于生长间培养(17± 1°C，17-19h光照/天)8-10天，产生大量新鲜的分生孢子，待收集保存；(3)分生孢子的收集:在超净工作台上对(2)产生的分生孢子进行收集，将培养皿倒扣在硫酸纸上，轻轻用镊子敲打2-3次，收集到离心管中，每收集一个菌株更换一张硫酸纸，防止菌株间的交互污染；(4)硅胶缓慢干燥:将直径3-6mm硅胶颗粒置于离心管中，置于23土 TC下干燥4_6h，然后用封口膜密封再置于-70°C超低温冰箱保存。在本发明的一个优选实施方式中，所述的超低温冰箱保存的时间为1，3，6或12月以上。在本发明的一个优选实施方式中，所述的保鲜剂由每百毫升蒸馏水加入0.4-0.6g琼脂+2-4mL0.1-0.3%的苯并咪唑配制而成。在本发明的另一个优选实施方式中，所述的方法还包括菌株的复活步骤，所述的复活步骤为将步骤(4)所述的离心管放入4°C冰盒中使其缓慢升温，然后按照步骤(I)所述的方法接种到新鲜的叶段中。在本发明的另 一个优选实施方式中，所述的菌株的复活率为90%以上，优选为100%。本发明能够使小麦白粉病菌的保存时间更长，由常规的方法10-12d延长至I年，且方法简便实用。克服了常规保存方法操作繁琐、耗费人力、物力较大等缺点，以保证小麦白粉病原菌相关研究工作的正常开展。本发明可以在小麦病害研究与育种机构中推广应用。
图1:低温保存12月后囷株致病力实验结果。
具体实施例方式通过以下实施例对本发明做进一步的详细说明，小麦广谱高感白粉病品种:郑麦98，苯并咪唑:化学纯，国药集团化学试剂公司；干燥硅胶:美国西格玛奥德里奇公司生产琼脂:化学纯，北京鼎国生物技术有限公司；封口膜:美国parafilm公司生产；实施例1、小麦白粉病菌菌株缓慢干燥长期保存该方法按以下步骤进行:1、单孢菌株的采集与扩繁:菌株采集前10天先播种广谱高感小麦白粉病菌品种“郑麦98”至一叶一心，备用；从田间采集仅带有单个孢子堆的叶片，剪取预先准备好的小麦植株第一叶中断3cm长，叶片正面朝上放在含苯骈咪唑的琼脂保鲜培养基上，在超净台中用牙签挑取孢子轻轻涂抹叶片上，置于生长间培养(17土 l°C，18h光照)8-10天，待产生大量新鲜分生孢子，作为初繁菌株备用。将上述小麦植株第一叶剪成3cm长叶段摆满在鲜培养基上(由IOOmL蒸馏水+0.5g琼脂+3mL0.2%的苯并咪唑比例配制而成)，在接种塔(15 X 22 X 22cm)内对上述离体叶段接种预先初繁繁殖好的新鲜分生孢子，置于生长间培养(17 土 IV，18h光照/天)8-10天，产生大量新鲜的分生孢子，待收集保存；2、分生孢子的收集:在超净工作台上对(I)产生的分生孢子进行收集，将培养皿倒扣在硫酸纸上，轻轻用镊子敲打培养皿盖2-3次\，收集到1.5mL离心管中，每收集一个菌株都需更换一张硫酸纸，防止菌株间的交互污染。同时用75%酒精对超净台灭菌。收集到的分生孢子质量以20mg左右为宜；3、硅胶缓慢干燥:将3-4块的硅胶颗粒(直径3-6_)置于步骤(2)离心管中，置于23°C下干燥5h，然后用封口膜密封再置于-70°C超低温冰箱保存1，3，6和12月；4、分生孢子的致病力测定:在实际应用中，可将步骤(3)所述的离心管放入4°C冰盒中使其缓慢升温，以免孢子骤热开裂，然后按照步骤(I)所述的方法接种到新鲜的叶段中。置于生长间中培养(17±l°C，18h光照)8-10天。观察孢子致病力；5、比较不同保存时间下菌株的复活率:按照该方法进行不同保存时间下菌株复活率的比较。共计保存20个菌株，保存时间分别为1，3，6和12月，以常规方法保存作为对照。通过致病力检测表明，采用该方法菌株能够存活至少12月，且菌株的复活率为100% (表I和图1)，而常规保存虽然也能达到100%复活率，但要每隔10天转接种I次，耗时费工，不适合大规模保存菌株，而本发明的方法所保存的菌株I年接种一次。表I不同保存时间下小麦白粉菌株存活率的比较(20个菌株)
权利要求
1.一种小麦白粉病菌菌株的长期保存方法，其特征在于包括如下步骤: (1)单孢菌株的采集:从田间采集仅带有单个孢子堆的小麦叶片，叶片正面朝上放在含苯骈咪唑的琼脂保鲜培养基上，在超净台中用牙签挑取孢子轻轻涂抹叶片上，置于生长间培养(17土 TC，17-19h光照/天)8-10天，待产生大量新鲜分生孢子，作为初繁菌株备用； (2)单孢菌株的扩繁:将上述小麦植株第一叶剪成2.5-3.5cm长叶段摆满在含有苯并咪唑的保鲜培养基上，在接种塔内对上述离体叶段接种预先初繁繁殖好的新鲜分生孢子，置于生长间培养(I 7 ± I °C，17-19h光照/天)8-10天，产生大量新鲜的分生孢子，待收集保存； (3)分生孢子的收集:在超净工作台上对(2)产生的分生孢子进行收集，将培养皿倒扣在硫酸纸上，轻轻用镊子敲打2-3次，收集到离心管中，每收集一个菌株更换一张硫酸纸，防止菌株间的交互污染； (4)硅胶缓慢干燥:将直径3-6mm硅胶颗粒置于离心管中，置于23±1°C下干燥4_6h，然后用封口膜密封再置于-70°C超低温冰箱保存。
2.按照权利要求1所述的方法，所述的超低温冰箱保存的时间为1，3，6或12月以上。
3.按照权利要求1所述的方法，所述的保鲜剂由每百毫升蒸馏水加入0.4-0.6g琼脂+2-4mL0.1-0.3%的苯并咪唑配制而成。
4.按照权利要求1所述的方法，，所述的方法还包括菌株的复活步骤，所述的复活步骤为将步骤(4)所述的离心管放入4°C冰盒中使其缓慢升温，然后按照步骤(I)所述的方法接种到新鲜的叶段中。
5.按照权利要求4所 述的方法，所述的菌株的复活率为90%以上，优选为100%。
全文摘要
本发明公开了一种小麦白粉病菌菌株长期保存方法，该方法包括(1)单孢菌株的扩繁；(2)分生孢子的收集；(3)硅胶缓慢干燥5h后；再置于-70℃冰箱保存等步骤。本发明能够使小麦白粉病菌的保存时间更长，由常规的方法10-12d延长至1年，且方法简便实用。克服了常规保存方法操作繁琐、耗费人力、物力较大等缺点，以保证小麦白粉病原菌相关研究工作的正常开展。本发明可以在小麦病害研究与育种机构中推广应用。
文档编号C12N1/04GK103224888SQ201310180918
公开日2013年7月31日 申请日期2013年5月13日 优先权日2013年5月13日
发明者喻大昭, 龚双军, 杨立军, 曾凡松, 史文琦, 向礼波, 汪华, 张学江, 薛敏峰 申请人:喻大昭