一种ev71病毒样颗粒及其制备方法与应用的制作方法

专利名称：一种ev71病毒样颗粒及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种肠道病毒71型病毒样颗粒及其制备方法，以及以其制备的手足口病疫苗。
背景技术：
手足口病(HFMD)是肠道病毒引起的常见传染病之一。5岁以下婴幼儿发病率最高。每年6 8月为流行季节，传播途径主要是呼吸道和经口感染。本病传染性强，传播途径广，传播快，流行强度大，在短期内即可造成大流行。肠道病毒71型(enter0VirUS71， EV71)和柯萨奇病毒A16 (CA16)是本病的主要致病原。较CA16而言，EV71型肠病毒则凶险得多，90%以上的重症病例和死亡病例都是由EV71病毒引起。EV71病毒可侵犯心、脑、肾等重要器官，导致了严重的并发症，如急性弛缓性麻痹、脑炎、无菌性脑膜炎、心肌炎、肝炎、新生儿败血症等，对儿童身心健康造成严重威胁。近年来手足口病在我国持续高发，卫生部公布的数据显示，2012年全国累计报告手足口病发病219.8万余例，死亡病例569例，较2011 年的发病率和死亡率均有增长。从近几年的情况看，我国每年的患者人数多、增长速度快、 分布广、大部分还在不发达地区，给国家带来了巨大损失，同时也影响着社会安全。手足口病已经成为了党和政府及民众关注的焦点。
目前全世界对手足口病的预防还没有可用的疫苗上市销售，对感染的病人亦没有有效的治疗药物。国际上尽管有亚单位疫苗、DNA疫 苗和减毒活疫苗研究进展方面的报道， 但都没有达到满意的动物保护效果。某些减毒活疫苗存在毒力回复的风险，并且还能导致轻度的神经性临床症状，疫苗的安全性还存在不确定因素。现已知向国家药监局申报的 EV71疫苗都属于灭活疫苗，此类疫苗某些抗原靶位被破坏，免疫原性较差，使用剂量过大以及目前使用的动物模型的适用性还有疑议。体外实验表明灭活EV71全病毒疫苗对临床样品分离的许多EV71病毒株没有中和作用；再者，在幼鼠感染动物模型上没有保护作用；并且灭活疫苗存在灭活不完全的风险。因此，研制高效廉价的预防性EV71疫苗，对预防EV71 感染的手足口病具有十分重要的意义。
病毒样颗粒(Virus Like Particle，VLP)疫苗的出现为研发新型安全有效的疫苗提供了一个新的契机。VLP疫苗是通过分子生物学技术，表达病毒的一个或多个结构蛋白， 这些结构蛋白具有天然的自组装配能力，可形成与天然病毒颗粒相似的空间构型和抗原表位但无病毒核酸，免疫原性强，又没有感染性，不存在灭活不完全或毒力回复的风险，并且表面有高密度的病毒抗原，保存了构象表位，可通过和全病毒疫苗一样的途径呈递给免疫细胞，有效诱导机体免疫系统产生免疫保护反应。在这一点上它还优于灭活过程中可能破坏一些重要的抗原决定簇。此外，还有一个优点是可根据其需要任意改造，使之能更好地刺激机体产生保护性免疫反应。
EV71属于小RNA病毒,病毒基因组为约7.4kb的单链RNA,病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约24 30nm。病毒粒子的衣壳由60个亚单位组成，每个亚单位均由4种衣壳蛋白(VP1-VP4)拼装成有五聚体样结构。研究表明，EV71的四种结构蛋白在细胞内可自行组装成病毒样颗粒结构(Virus Like Particle, VLP),具有与天然病毒相似的空间结构。目前国内外多家研究机构都在进行EV71病毒样颗粒疫苗的研制，EV71的组装是通过在同一细胞中共表达EV71的病毒蛋白酶3⑶及Pl前体蛋白，通过3CD蛋白酶加工处理Pl蛋白后产生4种结构蛋白，在细胞内自行组装成类病毒颗粒，该病毒颗粒不带有病毒核酸，无潜在致癌危险，具有良好的安全性，免疫特性和生物学活性，并可以大规模制备和纯化。因此，VLP疫苗已成为预防性EV71疫苗发展的主要方向。EV71VLP预防性疫苗研发的关键是能够大量高效的制备VLP样品，目前最常用的表达系统是原核表达系统和真核表达系统。原核表达系统表达的蛋白大多失去天然构象，不能产生保护性抗体。或者表达产物多为包涵体，包涵体变性、复性步骤复杂，且蛋白损失量大，收率低，很难实现大规模生产。也见可溶性表达的例子，但是表达量低，纯化目的蛋白难度大。也有报道进行融合表达增加目的蛋白可溶性及表达量，纯化相对容易，但融合蛋白的切割需要昂贵的酶，无法实现大规模生产。常用的真核表达系统有哺乳动物细胞表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统。在真核表达系统中蛋白能自发的形成VLP，为纯化工艺提供极大的便利。但是，由于目前主要用昆虫细胞制备VLP，培养条件要求较高，纯化过程复杂，限制了大规模的生产需求；另外，杆状病毒-昆虫细胞表达系统产生杆状病毒颗粒及其他明星影响疫苗效果的污染物，杆状病毒颗粒很难与制备的VLP分离，且需要进行灭活处理等措施，因此对疫苗质量有很大的影响。哺乳动物细胞表达系统对于蛋白表达后的加工修饰和正确折叠能起到作用，但是它不易人为控制而且花费高，所以应用受到了限制。多形汉逊酵母表达系统具遗传性质稳定、操作简单、易于高密度培养、外源蛋白产量高、生产成本低、适合于工业化大生产等特点，还具有原核生物表达系统所不具有的外源蛋白翻译后加工等优势，同时避免了其他酵母表达菌株不稳定、质粒易丢失、过度糖基化等缺点。是一个优于大肠杆菌和其它真核表达系统的较为先进的VLP疫苗表达系统。

发明内容
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本发明的目的在于提供一种从汉逊酵母表达系统获得的EV71病毒样颗粒。本发明的另一目的在于提供一种EV71疫苗。本发明的再一目的在于提供一种同时含有EV71病毒Pl基因和3⑶基因的重组表达载体。为了提高蛋白的表达量，本发明利用汉逊酵母偏爱密码子对所述核酸序列进行了密码子优化。本发明提供的编码Pl及3CD蛋白的基因其核苷酸序列为去掉酵母分泌信号肽的序列或被酵母识别的转录终止信号的序列。本发明编码Pl及3CD蛋白的基因的密码子使用了汉逊酵母最偏爱的密码子。汉逊酵母密码子使用频率可参见http://www.kazusa.0r.1p/codon/。为了避免翻译出来的mRNA的GC含量过高、mRNA的二级结构影响翻译的效率，本发明对某些氨基酸使用次偏爱密码，前提是该次偏爱密码与最偏爱密码使用频率非常接近，氨基酸序列原序列不变，在某些很特殊的情况下，为了减少或增加酶切位点，某些位置的序列做适当的序列调整。使用汉逊酵母密码子将肠道病毒71型Pl及3CD蛋白的多核苷酸进行优化合成，该Pl蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，其编码基因如序列表中SEQ ID N0.1所不;该3Q)蛋白的氣基酸序列如SEQ ID N0.4所不，其编码基因如序列表中SEQ ID N0.3所示。
在本发明一个实施例中，用于PCR扩增Pl基因的引物序列为: F-AGTTTTTGCCCTACTTGATCACAG, R-CGGAATTCTTATTACT GGGTCACGGCCTGTC ;用于 PCR 扩增 3CD 基因引物序列如下:F-AACCACACCCACCACGTGTACAGAAAC，R-ACTCGCTATTTC AGCTTTTCATCTC。
本发明提供的重组表达载体中，EV71病毒Pl基因其核苷酸序列是如下a)或b):
a)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所示；或
b)由SEQ ID N0.1所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码Pl蛋白的核苷酸序列。
所述EV71病毒3⑶基因其核苷酸序列是如下a)或b):
a)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.3所示；或
b)由SEQ ID N0.3所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码Pl蛋白的核苷酸序列。
其中，上述重组表达载体含有甲醇氧化酶启动子(Methanol oxidase,Μ0Χ)或甲醒脱氢酶启动子(Formate dehydrogenase, FMD)。
优选地，上述载体含有甲醇氧化酶启动子(Μ0Χ)。
更进一步地，上述重组表达载体，其为PMV-P1-3⑶。
本发明还提供了重组表达载体PMV-P1-3⑶的制备方法，包括以下步骤:
(I)蛋白基因的优化合成:使用汉逊酵母密码子将肠道病毒71型Pl及3⑶蛋白的多核苷酸进行优化合成，该Pl蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，其编码基因如序列表中SEQ ID N0.1所示；该3⑶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，其编码基因如序列表中SEQ ID N0.3所示；
(2)重组表达载体的构建:用肠道病毒EV71的Pl蛋白基因和3⑶蛋白酶基因与 PMV质粒连接后，得到PMV-P1-3CD重组表达载体。
进一步，本发明提供了含有上述重组表达载体的宿主细胞。
进一步地,所述宿主细胞为汉逊酵母(Hansenula poIymorpha)细胞。
所述汉逊酵母细胞为ATCC34438，ATCC26012。
优选地，所述汉逊酵母细胞为ATCC26012尿嘧啶缺陷性宿主细胞。本发明使用的 ATCC26012尿嘧啶缺陷性宿主细胞为多型汉逊酵母AU-0501，其已在中国专利保藏编号为 CGMCC N0.7013，已于2012年12月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏， 分类命名为多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)。
进一步，所述重组表达质粒转入汉逊酵母AU-0501细胞中，得到AU-PMV-P1-3⑶重组表达菌株。
在本发明的一个实施例中，将PMV-P1-3⑶重组表达质粒通过电转化汉逊酵母宿主菌，经过选择培养基筛选重组表达菌株；利用重组表达菌株进行发酵培养和甲醇诱导表达EV71病毒样颗粒蛋白。
因此本发明提供了重组表达载体在制备EV71病毒疫苗中的应用。
本发明通过构建并培养能 够表达EV71病毒样颗粒的汉逊酵母重组表达菌株，成功的获得了一种易于通过发酵培养，适合工业化生产，且易于纯化的EV71病毒样颗粒。该EV71病毒样颗粒，其通过以下方法制备得到:(I)将本发明的重组表达载体转入汉逊酵母AU-0501表达菌株，得到AU-PMV-P1-3⑶重组表达菌株；(2)发酵培养该重组表达菌株，(3)分离纯化EV71病毒样颗粒:离心收集菌体进行高压均浆破碎,澄清、超滤、沉淀病毒颗粒，超速离心收集上清液，上清液经离子交换层析、疏水层析或分子筛层析，纯化后获得EV71病毒样颗粒。EV71病毒样颗粒的制备方法中，所述的破碎是将AU-PMV-PI _3⑶重组表达菌株发酵得到的汉逊酵母细胞，重悬于细胞裂解缓冲液中(20mmol/L NaH2P04, 2mmol/LEDTA-Na2,0.4mol/L NaCl, pH7.5)洗 2 次，然后以 1:4(W/V)的比例悬浮于含 2mmol/L PMSF,l%Tween-20, 3%PEG6000的细胞裂解缓冲液中，使用高压匀浆机在压力IlOObar的操作压力下破碎细胞2次，使细胞破碎率达95%以上。上述方法中，所述的澄清是将破碎后的细胞液倒入离心筒中，进行8000rpm离心20min，收集上清液，以0.45um膜包进行微滤以除掉大分子物质。上述方法中，所述的超滤是将澄清后的蛋白液以50KD的膜包进行超滤以除掉小分子物质。所述的沉淀病毒颗粒是将超滤后蛋白液，以0.5M NaOH调pH6.5，加入5M NaCl溶液，搅拌条件下滴加0.5g/ml PEG6000溶液至终浓度0.12g/ml，4 °C下静置2h，4 °C下12000rpm离心30min,弃上清液,用适当体积的20mmol/L PB溶解沉淀，于4°C下5000rpm再次离心30min，收集第2次离心上清液即为粗纯蛋白液。所述的超速离心是向粗纯蛋白液中加入固体溴化钾调密度至1.25g/ml。超度离心上样顺序为:NaCl-EDTA150ml ；1.25KBr 样品液300ml ；1.30KBr梯度液700ml ；1.35KBr梯度液540ml。8°C，25000rpm离心4h，以1.35KBr溶液做为顶液，分管收集UV280nm紫外吸收峰，每管取样进行SDS-PAGE检测，检测结果如图10所示。分子筛层析:以S印hacryl S-500HR为例，以PBS(pH7.0)进行洗脱，收集UV280nm紫外吸收峰即为纯化蛋白液。纯化蛋白浓度检测(Lowry法):精确量取标准蛋白牛血清白蛋白溶液(100 μ g/ml)0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、l.0ml,分别置于试管中，加蒸懼水补至lml,同时量取4倍稀释纯化蛋白液Iml于试管中，分别加5ml碱性铜液,0.5ml酹试剂,于比色杯中用650nm波长测定吸光度值。以标准蛋白的蛋白含量做为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，本发明的一个实施例中Lowry法检测结果获得纯化蛋白终浓度为207 μ g/ml。本发明还提供一种手足口病疫苗，含有本发明的EV71病毒样颗粒。一种制备手足口病疫苗的方法，将本发明的EV71病毒样颗粒用磷酸铝佐剂吸附后制备成含20 μ g/ml病毒样颗粒的疫苗。具体地，本发明提供一种手足口病疫苗的制备方法，包括:(1)蛋白基因的优化合成:使用汉逊酵母密码子将肠道病毒71型Pl及3CD蛋白的多核苷酸进行优化合成，该Pl蛋白的氣基酸序列如SEQ ID N0.2所不,其编码基因如序列表中SEQ ID N0.1所不;该3Q)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，其编码基因如序列表中SEQ ID N0.3所示；(2)重组表达质粒的构建:用肠道病毒EV71的Pl蛋白基因和3CD蛋白酶基因与PMV质粒连接后构建PMV-P1-3 ⑶重组表达质粒；(3)重组表达质粒转入表达菌株:所述重组表达质粒转入汉逊酵母AU-0501表达菌株，得到AU-PMV-P1-3⑶重组表达菌株；(4)重组表达菌株发酵培养及EV71病毒样颗粒的纯化:30L发酵罐培养上述表达菌株，离心收集菌体进行高压均浆破碎，离心收集上清液，所述上清液经微滤、超滤、PEG沉淀、超速离心、分子筛层析等纯化后获得EV71病毒样颗粒；(5)制备疫苗:所述EV71病毒样颗粒用磷酸铝佐剂吸附后制备成含 20 μ g/ml病毒样颗粒的疫苗。
本发明的有益效果在于:
1、易于获得高效表达菌株:本发明将EV71的Pl及3⑶蛋白基因序列进行了优化设计，并且提供了高效表达EV71病毒样颗粒的重组表达载体，通过汉逊酵母表达系统实现了病毒样颗粒(VLPs)的高效表达。
2、适于工业化生产:本发明筛选的汉逊酵母重组表达菌株具有原核细胞生长快、 遗传操作简单、易于培养、生产成本低，能进行高密度发酵培养，且外源蛋白产量高，适合于工业化大生产等特点。
3、稳定性好:所述重组表达质粒能与酵母宿主细胞的染色体基因组DNA发生同源重组，质粒稳定性好，不易丢失；所述发酵表达产物贮存于过氧化物酶体中，使其免受蛋白酶的降解。
4、本发明的EV71病毒样颗粒适于制备疫苗:本发明所述蛋白质在汉逊酵母体内能够正确进行加工修饰和折叠，无过度糖基化现象。发酵表达产物经过纯化后，经电镜观察纯化样品呈现病毒样颗粒，颗粒直径在30nm左右，颗粒完整、规则。本发明提供EV71病毒样颗粒不带有病毒核酸，无潜在致癌危险，具有良好的安全性，免疫特性和生物学活性，并可以大规模制备和纯化，能够用于制备VLP疫苗，具有较好的经济价值和应用前景。


图1为PCR鉴定重组表达质粒PMV-Pl及重组表达质粒PMV-3⑶大肠杆菌转化克隆检测结果:其中，图1a中1-12为PCR鉴定Pl基因(IOOObp)检测结果；图1b中13-24为 PCR鉴定3⑶基因(630bp)检测结果；其中M:DL2000 (宝生物工程有限公司)。
图2为提取的重组表达质粒PMV-Pl和PMV-3⑶检测结果:其中，1_2为重组表达质粒PMV-Pl ；3-8为重组表达质粒PMV-3⑶;M:DL10000Plus (北京全式金生物技术有限公司)。
图3为重组表达质粒PMV-Pl和PMV-3⑶进行Sail、SacI双酶切鉴定结果:其中 I为质粒PMV-Pl对照，2为质粒PMV-Pl双酶切(两条 带大小为:4.4kb、3.9kb) ；3为质粒 PMV-3⑶双酶切(两条带大小为:3.8kb、3.9kb)；M:DL10000Plus (北京全式金生物技术有限公司)。
图4为PCR鉴定重组表达质粒PMV-P1-3⑶大肠杆菌转化克隆检测结果:其中，图 4a中1-12为Pl基因PCR鉴定检测结果(大小:1OOObp);图4b中13-24为3CD基因PCR鉴定检测结果(大小:630bp) ；M:DL2000 (宝生物工程有限公司)。
图5为提取的重组表达质粒PMV-P1-3⑶检测结果:其中，1_3为重组表达质粒 PMV-P1-3⑶；4为作为对照的重组表达质粒PMV-Pl ；M:DL10000Plus (北京全式金生物技术有限公司)。
图6为重组表达质粒PMV-P1-3⑶双酶切(Sac1、SalI)电泳检测结果:1为作为对照的重组表达质粒PMV-Pl双酶切；2为重组表达质粒PMV-P1-3⑶对照；3_5为重组表达质粒PMV-P1-3⑶双酶切；其中M:DL10000Plus (北京全式金生物技术有限公司)。图7为汉逊酵母表达的EV71菌株(PMV_P1_3⑶质粒转化菌)经小瓶甲醇诱导表达72h后的蛋白SDS-PAGE检定结果:1为原核表达阳性对照菌株；2为不带外源基因的宿主细胞蛋白(阴性对照)；3_14为菌株诱导样品；M为低分子量蛋白标准(北京全式金公司)。图8为汉逊酵母表达的EV71菌株(PMV_P1_3⑶质粒转化菌)经小瓶甲醇诱导表达72h后的蛋白WB检定结果:1为原核表达阳性对照菌株；2为不带外源基因的宿主细胞蛋白(阴性对照)；3_14为菌株诱导样品；M为低分子量蛋白标准(北京全式金公司)。图9为汉逊酵母表达的EV71菌株在不同发酵时间(44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96小时)样品的蛋白质免疫印迹(Western blot)检测结果，M为低分子量蛋白标准(北京全式金公司)。图10为超速离心分管收集样品SDS-PAGE检测结果:1为阴性对照；1_14为超速离心分管收集的样品；M为低分子量蛋白标准(北京全式金公司)。图11为纯化的EV71病毒样颗粒透射电镜照片(放大倍数:97000)。图12为重组表达载体构建示意图，其中图12a为PMV-Pl表达载体构建示意图，图12b为PMV-3⑶表达载体构建示意图。图13为重组表达载体PMV-P1-3⑶构建示意图。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件进行。实施例1编码EV71的Pl及3⑶蛋白的基因序列优化根据我国流行的肠道病毒71型的C4a亚型毒株的Pl及3⑶蛋白的核苷酸序列，使用vector软件对Pl及3CD基因序列按照汉逊酵母最偏爱密码子进行优化设计，以提高其在汉逊酵母细胞中的表达量。本发明提供的编码Pl及3CD蛋白的基因其核苷酸序列为去掉酵母分泌信号肽的序列或被酵母识别的转录终止信号的序列。本发明编码Pl及3CD蛋白的基因的密码子使用了汉逊酵母最偏爱的密码子。汉逊酵母(Pichia angusta)密码子使用频率可参见http://www.kazusa.0r.1p/codon/。为了避免翻译出来的mRNA的GC含量过高、mRNA的二级结构影响翻译的效率，本发明对某些氨基酸使用次偏爱密码，前提是该次偏爱密码与最偏爱密码使用频率非常接近，氨基酸序列原序列不变，在某些很特殊的情况下，为了减少或增加酶切位点，某些位置的序列做适当的序列调整。由此，本发明优化设计了 Pl基因，其序列如SEQ ID N0.1所示，该基因Pl序列由上海捷瑞公司合成并克隆在Dev-C载体(购自上海捷瑞公司)上，Pl蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；本发明优化设计了3⑶基因，其序列如SEQ ID N0.3所示，该基因3⑶序列由上海捷瑞公司合成并克隆在Dev-C载体(购自上海捷瑞公司)上。3⑶蛋白的 氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。实施例2重组表达载体PMV-P1-3⑶的构建
1、表达载体PMV-05的构建过程:
本发明的表达载体PMV-05由6部分组成:启动子(Μ0Χ-Ρ)、终止子(Μ0Χ-Τ)、复制子HARS、ura3基因、ColEl复制子、Amp抗性基因。
以酵母基因组DNA为模板，分别以引物MOXP-F (序列见SEQ ID N0.5),MOXP-R (见 SEQ ID N0.6) ；M0XT-F (见 SEQ ID N0.7), MOXT-R (见 SEQ ID N0.8) ；HARS-F (见 SEQ ID N0.9),HARS-R (见 SEQ ID N0.10)；Ura3-F (见 SEQ ID N0.ll)、Ura3_R (见 SEQ ID N0.12) 进行PCR扩增，调取基因MOXP、MOXT, HARS, Ura3。以PBR-SK质粒(购自宝生物工程大连有限公司，货号:D3050)为模板，以引物 Amp+ColEl-F (见 SEQ ID N0.13)、Amp+ColEl-R (见SEQ ID N0.14)进行PCR扩增，调取基因Amp+ColEl。PCR反应体系如下:PCR缓冲液 10 μ 1，dNTPlOy 1，引物 Fl μ I,引物 Rl μ 1，Taq DNA polymerasel μ I 蒸馏水 157 μ I 总体积 200 μ I。反应条件:95°C 2min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 2min ;反应 30 个循环。将 PCR 扩增的DNA片段以1%琼脂糖电泳进行检测，PCR产物大小分别约为MOXP: 1500bp左右、 MOXT:300bp 左右、HARS:500bp 左右、Ura3:1lOObp 左右、Amp+ColEl:2200bp 左右。将以上 5 个基因片段用DNA片段纯化试剂盒进行纯化。分别取纯化好的Μ0ΧΡ、Μ0ΧΤ基因片段各I μ I 作为模板，以引物MOXP-F和MOXT-R进行PCR扩增获得Μ0ΧΡ+Μ0ΧΤ基因片段，反应体系及反应条件同上。分别取纯化好的HARS、Ura3、Amp+ColEl基因片段各I μ I作为模板，以引物 HARS-R和Amp+ColEl-R进行PCR扩增获得HARS+Ura3+Amp+ColEl基因片段，PCR反应体系如下:PCR 缓冲液 10 μ I, dNTPlOy 1，引物 Fl μ I,引物 Rl μ I, Taq DNA polymerasel μ I 蒸馏水 155 μ I 总体积 200 μ I。反应条件:95°C 2min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 4min ;反应 30 个循环。将基因片段Μ0ΧΡ+Μ0ΧΤ、HARS+Ura3+Amp+ColEl用DNA片段纯化试剂盒进行纯化。 将纯化好的基因片段Μ0ΧΡ+Μ0ΧΤ、HARS+Ura3+Amp+ColEl分别进行(Sac1、Sail)双酶切，酶切反应如下:基因片段 60 μ l，Sac1、SalI 各 3μ I, IOXBasal bufferlOy I, IOXBSAlOy 1， 加水至100μ 1，于37°C进行酶切过夜。将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收酶切基因片段，通过SolutionI连接试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司)进行连接。 连接反应体系如下:HARS+Ura3+Amp+ColEl (Sac1、SalI)双酶切纯化产物I μ 1,Μ0ΧΡ+Μ0ΧΤ (Sac1、Sail)双酶切纯化产物4 μ 1，SolutionI5y I共计10 μ I反应体系，于16°C连接I 小时。将连接后的重组表达载体转化到100 μ I大肠杆菌(DH5a)感受态细胞中，涂LB+Amp (100 μ g/ml)固体培养基37°C培养箱过夜培养。
转化克隆筛选:挑取LB+Amp固体培养基上的单克隆菌落做为模板，分别以引物 MOXP-F, M0XP-R, Ura3_F、Ura3-R进行PCR鉴定转化克隆，PCR反应体系如下:PCR缓冲液 2μ I, dNTP2 μ 1，引物 F0.1 μ I,引物 R0.1 μ I,Taq DNA polymerase0.1 μ I 蒸馏水 15.7 μ I 总体积 20 μ I。反应条件:95°C 2min ；95°C 30s, 55°C 30S,72°C Imin ;反应 30 个循 环。将 PCR扩增的DNA片段以1%琼脂糖电泳进行检测，以M0XP-F、M0XP_R为引物的PCR产物大小约应为1500bp左右，以Ura3-F、Ura3-R为引物的PCR产物大小约应为IOOObp左右。将PCR 鉴定正确的5号转化克隆命名为:重组表达载体PMV-05，并将其接种到10ml LB+Amp液体培养基于37°C摇床200rpm过夜培养。按照质粒提取试剂盒(来源:北京全式金生物技术有限公司)说明书进行重组表达载体PMV-05的提取，将提取的重组表达载体进行1%琼脂糖电泳进行检测。将所获得的表达载体进行酶切鉴定，酶切反应体积如下:质粒5 μ 1，Sac1、Sail 各 I μ I, IOXBasal buffer2 μ l,10XBSA2y I，加水至 20 μ 1，于 37°C进行酶切 4 小时，结果显示成功构建重组表达载体PMV-05。2、重组表达载体PMV-Pl及PMV-3⑶的构建:将实施例1优化合成的基因Pl及3⑶克隆在Dev-C载体上，基因序列在优化设计时两端均加入了 EcoR1、BamHI酶切位点以便克隆入表达载体。分别将已克隆入P1、3⑶基因的Dev-C载体与表达载体(PMV-05 )进行EcoR1、BamHI (均购自宝生物工程(大连)有限公司)双酶切，反应体系如下:质粒30μ1，EcoR1、BamHI各3μ 1，IOXK bufferlO μ 1，加水至100 μ 1，于37°C进行酶切过夜。将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收基因片段与线性表达载体，通过SolutionI连接试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司)进行连接。连接反应体系如下:载体PMV-05(EcoRI/BamHI)双酶切纯化产物1μ 1，P1、3CD基因(EcoRI/BamHI)双酶切纯化产物各5 μ 1，SolutionI6y I共计12 μ I反应体系，于16°C连接I小时。将连接后的重组表达载体转化到100 μ I大肠杆菌(DH5a)感受态细胞中，涂LB+Amp (100 μ g/ml)固体培养基37°C培养箱过夜培养。转化克隆筛选:挑取LB+Amp固体培养基上的单克隆菌落做为模板，进行PCR鉴定转化克隆。Pl基因引物序列如下:引物F-AGTTTTTGCCCTACTTGATCACAG，引物 R-CGGAATTCTTATT ACTGGGTCACGGCCTGTC ;3CD 基因引物序列如下:引物 F-AACCACACCCACCACGTGTACAGAAAC，引物 R-ACTCGCTATTTCAG CTTTTCATCTC。PCR 反应体系如下:PCR缓冲液 2 μ 1，dNTP2 μ 1，引物 F0.1 μ 1，引物 R0.1 μ 1，Taq DNA polymerase0.1 μ I 蒸馏水15.7μ I 总体积 20 μ I。反应条件:95°C 2min ；95°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C Imin ;反应 30 个循环。将PCR扩增的DNA片段以1%琼脂糖电泳进行检测，Pl基因PCR产物大小约为IOOObp左右，3⑶基因PCR产物大小约为630bp左右，PCR电泳结果见图la、图lb。将PCR鉴定正确的转化克隆命名为:重组表达质·粒PMV-Pl及重组表达质粒PMV-3CD，重组表达载体构建示意图如图12a、图12b所示。将鉴定正确的克隆接种到10ml LB+Amp液体培养基中于37°C摇床200rpm过夜培养。按照质粒提取试剂盒(来源:北京全式金生物技术有限公司)说明书进行重组表达质粒PMV-Pl和PMV-3CD的提取，将提取的重组表达载体进行1%琼脂糖电泳进行检测，检测结果见图2。将所获得的重组表达载体进行酶切鉴定，酶切反应体积如下:质粒 5μ l，Sal1、SacI 各 I μ 1,10ΧΚ buf f er2 μ 1，加水至 20 μ 1，于 37°C 进行酶切 4 小时，酶切结果电泳检测如图3。3、重组表达载体PMV-P1-3CD的构建:将重组表达载体PMV-Pl以Sac1、XhoI (均购自宝生物工程(大连)有限公司)双酶切，重组表达载体PMV-3⑶以Sac1、SalI (均购自宝生物工程(大连)有限公司)双酶切，酶切反应体积如下:质粒 50 μ l，SalI/Xho1、SacI 各 5μ 1，10XK bufferlO μ 1，加水至 100 μ 1，于37°C进行酶切过夜。将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收3CD基因片段与PMV-Pl线性载体片段，通过SolutionI连接试剂盒(购自宝生物工程(大连)有限公司)进行连接。连接反应体系如下:载体PMV-Pl (Sacl/Xhol)双酶切纯化产物1μ 1，3⑶基因(Sacl/Sall)双酶切纯化产物各5μ l，SolutionI6y I共计12 μ I反应体系，于16°C连接I小时。将连接后的重组表达载体转化到100 μ I大肠杆菌(DH5a)感受态细胞中，涂LB+Amp(100 μ g/ml)固体培养基37°C培养箱过夜培养。转化克隆筛选:挑取LB+Amp固体培养基上的单克隆菌落做为模板，进行PCR鉴定转化克隆。Pl基因引物序列如下:引物F-AGTTTTTGCCCTACTTGATCACAG，引物 R-CGGAATTCTTATT ACTGGGTCACGGCCTGTC ;3CD 基因引物序列如下:引物 F-AACC ACACCCACCACGTGTACAGAAAC，引物 R-ACTCGCTATTTCAG CTTTTCATCTC。PCR 反应体系如下:PCR 缓冲液 2 μ 1，dNTP2 μ 1，引物 F0.1 μ 1，引物 R0.1 μ 1，Taq DNA polymerase0.1 μ I 蒸馏水15.7μ I 总体积 20 μ I。反应条件:95°C 2min ；95°C 30s, 55 °C 30s，72°C Imin ;反应 30 个循环。将PCR扩增的DNA片段以1%琼脂糖电泳进行检测，Pl基因PCR产物大小约为IOOObp 左右，3⑶基因PCR产物大小约为630bp左右，PCR电泳结果见图4a、图4b。将PCR鉴定正确的转化克隆命名为:重组表达载体PMV-P1-3CD，重组表达载体构建示意图如图13所示。 将鉴定正确的克隆接种到10mlLB+Amp液体培养基中于37°C摇床200rpm过夜培养。按照质粒提取试剂盒(来源:北京全式金生物技术有限公司)说明书进行重组表达质粒PMV-P1-3CD 的提取，将提取的重组表达载体进行1%琼脂糖电泳进行检测，检测结果见图5。将所获得的重组表达载体进行酶切鉴定，酶切反应体积如下:质粒5 μ 1，Sail、SacI各1μ 1，10XK buffer2y 1，加水至20 μ 1，于37°C进行酶切4小时，酶切结果电泳检测如图6。
实施例3汉逊酵母表达的EV71菌株的诱导表达及检测
将重组表达载体PMV-P1-3⑶通过电穿孔转化到汉逊酵母ATCC26012尿嘧啶缺陷型宿主细胞AU-0501中(野生型宿主菌来自ATCC26012，通过基因敲除方法获得ATCC26012 尿嘧啶缺陷型宿主细胞)，其保藏编号为CGMCC N0.7013。
通过选择培养基及PCR法对转化克隆进行筛选和鉴定，将鉴定都含有Pl和3⑶基因的转化克隆经过选择培养基进行稳定化传代培养，从而获得Pl蛋白和3CD蛋白共表达菌株AU-PMV-P1-3CD。将表达菌株接种在选择培养基MDL(0.67%酵母氮源培养基，购自SIGMA 公司，规格:Y1251-KG，批号:030M1754),0.5%硫酸铵，2%葡萄糖)中，33°C摇床培养20小时， 5000rpm离心6min，收集沉淀，加入诱导培养基ΜΜ(0.67%酵母氮源培养基，0.5%硫酸铵，1% 甲醇)中，每天补加1%的甲醇，诱导表达3天。
SDS-PAGE凝胶电泳分析:取诱导后样品100 μ I离心，收集沉淀，用无菌水清洗，进行NaOH处理3min,离心弃上清，沉淀以IOOul SDS Sample buffer重悬，煮沸IOmin,离心， 上清IOul上样进行电泳，电泳完毕取下凝胶进行银染，凝胶成像系统软件扫描分析目的蛋白表达量。
SDS-PAGE检测结果显示(如图7):重组菌株表达的蛋白分子量在32.7KD左右，分子量大小与预期的目的蛋白大小一致。
ffestern-blot检测:用抗EV71-VP1抗体(京天成生物技术(北京)有限公司， 22A12)作为一抗，使用HRP-羊抗鼠-1gG (北京博奥森公司)作为二抗，DAB显色。
ffestern-b lot结果显示(如图8):表达产物能与单克隆抗体特异性结合，并在 32.7KD处有较为明显的反应条带，与SDS-PAGE结果一致，说明该表达产物具有良好地免疫反应性。
实施例4重组EV71酵母表达菌株在30L发酵罐中发酵培养
将重组的汉逊酵母菌株接种到150ml —级种子培养基(0.67%酵母氮源培养基 (购自SIGMA公司，规格Y1251-KG，批号:030M1754), 0.5%硫酸铵，2%葡萄糖)中，在33°C， 200rpm摇床振荡培养20小时。然后全量接种于1500ml 二级种子培养基(0.67%酵母氮源培养基，0.5%硫酸铵，2%甘油)中，在33°C，200rpm摇床振荡培养20小时(OD6tltlnm达8-10)。之后全量接种至30L发酵罐中，其中装有15L发酵培养基(甘油、磷酸二氢铵、氯化钾、氯化钙、氯化钠、硫酸镁、乙二胺四乙酸钠，其质量比依次为:140:70:20:15:2:1)，补充氨水调节发酵液pH值维持在5.0，发酵温度为30°C，转速控制在350-750rpm，空气流速0.5-1.0m3A,高密度发酵需要纯氧补充，溶氧控制在20-60%，20h时发酵培养基中碳源耗尽，补加甘油共计2.0L,分5次补加0.40L/次，每次碳源耗尽，溶氧上升时加甘油，菌体生长共计36h左右，湿菌重最高可达0.3-0.4g/ml左右；去阻遏阶段:转速750rpm,空气流速1.0m3/h,溶氧控制在20-60%，加入IL甘油和甲醇混合液(甘油400ml，甲醇600ml)进行去阻遏培养，36_54h(共计16-18h)之间；诱导阶段:54-94h (36_40h)之间进行甲醇诱导，溶氧维持在40%左右。发酵结束:92-94h时，待甲醇消耗完全，溶氧上升至80%以上，降温至20°C开始下罐发酵结束，湿菌重维持在0.3-0.4g/ml。汉逊酵母表达的EV71病毒样颗粒的鉴定:取上述不同发酵时间(44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96小时)的样品进行蛋白质免疫印迹(Western blot)检测，用抗EV71-VP1单克隆抗体(京天成生物技术(北京)有限公司，22A12)作为一抗，使用HRP-羊抗鼠-1gG (北京博奥森公司)作为二抗，DAB显色，结果如图9所示。ffestern-blot结果显示:表达产物能与单克隆抗体特异性结合，并在32.7KD处有较为明显的反应条带，说明该表达产物具有良好地免疫反应性。重组EV71病毒样颗粒发酵表达量测定:将破碎后离心收集的上清液进行10倍系列梯度稀释，以原核表达的EV71-VP1纯化产物做为标准品，用EV71抗原ELISA检测试剂盒(京天成生物技术(北京)有限公司，该试剂盒主要检测EV71-VP1蛋白，Lot#100408)进行重组EV71病毒样颗粒表达量测定，测定结果如表I所示:表I发酵破碎液抗原含量(ELISA法)检测结果
权利要求
1.一种重组表达载体，其特征在于，含有EV71病毒Pl基因和3⑶基因。
2.如权利要求I所述的重组表达载体，其特征在于，所述EV71病毒Pl基因其核苷酸序列是如下a)或b): a)其核苷酸序列如序列表中SEQID No. I所示；或 b)由SEQID No. I所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码Pl蛋白的核苷酸序列。
3.如权利要求I所述的重组表达载体，其特征在于，所述EV71病毒3⑶基因其核苷酸序列是如下a)或b): a)其核苷酸序列如序列表中SEQID No. 3所示；或 b)由SEQID No. 3所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码Pl蛋白的核苷酸序列。
4.如权利要求I所述的重组表达载体，其特征在于，含有甲醇氧化酶启动子或甲醛脱氢酶启动子。
5.如权利要求I 4任一所述的重组表达载体，其为PMV-P1-3⑶。
6.含有权利要求I 5任一所述的重组表达载体的宿主细胞。
7.权利要求I 5任一所述的重组表达载体在制备EV71病毒疫苗中的应用。
8.一种EV71病毒样颗粒，其特征在于，通过以下方法制备得到(I)将重组表达载体PMV-PI-3⑶转入汉逊酵母AU-0501表达菌株，得到AU-PMV-PI-3⑶重组表达菌株；(2 )发酵培养该重组表达菌株，(3)分离纯化EV71病毒样颗粒离心收集菌体进行高压均浆破碎，澄清、超滤、沉淀病毒颗粒，超速离心收集上清液，上清液经离子交换层析、疏水层析或分子筛层析，纯化后获得EV71病毒样颗粒。
9.一种手足口病疫苗，其特征在于，含有权利要求8所述的病毒样颗粒。
10.一种制备权利要求9所述疫苗的方法，其特征在于，将EV71病毒样颗粒用磷酸铝佐剂吸附后制备成含20 μ g/ml病毒样颗粒的疫苗。
全文摘要
本发明提供了一种EV71病毒样颗粒及其制备方法与应用。通过将EV71病毒的P1蛋白基因和3CD蛋白酶基因与PMV质粒连接后构建PMV-P1-3CD重组表达质粒，然后转入汉逊酵母AU-0501表达菌株，得到AU-PMV-P1-3CD重组表达菌株；将重组表达菌株发酵培养和甲醇诱导表达EV71病毒样颗粒蛋白，离心收集菌体进行高压均浆破碎，上清液经离子交换层析、疏水层析、分子筛层析等纯化后获得。本发明提供的EV71病毒样颗粒疫苗具有良好的免疫原性、安全性、免疫特性和生物学活性，并可以大规模制备和纯化，可用于制备预防EV71感染的疫苗，具有较好的经济价值和应用前景。
文档编号C12R1/78GK103255163SQ20131017967
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月15日 优先权日2013年5月15日
发明者顾美荣, 魏文进, 刘建凯, 宋琳琳, 许珊珊 申请人:北京民海生物科技有限公司