专利名称：一种增强多肽药物从细胞内体逃离的蛋白载药系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗肿瘤多肽药物，更具体地讲，涉及一种增强多肽药物从细胞内体逃离的蛋白载药系统。
背景技术：
多肽作为药物治疗肿瘤是一个新兴研究领域。多肽用于治疗疾病具有一些重要的优点:1、与小分子化学药相比，多肽分子容易设计成几乎任何多肽序列；2、多肽分子容易制备，并且它们的序列容易利用化学合成和分子生物学技术进行修饰。目前利用多肽治疗肿瘤主要存在的瓶颈:多肽在血液循环系统中快速地被降解，并且它的较大分子量和带电荷性质使它很难穿过细胞膜。目前的方法是通过与大分子载体结合增加多肽的稳定性，与细胞穿膜肽(CPPs)结合克服其穿膜差的缺点。TAT是一种细胞穿膜肽(CPPs)，来自于HIV TAT蛋白的第49_57位氨基酸序列。目前有人利用TAT转运铁纳米颗粒和荧光量子点进入细胞，还将TAT融合蛋白和多肽转运到活体小鼠的细胞中研究治疗肿瘤模型小鼠。早期报道TAT的转运是通过一个非内吞作用机制，类似于像其他CPPs直接通过瓦解细胞膜进入细胞。但是近些年被广泛接受的是TAT通过大胞饮作用的细胞内吞机制进入细胞。虽然TAT能携带融合物从内体逃离，但是人们发现还是有90%的TAT融合物被困在内体中无法逃脱最终被溶酶体降解。因此，增强TAT逃离内体的能力将是提高其转运效率的关键所在。内吞作用是细胞摄取胞外物质的一种方式。但是经历内吞途径的药物本身逃离内体的能力都很弱。目前有多种方法可以帮助药物逃离内体，都是基于已经比较清楚地内体逃离机制，如在内体膜上形成小孔，PH缓冲效应，内体逃离增强子的构象改变和光敏剂瓦解膜结构。 流感病毒的血细胞凝集素(HA)的亚基HA2是一个带负电的双极性多肽。在低pH值时，其谷氨酸和天冬氨酸的质子化导致其构象改变成螺旋结构，进而与膜融合，导致内体的膜稳定性变差，从而逃离内体。因此，HA2在多个研究中已经被用来作为内体逃离的融合多肽。另一个由HA2改进而来的多肽INF7逃离内体能力更强，并且在转运SiRNA，蛋白和利用多聚物转运基因中都已经得到应用。
发明内容
本发明的第一个目的，在于提供一种增强多肽药物从细胞内体逃离的蛋白载药系统，提高TAT转运多肽药物的效率，使药物快速从内体中释放，进而促进其药效充分地发挥。本发明的第二个目的，在于提供编码所述增强多肽药物从细胞内体逃离的蛋白载药系统的核酸序列。本发明的第三个目的，在于提供含有所述核酸序列的表达质粒构建体。
本发明的第四个目的，在于提供所述增强多肽药物从细胞内体逃离的蛋白载药系统在运载药物中的应用。为实现上述第一个目的，本发明公开以下技术方案:一种增强多肽药物从细胞内体逃离的蛋白载药系统，其特征在于，包括细胞穿膜肽TAT，内体逃离增强子INF7，泛素蛋白和多肽药物，所述TAT，INF7，泛素蛋白和多肽药物依次连接。作为一个优选方案，所述多肽药物包括Bak BH3多肽，Survivin生存素及其变体和WlO多肽中的一种或几种。作为一个优选方案，所述泛素蛋白来源于人。为实现上述第二个目的，本发明公开以下技术方案:编码增强多肽药物从细胞内体逃离的蛋白载药系统的核酸，其序列如下所示(SEQ ID N0.1),CATATGCACCACCACCACCACCACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAAC GCCGTCGTGGTAGCGGTGGTAGTGGTGGTAGCGGCGGTAGCGGTGGCAG TGGTGGTTCAGGTGGTTATTGGGGTGACATTATGGGCGAATGGGGCAATG AAATTTTCGGCGAAATTGCCGAATTCCTGGGCGGTAGCGGTGGTAGCGGT GGCAGCGGCGGTAGTGGCGGCAGTGGCGGCTCGGGCGGCAGCTTGTAGA TTTTTGTGAAAACCCTGACCGGCAAAACCATTACCCTGGAAGTGGAACC GAGCGATACCATTGAAAACGTGAAAGCGAAAATTCAGGATAAAGAAGGC ATTCCGCCGGATCAGCAGCGCCTGATTTTTGCGGGCAAACAGCTGGAAG ATGGCCGCACCCTGAGCGATTATAACATTCAGAAAGAAAGCACCCTGCAT CTGGTGCTGCGCTCAAAAGGCGGCCAGGTGGGTCGTCAGCTGGCAATCA TCGGTGACGACATTAACCGTTGATAATAGCTCGAG。为实现上述第三个目的，本发明公开以下技术方案:含有所述核酸序列的表达质粒构建体。 为实现上述第四个目的，本发明公开以下技术方案:增强多肽药物从细胞内体逃离的蛋白载药系统在运载药物中的应用，其特征在于，所述载药系统增强多肽药物从细胞内体逃离。本发明的优点在于:提供一种增强多肽药物从细胞内体逃离的蛋白载药系统，通过含有多个功能域的蛋白载药系统来增强多肽药物从细胞内体中释放，提高TAT转运多肽药物的效率，使药物快速从内体中释放，进而促进其药效充分地发挥。
图1显示了蛋白载药系统转载模式蛋白红色突光蛋白mCherry表达载体以及其它对照蛋白表达载体的构建示意图。TIU-mCherry代表:蛋白载药系统Tat-1NF7-Ub (Ubiquitin)后直接连接mCherry蛋白；TIUV_mCherry代表:蛋白载药系统Tat-1NF7-Ub中的Ubiquitin是个突变体，即最后一个甘氨酸(G)变为缬氨酸(V)，意味着这个突变体不会被去泛素酶酶切；TU-mCherry代表:蛋白载药系统Tat_INF7_Ub中缺失内体逃离增强子INF7 ;T1-mCherry代表:蛋白载药系统Tat_INF7_Ub中缺失泛素蛋白；Tat-mCherry代表:mCherry蛋白由TAT穿膜肽介导转运；mCherry代表:红色突光蛋白。图2显示了蛋白载药系统转载mCherry蛋白的诱导表达SDS-PAGE电泳图。泳道1:空表达载体pET20b转入BL21(DE3)，30°C诱导；泳道2_4:30°C诱导，分别为诱导O小时，诱导6小时的上清，诱导6小时的沉淀。图中显示大部分表达的蛋白载药系统转载mCherry蛋白在菌体中是可溶性的，只有少部分蛋白是以包涵体形式存在在菌体中。
图3显示了咪唑浓度梯度洗脱目的蛋白曲线图。蓝线:UV值；绿线:咪唑浓度增长值；A峰:上清液流穿柱子峰；B峰:目的蛋白洗脱峰。说明目的蛋白在咪唑浓度为220mM左右可以被洗脱。图4显示了各个纯化后的融合mCherry蛋白。TIUC: TIU-mCherry蛋白；TIUvC:TIUV-mCherry 蛋白；TUC:TUnCherry 蛋白；TIC:TInCherry 蛋白；TC:TatnCherry蛋白。图5显示了 TIUC，TIC和TC蛋白孵育不同细胞系结果图。横坐标，A549, HeLa, HCTl 16分别代表不同细胞系；纵坐标，TIUC, TIC和TC分别代表TIUiCherry蛋白，ΤΙ-mCherry蛋白和Tat-mCherry蛋白。在A549细胞和HCTl 16细胞中，与TC蛋白孵育后细胞内的红色荧光信号只分布在细胞内局部区域相比较，TIUC蛋白和TIC蛋白孵育的细胞内荧光信号能分布得更广泛。这说明内体逃离增强子INF7在融合蛋白中促进了 TAT介导的蛋白转运过程中内体逃离作用。因为INF7帮助TAT融合蛋白进入细胞质然后在细胞中扩散；虽然TAT有较弱的内体逃离能力，但是大部分的TC融合蛋白还是被困在内体中无法逃脱，造成TC蛋白被限制在细胞内的局部区域。图6显示了用Western Blot方法检测蛋白载药系统的可行性。a) INF7促进转运和DUBs酶切结果,泳道mCherry:天然mCherry蛋白样品；泳道TIU-Δ:纯化的TIUC蛋白样品与收集的A549和HCT116细胞一起混合制备的样品，为了确认在样品制备过程中不会影响蛋白的完整性；泳道TU- Δ和TIUV- Δ:1μ MTIUC, TUC和TIUvC蛋白分别与Α549和HCTl 16细胞孵育的样品；b)去泛素酶切对照实验结果，泳道mCherry和TIU-Λ:分别是天然mCherry蛋白和纯化的TIUC蛋白样品j}dtTIU-A，TIU-Λ+NEM和TIUV-Λ:分别是TIUC和TIUvC蛋白与A549细胞的细胞质粗提液和含有DUBs抑制剂N-ethylmaleimide (NEM)孵育的样品；c)TIUC蛋白进入细胞后被DUBs酶切结果，泳道mCherry:天然mCherry蛋白样品；泳道4h-24h:1 μ M的TIUC蛋白与Α549细胞在无血清的培养基中孵育4个小时后，洗去未进入细胞的蛋白，再加入含血清的培养基继续孵育不同时间的样品；d)是a)部分的泳道TU-Δ和TIU-Λ的TUC和TIUC蛋白分别与Α549和HCT116细胞孵育后去泛素的灰度值统计结果；e)是c)部分去泛素的统计结果。
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图7显示了蛋白载药系统分别转载Bak BH3和WlO两个多肽表达载体以及其它对照蛋白表达载体的构建示意图。TIU-WlO代表:蛋白载药系统转载WlO多肽；TIU-BH3代表:蛋白载药系统转载Bak BH3多肽；T1-BH3代表:缺失泛素的蛋白载药系统转载Bak BH3多肽；Tat-BH3代表:TAT穿膜肽介导转运Bak BH3多肽。图8显示了蛋白载药系统转载Bak BH3多肽的诱导表达SDS-PAGE电泳图。泳道1:诱导前全菌体样品；泳道2-3:25°C诱导10小时的上清和沉定；泳道M:蛋白分子量标准。图9显示了孵育TIU-BH3后A549细胞经Annexin V-FITC染色后的显微图。未孵育蛋白的细胞(untreated)的细胞膜没有被染成绿色，而孵育了 TIU-BH3融合蛋白的细胞(treated)的细胞膜被染成绿色并呈现凋亡状态。与未孵育TIU-BH3融合蛋白的细胞相比较，孵育24小时TIU-BH3融合蛋白的细胞，其大部分的细胞膜上被染为绿色，并且出现明显地凋亡的形态学特征:细胞皱缩，细胞个体变小和变圆。这些结果表明TIU-BH3融合蛋白能够诱导A549细胞凋亡。图10显示了不同融合蛋白诱导细胞凋亡的流式分析及统计图。a)细胞处理后流式细胞仪检测图，A549细胞与不同蛋白和试剂孵育24小时后，用Annexin V-FITC试剂盒染色，然后利用流式细胞仪去检测，利用紫杉醇作为阳性对照山)流式细胞仪检测统计结果，经流式细胞检测后发现，相比于Tat-BH3融合蛋白诱导A549细胞出现20.45±2.89%的凋亡率，TIU-BH3 融合蛋白能诱导 A549 细胞出现 46.15±4.86%(p<0.001，Tukey - Kramer)的
凋亡率。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Samtoook等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。尽管特定的实施例描述了蛋白载药系统的构建，对于本领域的技术人员来说很显然任意的穿膜肽，内体逃离增强子及其蛋白药物可在所提供方法中被取代。实施例1.蛋白载药系统转载模式蛋白红色荧光蛋白mCherry表达载体的构建含有TAT，INF7，泛素及mCherry蛋白表达载体及对照表达载体通过下述来产生:首先，将编码TAT，INF7,泛素及mCherry蛋白的核酸序列通过PCR扩增，其利用含有NdeI位点的5，引物，以及带有XhoI位点的3，引物。其次，PCR产物从NdeI和XhoI位点之间克隆到表达载体pET20b中。其他对照表达载体同样以类似方法克隆到表达载体pET20b的NdeI和XhoI位点之间。所有的融合蛋白在其C末端含有聚组氨酸标记(图1)。编码载药系统的核 酸序列如下所示(SEQ ID N0.1):CATATGCACCACCACCACCACCACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAAC GCCGTCGTGGTAGCGGTGGTAGTGGTGGTAGCGGCGGTAGCGGTGGCAG TGGTGGTTCAGGTGGTTATTGGGGTGACATTATGGGCGAATGGGGCAATG AAATTTTCGGCGAAATTGCCGAATTCCTGGGCGGTAGCGGTGGTAGCGGT GGCAGCGGCGGTAGTGGCGGCAGTGGCGGCTCGGGCGGCAGCTTGTAGA TTTTTGTGAAAACCCTGACCGGCAAAACCATTACCCTGGAAGTGGAACC GAGCGATACCATTGAAAACGTGAAAGCGAAAATTCAGGATAAAGAAGGC ATTCCGCCGGATCAGCAGCGCCTGATTTTTGCGGGCAAACAGCTGGAAG ATGGCCGCACCCTGAGCGATTATAACATTCAGAAAGAAAGCACCCTGCAT CTGGTGCTGCGCTCAAAAGGCGGCCAGGTGGGTCGTCAGCTGGCAATCA TCGGTGACGACATTAACCGTTGATAATAGCTCGAG。编码载药系统转载指示蛋白mCherry的核酸序列如下所示(SEQ ID N0.2):CATATGCGTAAAAAACGTCGTCAACGCCGTCGTGGTAGCGGTGGTAG TGGTGGTAGCGGCGGTAGCGGTGGCAGTGGTGGTTCAGGTGGTTATTGG GGTGACATTATGGGCGAATGGGGCAATGAAATTTTCGGCGAAATTGCCGA ATTCCTGGGCGGTAGCGGTGGTAGCGGTGGCAGCGGCGGTAGTGGCGGC AGTGGCGGCTCGGGCGGCAGCTTGTAGATTTTTGTGAAAACCCTGACCG GCAAAACCATTACCCTGGAAGTGGAACCGAGCGATACCATTGAAAACGT GAAAGCGAAAATTCAGGATAAAGAAGGCATTCCGCCGGATCAGCAGCGC CTGATTTTTGCGGGCAAACAGCTGGAAGATGGCCGCACCCTGAGCGATTA TAACATTCAGAAAGAAAGCACCCTGCATCTGGTGCTGCGCTCAAAAGGC GGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGT TCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTT CGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGAC CGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGAC ATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCC CGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGT GGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCC AGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCG CGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATG GGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGA AGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACG ACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGC CCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGA GGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGCTCGAGomCherry为示范，克隆在pET20b载体上进行表达利用性研究，获得了预期的结果。蛋白载药系统转载mCherry及对照蛋白的表达与纯化首先，将表达质粒转化入表达菌株E.coli BL21(DE3)中；从转化的平板上挑选单菌落接种到含氨苄抗性的5ml LB液体培养基中培养过夜，然后取Iml过夜培养的菌液转接到含氨苄抗性的IOOml LB液体培养基中，370C，180rpm培养到菌液OD6tltl值在0.6左右；接着添加诱导剂IPTG至终浓度0.5mM, 30°C诱导6小时；诱导表达结束后，4°C，7000g离心15分钟收集菌体，取部分菌体检测蛋白诱导表达情况(图2);接着用IOml蛋白纯化平衡缓冲液(4.94g K2HPO4.3Η20，0.4559g KH2PO4,14.61gNaCl, 1.70g 咪唑溶解于 500mL 双蒸水中至澄清，调PH到7.4)重悬菌体，进行超声破碎。接着离心取上清液，并上样到蛋白纯化系统的聚组氨酸蛋白纯化柱子上；然后利用蛋白纯化系统用蛋白纯化洗脱缓冲液(4.94gK2HPO4.3Η20，0.4559g KH2PO4,14.61gNaCl, 12.21g 咪唑溶解于 500mL 双蒸水中至澄清，调pH到7.4)进行线性洗脱目的蛋白(图3)。由于所有融合有mCherry的蛋白在波长为587nm处消光系数都为 .2X IO4M-1Cm-1,因此蛋白浓度可以通过可见分光光度计在587nm处测定吸收值计算出来。每个纯化后的融合蛋白分装后_80°C保存(图4)。蛋白载药系统的可行性检测首先用荧光显微镜观 察蛋白载药系统转载mCherry蛋白进入细胞；将细胞接种到6孔的细胞培养板，控制每孔细胞数大约是I X IO6个，过夜培养后，用预冷的PBS漂洗数次细胞，在无血清的培养基中分别孵育I μΜ的蛋白载药系统蛋白及其它对照融合蛋白，孵育4小时后，用预冷的含20U ml/1肝素的PBS漂洗数次细胞去除与细胞膜非特异性结合的蛋白，之后消化细胞，200g离心10分钟收集细胞，然后用HEPES细胞成像缓冲液重悬细胞，滴加到载玻片上，在561nm激发光波长下观察并拍照(图5)。接着验证蛋白载药系统能被去泛素酶专一性酶切；孵育蛋白方法同上，孵育结束后用预冷的含20U ml/1肝素的PBS漂洗数次细胞去除与细胞膜非特异性结合的蛋白，之后消化细胞，200g离心10分钟收集细胞，用RIPA裂解液裂解细胞进行Western Blot分析(图6，a);同时，融合蛋白与肺癌细胞A549细胞质粗提液孵育，即收集A549细胞，用lmlNP-40温和裂解液(选择该裂解液的目的不使去泛素酶失活)重悬细胞，冰上孵育10分钟，4°C，13，OOOg离心20分钟，取上清，制得细胞质粗提液，将融合蛋白与细胞质粗提液37°C孵育I小时，或将融合蛋白与添加有IOmM N-顺丁烯二酰亚胺的细胞质粗提液37°C孵育I小时，随后取样进行Western Blot分析(图6，b)。然后检测蛋白载药系统转载蛋白效率；孵育蛋白方法同上，孵育4小时后用预冷的含20U mL_1肝素的PBS漂洗数次细胞去除与细胞膜非特异性结合的蛋白，之后补加含血清(5%)培养基继续孵育到4，6，12，24个小时不等时间，随后取样进行Western Blot分析(图 6, C)。根据图6Western Blot分析，a)泳道3_4和8_9都有融合蛋白与细胞孵育后出现了一条大小与纯化的mCherry蛋白相一致的条带；但是在泳道5和10上，融合了Ubiquitin(G76V)突变体的蛋白TIUvC与细胞孵育后没有出现这样大小的条带；说明出现大小与mCherry蛋白相一致的条带不是由融合蛋白TIUC和TUC在细胞内被蛋白酶非特异性酶切造成，而是由DUBs酶对融合蛋白专一性酶切的结果。并且纯化的TIUC蛋白样品(泳道2与7)与收集的细胞一起混合制备样品也没有出现mCherry蛋白大小的条带,这说明融合蛋白的去泛素作用不是来自于样品制备过程中与细胞质中的DUBs酶接触造成，而是蛋白孵育细胞后进入细胞质被DUBs酶切的结果。另外根据b)，TIUC蛋白与A549细胞的细胞质新鲜粗提液在37°C孵育I小时能将其完全去泛素作用，但是在含有IOmM的DUBs酶抑制剂N-顺丁烯二酰亚胺的细胞质新鲜粗提液中相同条件下孵育没有出现mCherry蛋白大小的条带，这说明去泛素作用被完全抑制。这就进一步说明了 TIUC蛋白的去泛素作用是来自于DUBs酶专一性酶切作用。对c)进行灰度值分析，结果显示融合蛋白进入细胞24小时内能被细胞质中的DUBs酶 完全去泛素；当蛋白进入细胞12小时后有87.36 土4.85%被去泛素。同时分别对a)泳道3-4和8-9进行灰度值分析，结果TIUC蛋白在A549细胞中被去泛素率为65.75±5.26%(p<0.001, Tukey - Kramer)，但是缺失了内体逃离增强子INF7的TUC融合蛋白的去泛素率只有32.01 ±2.56%;相似地是，TIUC蛋白在HCTl 16细胞中被去泛素率为60.14±5.30%，但是TUC蛋白的去泛素率只有28.10±2.25%。根据结果得出内体逃离增强子INF7能使TAT逃离内体的能力增强到大约原来的两倍。因此，该蛋白载药系统能高效转载蛋白进入细胞质。实施例2.基于蛋白载药系统转载的多肽诱导细胞凋亡蛋白载药系统转载Bak_BH3多肽表达载体的构建首先，将编码TAT，INF7，泛素及Bak_BH3多肽的核酸序列通过PCR扩增，其利用含有NdeI位点和编码聚组氨酸标记序列的5’引物，以及带有终止密码子TGA和XhoI位点的3’引物。其次，PCR产物从NdeI和XhoI位点之间克隆到表达载体pRSETb中。其他对照表达载体同样以类似方法克隆到表达载体PRSETb的NdeI和XhoI位点之间(图7)。蛋白载药系统转载Bak_BH3多肽及对照蛋白的表达与纯化首先，将表达质粒转化入表达菌株E.coli BL21(DE3)中；从转化的平板上挑选单菌落接种到含氨苄抗性的5ml LB液体培养基中培养过夜，然后取Iml过夜培养的菌液转接到含氨苄抗性的IOOml LB液体培养基中，370C，180rpm培养到菌液0D_值在0.6左右；接着添加诱导剂IPTG至终浓度0.5mM, 25°C诱导10小时；诱导表达结束后，4°C，7000g离心15分钟收集菌体，取部分菌体检测蛋白诱导表达情况(图8);接着按照实施例1中的方法纯化蛋白。蛋白载药系统转载Bak_BH3多肽诱导细胞凋亡的检测首先，将A549细胞与TIU-BH3蛋白孵育24小时，然后用含血清的培养基漂洗细胞一次，接着进行凋亡试剂盒进行染色，在免疫荧光显微镜下观察(图9);接着，将A549细胞分别与TIU-BH3，T1-BH3, Tat_BH3和TIU融合蛋白孵育24小时，然后用含血清的培养基漂洗细胞一次，收集细胞，接着进行凋亡试剂盒进行染色，利用流式细胞仪进行凋亡检测(图10)。根据图10分析，与TIU蛋白孵育组和对照组相比，孵育Tat-BH3融合蛋白的A549细胞出现20.45±2.89%的凋亡(ρ〈0.001，Tukey - Kramer);但是，孵育TIU-BH3融合蛋白的A549细胞出现的凋亡率升高到46.15±4.86%。同时，当A549细胞与10 μ M和20 μ M的TIU-BH3融合蛋白孵育，其凋亡率呈剂量依赖型模式。由于基于TAT转运的Tat-BH3融合蛋白，在进入细胞过程中大部分的融合蛋白困在内体，随后胞内的溶酶体中的蛋白酶消化，抑制了 Tat-BH3融合蛋白的生物活性的发挥；而基于TIU的融合蛋白中的内体逃离增强子INF7增强了 TIU-BH3从内体逃离进入细胞质的能力，使大部分的BH3多肽发挥出生物学功倉泛。当T1-BH3融合蛋白与A549细胞孵育时，相比于TIU-BH3融合蛋白，细胞凋亡率稍微有下降(p〈0.05)。由于TAT具有核定位作用，而T1-BH3融合蛋白中的BH3多肽不会与TAT分离，并且BH3多肽的目标分子都在细胞质中，因此TAT的核定位作用限制了 BH3多肽的生物功能。因此，认为蛋白载药系统与TAT相比提高了转运效率，进而促进了 BH3多肽诱导A549细胞凋亡。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护 范围。
权利要求
1.一种增强多肽药物从细胞内体逃离的蛋白载药系统，其特征在于，包括细胞穿膜肽TAT,内体逃离增强子INF7，泛素蛋白和多肽药物，所述TAT，INF7，泛素蛋白和多肽药物依次连接。
2.根据权利要求1所述的一种增强多肽药物从细胞内体逃离的蛋白载药系统，其特征在于，所述多肽药物包括Bak BH3多肽，Survivin生存素及其变体和WlO多肽中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种增强多肽药物从细胞内体逃离的蛋白载药系统，其特征在于，所述泛素蛋白来源于人。
4.编码权利要求1所述增强多肽药物从细胞内体逃离的蛋白载药系统的核酸，其序列如 SEQ ID N0.1 所示。
5.含有权利要求4所述核酸序列的表达质粒构建体。
6.权利要求1所述增强多肽药物从细胞内体逃离的蛋白载药系统在运载药物中的应用，其特征在于， 所述载药系统增强多肽药物从细胞内体逃离。
全文摘要
本发明公开一种增强多肽药物从细胞内体逃离的蛋白载药系统及其应用，包括细胞穿膜肽TAT，内体逃离增强子INF7，泛素蛋白和多肽药物，所述TAT，INF7，泛素蛋白和多肽药物依次连接。通过含有多个功能域的蛋白载药系统来增强多肽药物从细胞内体中释放，提高TAT转运多肽药物的效率,使药物快速从内体中释放，进而促进其药效充分地发挥。
文档编号C12N15/63GK103230599SQ20131017835
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月14日 优先权日2013年5月14日
发明者马兴元, 林南静, 郑文云, 李林凤, 刘蕙 申请人:华东理工大学