专利名称：鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的分子标记方法以及试剂盒和引物的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其涉及鉴定青花菜杂交种‘海绿’真实性和或品种纯度的分子标记方法以及试剂盒和引物。
背景技术：
优良品种是作物高产的基础，品种混杂和纯度不高则会明显降低产量和商品品质。快速准确地鉴定品种和进行纯度分析对于种子质量标准化、品种审定、假种辨别、产权纠纷均有重要作用。目前，我国种子生产和经营管理还不太规范，不合格的种子屡屡混入市场并用于生产，造成减产和经济损失，因此品种纯度鉴定显得尤为重要(吴敏生，王守才，戴景瑞，DNA指纹图谱技术在品种鉴定和纯度分析上的应用[J].农业生物技术学报，1998，6 (1):51-56;王忠华.DNA指纹图谱技术及其在作物品种资源中的应用[J].分子植物育种，2006，4 (3):425-430.)。目前生产中，青花菜杂交种通过自交不亲和系或雄性不育系制种。利用母本的自交不亲和性制种，由于自交不亲和性受环境因素影响会有少量自交种产生从而影响杂交种纯度。如不及时有效鉴定杂交种纯度，则会给青花菜生产带来严重损失。因此，对青花菜杂交种进行快速、准确而高效的纯度鉴定，对青花菜杂交种的推广应用具有重要的现实意义。传统的品种纯度检测方法有多种:幼苗鉴定、蛋白质电泳方法以及田间小区种植鉴定等(潘显政.农作物种子检验员学习读本[M].北京:中国工商出版社.2006:239 245.)。这些检测方法费时费力且不够直观。以DNA为基础的分子标记技术如简单重复序列(SSR)等，具有检测位点数量多，多态性高、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，已在青花菜品种鉴定、种子纯度检测和品种亲缘关系及分类等方面得到应用，并发挥着越来越重要的作用。
‘海绿’是由宁波海通食品科技有限公司、浙江省农业科学院蔬菜研究所等多家单位联合选育的国产优质青花菜杂交种，该品种的两个亲本均为通过小孢子培养技术获得的具有自主知识产权的DH系。2012年12月通过浙江省非主要农作物品种审定委员会审定(浙(非)审蔬2012010)。‘海绿’是通过小孢子培养技术获得的具有自产知识产权的两个DH系亲本杂交而成的优质品种。为保证该优良品种产生最大的经济效益，需要一种权威、准确、稳定检测方法对其商品种子的真伪及其纯度进行快速鉴定。
发明内容
针对目前青花菜品种种子纯度鉴定大多依靠田间表现型观察方法所存在的鉴定时间长、受季节性限制及作物的表现型易随环境条件变化等缺陷，本发明的一个目的是提供鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的引物，本发明的二个目的是提供鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的试剂盒，本发明的三个目的是提供鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的分子标记鉴定方法，本发明的方法能早期、全年、快速、准确鉴定青花菜品种纯度和或品种真伪。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案:
鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的引物，该引物为以下的4对引物中的I对或多对
组合:
1)引物0112-D05:上游引物的序列为5’ -TCCATGACCAACGACAAGGTC-3’，下游引物的序列为 5’ -AAGAGGCGACTTCTATTGCG-3’ ；
2)引物Ral-F06:上游引物的序列为5’ -ACCAAAATGTGTGAAGCCAC-3’，下游引物的序列为 5， -CTTGTGGCCAGATTCATCAC-3，；
3)引物FIT0439:上游引物的序列为5’ -CGAGAAGAGATAGCGGGT-3’，下游引物的序列为5’ -AGGTTGTGACTCCATCAAAG-3’ ；
4)引物OllO-All:上游引物的序列为5’ -CACAATTTCTCAGACAAAACGG-3’;下游引物的序列为 5’ -GAGCTGGCTCATTCAACTCC-3’。为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案:
鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的试剂盒，该试剂盒包括:上述技术方案所述的引物；dNTP ；Mg2+ ；PCR 缓冲液；Taq DNA 聚合酶。作为优选，所述的试剂盒还可以包括染色液和显色液，染色液为AgNO3溶液，显色液为NaOH、硼砂和甲醛的混合溶液。
为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案:
鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的分子标记鉴定方法，该方法包括如下步骤:
1)提取青花菜基因组DNA;
2)进行PCR扩增:在PCR管中加入步骤I)提取的青花菜基因组DNA15^30ng ;权利要求 I 所述的一对引物 0.2^0.8 μ M ；dNTP 0.15^0.5mM ；Mg2+l.2^2.0mM；l 倍的 PCR 缓冲液；Taq DNA聚合酶0.8^1.2单位，加无菌超纯水至15 μ L，进行扩增；
3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析:在步骤2)的扩增产物中加入甲酰胺上样缓冲液，混匀，将混合物在质量体积比浓度9%的双垂直板非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，200V稳压电泳2-3h，至二甲苯腈到达凝胶的2/3位置处停止电泳，凝胶经AgNO3染色和显色液显色后照相；
4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带特征，通过以下的特征鉴定青花菜杂交种‘海绿’纯
度:
SSR引物0112-D05产生的母本特异标记0112-D05210条带大小为210bp，产生的父本特异标记0112-D05200条带大小为200bp ；
SSR引物Ral-F06产生的三条母本特异标记Ral_F06135、Ral_F06145和Ral_F06155条带大小分别为135bp、145bp和155bp，产生的三条父本特异标记Ral-F06140、Ral-F06150和Ral-F06160条带大小分别为140bp、150bp和160bp ；
SSR引物FIT0439产生的母本特异标记FIT0439760条带大小分别为760bp，产生的两条父本特异标记FIT0439400和FIT0439700条带大小分别为400bp和700bp ；
SSR引物01 IOAlI产生的母本特异标记01 IOAl1120条带大小为120bp，产生的父本特异标记01 IOAl 1110条带大小为I IObp。作为优选，所述的甲酰胺上样缓冲液包括98%甲酰胺+IOmM EDTA+0.25%溴酚兰+0.25% 二甲苯腈。
作为优选，所述的扩增条件为:94°C预变性120 180秒，94°C变性60秒，50 55°C退火30秒，72 °C延伸45 90秒，25 35个循环，再72 °C延伸300 420秒，扩增完成。本发明的主要依据是:从所用引物中筛选出三个共显性标记，即能够在一代杂种中同时产生父本、母本特异标记条带，且带型清晰、重复性好、可靠性强的引物四个，分别是0112-D05、FIT0439、Ral-F06和01 IOAl I。可通过检测青花菜杂交种中是否同时具有父母本的特异条带来确定是否杂交种。如果同时具有父母本特异条带，则说明是杂交种。如果只有母本特异条带，则说明是自交结实的种子而非杂交种。如果是其它条带或没有条带，则说明不是自交种也不是杂交种。本发明的有益效果为:可以明确区分和判别青花菜的不同品种，实现准确、快速鉴定品种真实性和品种纯度，从而为品种鉴定、种子市场管理、品种保护、播前种子质量控制及良种繁育等提供可靠技术。无需在田间进行，不受天气影响，而且检测周期大大缩短。
图1为青花菜‘海绿’种子检测特征引物0112-D05的SSR-PCR电泳图谱。图2为青花菜‘海绿’种子检测特征引物FIT0439的SSR-PCR电泳图谱。图3为青花菜‘海绿’种子检测特征引物Ral_F06的SSR-PCR电泳图谱。图4为青花菜‘海绿’种子检测特征引物0110A11的SSR-PCR电泳图谱。M =DNA分子量标准；P1: ‘海绿’父本；P2 ‘海绿’母本；F1: ‘海绿’Fl杂交种;L1 L4分别为青花菜‘优秀’、‘绿雄90’、‘耐寒优秀’、‘喜鹊’等品种。
具体实施例方式
下面通过基于PCR技术的SSR标记分析实施例进一步说明本发明。本实施例的实验材料为青花菜‘海绿’商品种子及其亲本、生产上常用的4个其它青花菜品种(优秀、绿雄90、耐寒优秀、喜鹊)。方法:提取青花菜叶片的DNA，采用SSR分子标记进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳，统计结果并筛选特征弓I物。1.青花菜基因组DNA提取 采用常规方法提取青花菜基因组DNA。2.分子标记分析
SSR 反应体系为基因组 DNA 20 ng，Mg2+ 1.8 mM, dNTP 0.2 mM，引物 0.6 μ M，I 倍的 PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶0.8 U，加无菌超纯水至15 μ L。PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。扩增程序:94°C 120 秒，94°C 60 秒，50 55°C 30 秒，72°C 90 秒，30 个循环；72°C 300 秒。在PCR扩增产物中加入甲酰胺上样缓冲液(98%甲酰胺+IOmM EDTA+0.25%溴酚兰+0.25%二甲苯腈)，混匀，在双垂直板9%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行凝胶电泳分析，200V稳压电泳疒3 h，至二甲苯腈到达凝胶的2/3位置处停止电泳。凝胶经银染(0.2% AgNO3溶液)30min ;用显色液(1.5% NaOH, 0.4%甲醛)，显色后用清水清洗后照相。3.筛选纯度鉴定的特征引物
从所用的引物中筛选出能够在一代杂种中同时产生父、母本特异标记条带，且带型清晰、重复性好、可靠性强的引物共4对，分别是0112-D05、Ral-F06、FIT0439和0110A11，可作为青花菜‘海绿’种子真实性和/或品种纯度鉴定的特征引物(附图)。其中0112-D05、Ral-F06和FIT0439这3对引物可将‘海绿’与其它四个青花菜品种区分开。4对SSR引物序列为:
引物 0112-D05
F:5’ -TCCATGACCAACGACAAGGTC-3’，
R:5’ -AAGAGGCGACTTCTATTGCG-3’ ；
引物 FIT0439
F:5，-CGAGAAGAGATAGCGGGT-3，，
R:5’ -AGGTTGTGACTCCATCAAAG-3’ ；
引物 Ral-F06
F:5’ -ACCAAAATGTGTGAAGCCAC-3’，
R:5’ -CTTGTGGCCAGATTCATCAC-3’ ；
引物 OllO-All
F:5’ -CACAATTTCTCAGACAAAACGG-3 ；
R:5’ -GAGCTGGCTCATTCAACTCC-3’。SSR引物0112-·D05产生的母本特异标记0112_D0521(I条带大小为210bp，产生的父本特异标记0112-D05.条带大小为200bp ；SSR引物Ral_F06产生的三条母本特异标记Ral-F06135、Ral-F06145 和 Ral_F06155 条带大小分别为 135bp、145bp 和 155bp，产生的三条父本特异标记 Ral-F0614Q、Ral-F06150 和 Ral-F06160 条带大小分别为 140bp、150bp 和 160bp ；SSR引物FIT0439产生的母本特异标记FIT0439.条带大小分别为760bp，产生的两条父本特异标记FIT04394(i(i和FIT04397(i(i条带大小分别为400bp和700bp ；SSR引物0110A11产生的母本特异标记OIIOAII12ci条带大小为120bp，产生的父本特异标记0110A1111(I条带大小为IIObp。4.用特征引物对品种遗传纯度的鉴定
利用筛选到的4对SSR引物对青花菜‘海绿’进行纯度鉴定，步骤同1-3。只有同时具有双亲特异标记条带的单株才为真正的‘海绿’杂交种。通过应用4对SSR引物对杂种单株幼苗的标记基因型进行分析，检测得到的纯度结果的平均值为杂交种的遗传纯度。这4个SSR标记在多次重复中表明稳定，分析结果可以相互验证，可以准确地鉴定青花菜‘海绿’杂交种纯度。
权利要求
1.鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的引物，其特征在于该引物为以下的4对引物中的I对或多对组合: 1)引物Ol12-D05:上游引物的序列为5 ’ -TCCATGACCAACGACAAGGTC-3 ’，下游引物的序列为 5’ -AAGAGGCGACTTCTATTGCG-3’ ； 2)引物Ral-F06:上游引物的序列为5’ -ACCAAAATGTGTGAAGCCAC-3’，下游引物的序列为 5， -CTTGTGGCCAGATTCATCAC-3，； 3)引物FIT0439:上游引物的序列为5’ -CGAGAAGAGATAGCGGGT-3’，下游引物的序列为5’ -AGGTTGTGACTCCATCAAAG-3’ ； 4)引物OllO-All:上游引物的序列为5’ -CACAATTTCTCAGACAAAACGG-3’;下游引物的序列为 5’ -GAGCTGGCTCATTCAACTCC-3’。
2.鉴定青花菜杂交种 ‘海绿’品种纯度的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括:权利要求1所述的引物；dNTP ；Mg2+ ；PCR缓冲液；Taq DNA聚合酶。
3.根据权利要求2所述的鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的试剂盒，其特征在于试剂盒还可以包括染色液和显色液，染色液为AgNO3溶液，显色液为NaOH、硼砂和甲醛的混合溶液。
4.鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的分子标记鉴定方法，其特征在于该方法包括如下步骤: 1)提取青花菜基因组DNA; 2)进行PCR扩增:在PCR管中加入步骤I)提取的青花菜基因组DNA15^30ng ;权利要求I所述的一对引物0.2 0.8 μ M ；dNTP 0.15 0.5mM ；Mg2+l.2 2.0 mM ；1倍的PCR缓冲液；Taq DNA聚合酶0.8^1.2单位，加无菌超纯水至15 μ L，进行扩增； 3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析:在步骤2)的扩增产物中加入甲酰胺上样缓冲液，混匀，将混合物在质量体积比浓度9%的双垂直板非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，200V稳压电泳2-3h，至二甲苯腈到达凝胶的2/3位置处停止电泳，凝胶经AgNO3染色和显色液显色后照相； 4)依据各被鉴定样品在凝胶上条带特征，通过以下的特征鉴定青花菜杂交种‘海绿’纯度: SSR引物0112-D05产生的母本特异标记0112_D0521(I条带大小为210bp，产生的父本特异标记0112-D052QQ条带大小为200bp ； SSR引物Ral-F06产生的三条母本特异标记Ral_F06135、Ral_F06145和Ral_F06155条带大小分别为135bp、145bp和155bp，产生的三条父本特异标记Ral-F0614(l、Ral_F0615(l和Ral-F06160 条带大小分别为 140bp、150bp 和 160bp ； SSR引物FIT0439产生的母本特异标记FIT0439.条带大小分别为760bp，产生的两条父本特异标记FIT04394(KI和FIT04397(i(i条带大小分别为400bp和700bp ； SSR引物01 IOAlI产生的母本特异标记OIIOAII12ci条带大小为120bp，产生的父本特异标记OIIOAII1iq条带大小为IlObp0
5.根据权利要求4所述的鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的分子标记鉴定方法，其特征在于:甲酰胺上样缓冲液包括98%甲酰胺+IOmM EDTA+0.25%溴酚兰+0.25% 二甲苯腈。
6.根据权利要求4所述的鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的分子标记鉴定方法，其特征在于:上述的扩增条件为:94°C预变性120 180秒，94°C变性60秒，5(T55°C退火30秒，72°C延伸45 90秒，25 35 个循环，再72 °C延伸300 420秒，扩增完成。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定青花菜杂交种‘海绿’品种纯度的引物，该引物为以下的4对引物中的1对或多对组合1)引物Ol12-D05；2)引物Ra1-F06；3)引物FITO439；4)引物Ol10-A11。本发明的有益效果为可以明确区分和判别青花菜的不同品种，实现准确、快速鉴定品种真实性和品种纯度，从而为品种鉴定、种子市场管理、品种保护、播前种子质量控制及良种繁育等提供可靠技术。
文档编号C12N15/11GK103233077SQ201310177960
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月13日 优先权日2013年5月13日
发明者虞慧芳, 顾宏辉, 王建升, 赵振卿, 盛小光, 陈纪算, 许映君 申请人:浙江省农业科学院