专利名称：一种聚乙二醇修饰物的分离纯化介质及分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种分离纯化介质及分离纯化方法。具体的，本发明涉及一种聚乙二醇修饰物的分离纯化介质及分离纯化方法。
背景技术：
随着生物技术的发展，越来越多的生物药物被开发利用，全球生物药物的销售额逐年增长，09年达到1300多亿美元。其中，蛋白质/多肽药物在治疗人类重大疾病上发挥着越来越重要的作用。然而这些由氨基酸组成的多肽/蛋白质药物在体内注射给药时，不可避免地受到肾小球的过滤清除、酶的降解、抗体-抗原反应的影响，导致药物体内循环半衰期短，治疗中需要多次给药，增加了病人的痛苦和住院费用。针对蛋白质、多肽药物的这一缺陷，目前最有效的解决办法之一就是进行聚乙二醇修饰。聚乙二醇修饰是将活性聚乙二醇(PEG)分子与蛋白质/多肽药物偶联起来，其中 PEG是FDA批准的为数不多的医用高分子，它具有较大的水合半径和空间位阻，能够有效增加药物的分子尺寸，减少肾小球的过滤和蛋白酶的降解，延长药物的体内循环半衰期，提高药物疗效，减少给药频率，进而提高病人的生活质量。蛋白质或多肽药物经过聚乙二醇修饰后，需要进行分离纯化才能得到目标产物， 但是聚乙二醇修饰后，分子量和水力学半径的增加等理化性质的改变也带来分离纯化的困难。文献中有关蛋白质、多肽药物聚乙二醇修饰方法的研究很多，而对于同样重要的分离纯化介质的研究却很少。例如，Pabst等[J. Chromatogr. A，2007，1147 :172-182]使用常用的琼脂糖阴离子交换介质SP Sepharose 6FF分离PEG_BSA(PEG修饰的牛血清白蛋白)，当流速为250cm/h 时，动态载量为13. 6mg/ml,比未修饰的BSA降低了 3-4倍。对于另一种色谱介质Fractopr印 TMAE (Merck,孔径43. 4nm)，PEG-BSA的动态载量仅为0. 6mg/ml，与未修饰的BSA的动态载量(113. 5mg/ml)相比，降低了近百倍。另一个例子是对于聚乙二醇修饰重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-GCSF)的分离纯化，使用商品化SP Sepharose 6FF介质，其载量很低，不足 5mg/ml。为了实现有效分离，流速一般为lOOcm/h左右。CN 1903890A公开了一种超大孔聚合物微球的制备方法及其产品，其在含有单体的油相中添加高含量的表面活性剂，将含有单体和表面活性剂的油相分散到水相中，通过悬浮聚合，制备出超大孔微球，所述微球的粒径为1 200 μ m，孔隙率为10% 90%，内部具有两种孔分布，一种是1 60 μ m的超大孔，另一种是10 200nm的小孔，其适合作为液相色谱固定相基质、高效催化剂载体及高效吸附剂，特别适合作为分离生物大分子的分离介质。US 2010065500A1公开了一种超大孔聚合物微球及其制备方法，所述微球的孔径中，10 60%分布在500-900nm，其粒径在1-200 μ m，孔隙率在30% 90%。所述超大孔聚合物微球，适合作为液相色谱固定相基质、疏水相互作用介质、细胞载体、高效催化剂载体及高效吸附剂，特别适合作为分离生物大分子的分离介质基质。
与上述两种超大孔微球相比，本发明公开的超大孔微球的孔径经过优化，其中200-500nm的超大孔道占微球孔隙率的20 % -80 %，优选为30 % -70 %，更优选为 50% -70%。由于PEG修饰物的水力半径较大，通过对孔径进行优化后，上述孔径分布更适合PEG修饰物的分离纯化，既能够达到快速、高效的分离纯化，又能够有效保持被分离物的活性和收率。超大孔微球的制备方法已经在专利CN 1903890A中予以公开，具体包括以下步骤(1)在单体和交联剂的混合液中，加入引发剂、稀释剂和表面活性剂，搅拌，直至引发剂完全溶解；(2)将稳定剂溶于蒸馏水中，配制成一定浓度的水溶液，作为水相；(3)将油相加入水相，搅拌，升温聚合；(4)反应结束后，过滤，用蒸馏水和乙醇清洗数次，将稀释剂、表面活性剂等组分洗净，干燥后，即得超大孔微球。孔径的调控方法有以下二种(1)调节油相表面活性剂的加入量，表面活性剂加入量大，孔径相应增大，反之减小；( 调节交联剂用量，增加交联剂用量，孔道减小。通过配方的调整，即可得到孔径分布符合本专利要求的微球。现有技术的微球，由于现有常用介质包括多糖类介质、多孔合成介质的孔道较小， 一般在10-30nm范围内，而聚乙二醇修饰物的尺寸较大，可达到十多纳米至数十纳米，导致聚乙二醇修饰物在介质内部的传质阻力大，进入介质内部的速率低或难以进入介质内部， 因而造成介质利用率低、介质的载量低。同时，为了实现有效分离，操作流速也受到限制，严重影响了分离速度和生产效率。此外，由于不同修饰度的修饰物与未修饰物的差别较小，使用现有常规介质分离时，分辨率不高，因此造成目标产物收率会有一定程度的降低。而用于聚乙二醇修饰的蛋白质通常为具有药用价值的昂贵蛋白质，分离纯化效果的优劣直接影响了产品的成本。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种聚乙二醇修饰物的高效快速分离纯化介质，该介质可以在高流速下实现聚乙二醇修饰物的高效快速分离，可在线性流速为306-3056cm/h的范围内进行有效的分离纯化，渗透系数为1. 5 X 1012_3. 0 X 1012，介质的线性压力-流速范围为0-6112cm/h。所述聚乙二醇修饰物的高效快速分离纯化介质为一种聚合物微球，微球内部具有 200-500nm的超大孔道，超大孔占微球孔隙率的20% -80%，优选为30% -70%，更优选为 50% -70%，微球粒径为 5-150 μ m，优选为 30-100 μ m。本发明所述的聚合物微球作为分离介质使用，主要是由于其独特的物理结构，与其材料的选择以及制备方法相关不大。对于所属技术领域的技术人员来说，根据其掌握的专业知识，可以在不付出创造性劳动的前提下，根据具体用途和要求，从现有技术中自由选择材料及制备方法。由于所述材料及制备方法均是现有技术，本发明不再就此赘述。所述微球表面具有亲水覆层，亲水覆层根据具体要求进行化学衍生，以修饰上功能基团。所述亲水覆层衍生后的功能基团包括阳离子基团、阴离子基团、疏水基团、亲和基团或金属螯和基团，或其混合物。所述基团包括磺酸基(SP型)、季铵基⑴型)、羧甲基 (CM型)、二乙氨基乙基(DEAE型)、长碳链[-(CH2)n-CH3,η = 3-20)、苯基、谷胱甘肽(GST)、 Ni-金属螯和、Cu-金属螯和、Zn-金属螯和、Protein A, Protein G等或其混合物。微球表面的亲水覆层可以物理吸附于微球，也可以通过化学键合作用固定于微球表面。化学键和方法可以对亲水分子或聚合物微球进行化学修饰，促使两者反应。固定于微球表面的亲水覆层用交联剂进一步交联，以提高覆层稳定性。交联剂可以选择环氧氯丙烷、环氧氯丙烷-多元醇衍生物、二环氧丁烷、1，4- 丁二醇醚及含有活泼卤素化合物等多官能团化合物中的一种或至少2种的混合物。亲水性覆层物包括琼脂糖、葡聚糖、魔芋葡甘聚糖、聚乙烯醇、壳聚糖、明胶、海藻酸盐、胶原、纤维素、卡拉胶、阿拉伯胶或其混合物。所述混合物优选由至少2种组成，例如琼脂糖和葡聚糖，聚乙烯醇和壳聚糖，明胶、海藻酸盐和胶原等。本发明所述聚乙二醇修饰物，包括聚乙二醇修饰的蛋白、多肽、核酸、多糖、酶、化合物，特别包括重组人粒细胞集落刺激因子、重组人白介素、重组人干扰素、门冬酰胺酶、抗肿瘤化合物、胸腺肽1衍生物、重组人B淋巴细胞刺激因子、烟酸、人胰岛素、牛血红蛋白等。除聚乙二醇修饰物外，本发明提供的高效快速分离纯化介质还适用于其他生物大分子的分离纯化，包括蛋白质、多肽、核酸，以及白蛋白、多糖修饰的化合物。本发明的目的之一还在于提供一种聚乙二醇修饰物的高效快速分离纯化方法，所述方法采用所述的聚合物微球，将该聚合物微球装入色谱柱作为填料，对聚乙二醇修饰物进行分离。除聚乙二醇修饰物外，本发明所述的生物大分子的高效快速分离纯化方法，还适用于其他生物大分子的分离纯化，包括蛋白质、多肽、核酸，以及白蛋白、多糖修饰的化合物，其特征在于，所述方法采用分离纯化介质，所述介质可以在高流速下实现生物大分子的高效快速分离，可在线性流速为306-3056cm/h的范围内进行有效的分离纯化，介质的渗透系数为1. 5X1012-3. OX 1012，介质的线性压力-流速范围为0-6112cm/h。本发明的有益效果为所述的聚乙二醇修饰物的高效快速分离纯化介质，可以在高达612-3056cm/h以上的线性流速下进行分离，介质的渗透性能良好，有效蛋白载量高， 对于聚乙二醇修饰物的分离效果远远优于最常用的SP Sepharose 6FF介质，且其具有 200-500nm的超大孔，孔道内部及表面具有亲水覆层，亲水覆层可衍生成不同的功能化介质，以适用于不同的分离纯化要求。
图1-1和图1-2为超大孔超大孔离子交换介质SP-GiPST的电镜照片。图2为超大孔SP-GiPST介质和常规SP-S^harose 6FF琼脂糖介质压力-流速曲线对比。图3为超大孔SP-GiPST介质和常规SP-S^harose琼脂糖介质的柱效对比。图4-1和图4-2为不同流速下PEG-GCSF在常规SP-S印harose 6FF琼脂糖介质上的分离效果。图5为612cm/h流速下PEG-GCSF在超大孔SP-GiPST介质上的分离效果。图6为122km/h流速下PEG-GCSF在超大孔SP-GiPST介质上的分离效果。
具体实施例方式为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。实施例1 (亲水覆层超大孔微球的制备)超大孔聚合物微球已获得中国发明专利授权(授权号ZL200510087138. 0)。取 50g超大孔聚苯乙烯微球，微球内200-500nm的超大孔占微球孔隙的60%，将微球浸入的琼脂糖溶液，室温下恒温振荡12h，进行物理吸附。洗去未吸附的琼脂糖溶液。吸附琼脂糖后的微球进行抽滤后，进一步与25g交联剂环氧氯丙烷在70°C反应8h，以增加琼脂糖层的稳定性。同法可制得其他多糖覆层微球，如葡聚糖、魔芋葡甘聚糖等。实施例2 (超大孔SP离子交换介质的制备)将亲水覆层的超大孔微球在去离子水中充分浸泡溶胀，真空抽滤。称取IOg微球放入反应釜中，加入4. 5g无水硫酸钠、0. 5ml NaOH溶液、5ml烯丙基缩水甘油醚，搅拌速率 200rpm、反应温度80°C下反应12h。反应结束后，用去离子水和0. 5M乙酸依次清洗。再加入20g偏重亚硫酸钠，调解pH为6. 5，35°C下反应48h。反应结束后，用去离子水清洗，得到超大孔离子交换介质SP-GiPST，如图1所示。此外，根据多糖微球的常规修饰方法，可以根据需要制备其他离子交换、疏水、亲和等介质。实施例3 (超大孔介质和常规多糖介质SP-Sepharose 6FF机械性能和渗透性能的对比)将制备的超大孔离子交换介质SP-GiPST和作为对比的SP-S印harose 6FF介质用勻浆法分别装入50X5. Omm I. D. Tricorn柱，在Shimadzu HPLC(LC_20)色谱系统上， 以超纯水为流动相，测定不同流速下床层的压力降，得到压力-流速曲线(图2)和床层渗透系数K。SP-Sepharose 6FF介质的线性流速范围仅为0-1528cm/h，而超大孔离子交换介质SP-GiPST的线性流速范围高达0-3056cm/h。3056cm/h是仪器的最高测定限，说明 SP-GiPST介质的线性流速范围可以更高。从图中可以看出，在同一流速下SP-GiPST介质的压力降大幅度低于SP-Sepharose介质，即使在系统最大流速下，超大孔介质的压力降也仅为0. 27MPa，证明其良好的渗透性和优良的机械性能。作为对照，SP-kpharose 6FF介质的渗透系数为0. 82X1012,而超大孔SP-GiPST介质的渗透系数为1. 74X1012,是常规介质 SP-Sepharose 6FF的2. 1倍，同样证明超大孔微球良好的渗透性能。实施例4 (超大孔介质和常规多糖介质SP-S^harose 6FF的柱效对比)以生物大分子BSA作为探针蛋白，测定超大孔SP-GiPST介质的理论塔板高度并与常规SP-S印harose琼脂糖介质进行对比。先用10个柱体积的磷酸钠缓冲液B (pH 8，2M NaCl, 50mM PB)平衡系统，自动进样，每次100 μ 1 BSA溶液。以缓冲液B为流动相，考察不同流速下色谱柱的理论板高度(此时BSA在柱上没有保留。理论塔板高度的公式如下
HETP =---’- 54, ri 其中，HETP-理论塔板高度，mm ；L-色谱柱长度，mm ;tR-保留时间，min ；W172-半峰宽值，min。理论塔板高度(HETP)是表征色谱柱效的典型参数。对于SP-S印harose琼脂糖介质，其理论塔板数随流速的增加而增加，说明随流速增加，色谱柱的柱效逐渐降低，如图3 所示。而SP-GiPST介质的HETP值在流速从153cm/h增加到916cm/h时，HETP从1. Imm增加到2. 3mm，之后HETP值随流速增加基本不变，当增至系统最大流速(3056cm/h)时，HETP也仅为2. 5mm。说明流速增至916cm/h后，颗粒内的对流传质成为控制因素，而SP-kpharose 6FF介质主要受扩散传质控制。介质柱效的对比，进一步说明超大孔介质在高速分离蛋白领域的优越性。实施例5 (不同流速下PEG-GCSF在常规多糖介质SP-S印harose 6FF上的分离效果)使用的色谱柱和层析系统同实施例3，以20mM、pH 4. 5的HAc-NaAc溶液为缓冲液， 蛋白装载量为lmg/ml介质。在优化条件下进行分离纯化，“0”、“1”、“2”号峰分别对应于多修饰-PEG-GCSF、单修饰-PEG-GCSF、未修饰GCSF。从图4可以看出，当流速增加到306cm/h 以上(a. 306cm/h, b. 612cm/h)时，“ 1 ”峰和“2”峰相互重叠部分增加，色谱分离能力下降， 修饰混合物的组分无法有效分开。当流速为306cm/h时，目标产物单修饰-PEG-GCSF的回收率为90. 5 %，产品产率为73. 2%，纯度为92. 6%。当流速为612cm/h时，目标产物单修饰-PEG-GCSF的回收率为85. 0%，产品产率为70. 8%，纯度为90. 0%。回收率指此步分离纯化过程中，收集到的样品总量与上样品总量的比值，产率指经过此步分离纯化的单修饰产物占样品量的比例，纯度为单修饰峰(“1”峰)用HPLC-SEC 检测的结果。实施例6 (不同流速下PEG-GCSF在超大孔介质上的分离效果)使用的色谱柱和层析系统同实施例3，以20mM、pH 4. 5的HAc-NaAc溶液为缓冲液， 蛋白装载量为lmg/ml介质。分离纯化后，“0”、“1”、“2”号峰分别对应于多修饰^^^^^、 单修饰-PEG-GCSF、未修饰GCSF。当流速增加到612cm/h时，PEG修饰混合物在超大孔 SP-GiPST介质上的分离效果良好，如图5所示。目标产物单修饰-PEG-GCSF的回收率为 98. 8%，产品产率为78. 3%，纯度为97. 8%。优于常规多糖介质SP-在流速为306cm/h的分离纯化结果。实施例7 (不同流速下PEG-GCSF在超大孔介质上的分离效果)使用的色谱柱和层析系统同实施例3，以20mM、pH 4. 5的HAc-NaAc溶液为缓冲液， 蛋白装载量为lmg/ml介质。分离纯化后，“0”、“1”、“2”号峰分别对应于多修饰^^^^^、 单修饰-PEG-GCSF、未修饰GCSF。当流速增加到122km/h时，PEG修饰混合物在超大孔 SP-GiPST介质上的分离效果仍保持良好，证明超大孔介质对于PEG修饰物良好的分离效果，如图6所示。目标产物单修饰-PEG-GCSF的回收率为96. 2%，产品产率为77. 4%，纯度为96. 2%。优于常规SP-S^harose 6FF介质在流速为306cm/h的分离纯化结果。申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺条件和工艺流程， 但本发明并不局限于上述详细工艺条件和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺条件和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进， 对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
权利要求
1.一种聚乙二醇修饰物的高效快速分离纯化介质，其特征在于，该介质可以在高流速下实现聚乙二醇修饰物的高效快速分离，可在线性流速为306-3056cm/h的范围内进行有效的分离纯化，介质的渗透系数为1. 5X 1012-3. OX 1012，介质的线性压力-流速范围为 0-6112cm/h。
2.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰物的高效快速分离纯化介质，其特征在于，该介质为一种聚合物微球，微球内部具有200-500nm的超大孔道，微球粒径为5-150 μ m，优选 30-100 μm。
3.如权利要求2所述的聚乙二醇修饰物的高效快速分离纯化介质，其特征在于，所述微球表面具有亲水覆层，所述亲水覆层进行化学衍生，修饰上功能基团。
4.如权利要求3所述的聚乙二醇修饰物的高效快速分离纯化介质，其特征在于，所述亲水性覆层包括琼脂糖、葡聚糖、魔芋葡甘聚糖、聚乙烯醇、壳聚糖、明胶、海藻酸盐、胶原、 纤维素、卡拉胶、阿拉伯胶或其混合物。
5.如权利要求3或4所述的聚乙二醇修饰物的高效快速分离纯化介质，其特征在于，所述亲水覆层衍生后的功能基团包括阳离子基团、阴离子基团、疏水基团、亲和基团或其混合物。
6.如权利要求3-5之一所述的聚乙二醇修饰物的高效快速分离纯化介质，其特征在于，亲水覆层物理吸附于微球，或通过化学键合作用固定于微球表面。
7.如权利要求2-6之一所述的聚乙二醇修饰物的高效快速分离纯化介质，其特征在于，200-500nm的超大孔道占微球孔隙率的20 % -80 %，优选为30 % -70 %，更优选为 50% -70% ；优选地，所述聚乙二醇修饰物包括聚乙二醇修饰的蛋白、多肽、核酸、多糖、酶或化合物；特别指重组人粒细胞集落刺激因子、重组人白介素、重组人干扰素、门冬酰胺酶、抗肿瘤化合物、胸腺肽1衍生物、重组人B淋巴细胞刺激因子、烟酸、人胰岛素或牛血红蛋白。
8.—种聚乙二醇修饰物的高效快速分离纯化方法，其特征在于，所述方法采用如权利要求1-7之一所述的介质，将该介质装入色谱柱作为填料，对聚乙二醇修饰物进行分离
9.一种生物大分子的高效快速分离纯化方法，其特征在于，所述方法采用分离纯化介质，所述介质可以在高流速下实现生物大分子的高效快速分离，可在线性流速为 306-3056cm/h的范围内进行有效的分离纯化，介质的渗透系数为1. 5X 1012_3. 0X 1012，介质的线性压力-流速范围为0-6112cm/h。
10.如权利要求9所述生物大分子的高效快速分离纯化方法，其特征在于，所述生物大分子包括蛋白质、多肽、核酸，以及白蛋白、多糖修饰的化合物。
全文摘要
本发明涉及一种聚乙二醇修饰物的分离纯化介质及分离纯化方法，所述分离纯化介质为一种聚合物微球，微球内部具有200-500nm的超大孔道，超大孔占微球孔隙率的20％-80％，微球粒径为5-150μm。所述微球孔道内部及表面具有亲水覆层，亲水覆层可衍生成不同的功能化介质，所述方法可以在高达612-3056cm/h以上的线性流速下进行分离，介质的渗透性能良好，有效蛋白载量高，对于聚乙二醇修饰物的分离效果远远优于最常用的SP Sepharose 6FF介质。
文档编号C08G65/00GK102489266SQ20111035308
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者周炜清, 翟艳琴, 苏志国, 雷建都, 马光辉 申请人:中国科学院过程工程研究所