专利名称：一株肠道病毒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及 一株肠道病毒及其应用。
背景技术：
手足口病(Hand-Foot-mouth disease, HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染 病，近年来多爆发与亚太地区的热带区域，以婴幼儿发病为主。引起手足口病的肠道病毒 包括肠道病毒EV71型(肠道病毒71，Enterovirus 71，简称EV-71)和A组的柯萨奇病毒 (CoxA)、埃克病毒(Echo)等。其中EV-71是引起手足口病的主要病原，常导致严重的神经 系统综合症。EV-71是单股正链RNA病毒，分为A、B、C3个基因型，B1-B4及C1-C4共8个 亚型。该病以前虽有报道但多以散发病例出现，而09年在我国的安徽、河南和河北多个 地区呈爆发流行，对婴幼儿健康造成了严重的危害。因此，了解该病毒的特性对该疾病的预 防和治疗具有重要的指导意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株肠道病毒及其应用。本发明所提供的肠道病毒，是肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1， 它是20-30nm，圆形无囊膜的RNA病毒。肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1已于2010年4月2日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No 3674。将分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1在Vero细 胞上增殖并测得病毒的滴度后进行动物实验，实验证明，本发明的肠道病毒EV71型 (Enterovirus71)重庆分离株1为弱致病性毒株，为以后减毒疫苗的制备奠定了基础。
图1为肠道病毒EV71型重庆分离株1感染Vero细胞的电镜结果(30000倍)图2为肠道病毒EV71型重庆分离株1感染Vero细胞的电镜结果(39000倍)图3为肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1抗原片与手足口病患者 血清1 10的稀释液间接免疫荧光检测结果图4为肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1抗原片与手足口病患者 血清1 40的稀释液间接免疫荧光检测结果
具体实施例方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法.实施例1、肠道病毒 EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1的获得
1、肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1的分离 本发明的发明人采集经过临床鉴定为手足口病患者血清样品，然后进行病毒分 离，病毒分离的方法是将样品直接接种于Vero细胞，当细胞病变达到95%时，收集病毒培 养上清液，经过三轮的蚀斑纯化后挑取单斑，感染Vero细胞进行病毒的增殖收集细胞悬 液，得到病毒液，最终，发明人从重庆采集的样品中分离得到一株EV-71型病毒命名为肠道 病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1。随后进行了病毒特性及致病性的研究。肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1，已于2010年4月2日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No . 3674。2、形态学特征将步骤1获得的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1感染Vero细 胞(Invitrogen公司)，具体增殖方法为待Vero细胞长满单层25cm2方瓶培养瓶瓶底时，先 用移液管吸出细胞培养液，取2ml已经冻融3次的细胞悬液，IOOOrpm离心5-lOmin取上清 加入到培养瓶中，封口后放入37°C、5% CO2孵育2h，中间每个30min轻轻摇晃一次，2h后吸 出吸附液，补加8ml新鲜的含有2% FBS的DMEM维持液(向500mlDMEM液体中加入IOm胎 牛血清、IOOX Antibiotic-AntimycoticUOOX NEAA, lOOulHEPES,之后用实验室配制的经 过0. 22um滤膜过滤除菌的7. 5% (质量百分比)NaHCO3调节溶液的pH值至7. 0-7. 2，上述 液体均为GIBCO公司产品)，继续放入培养箱中培养，观察细胞，当细胞出现95%的病变时 收获细胞。感染Vero细胞(Invitrogen公司)后，37°C培养48小时后离心收集细胞沉淀 做超薄切片进行电镜观察，结果表明在细胞胞浆内可见20-30nm的圆形的病毒颗粒(图1 和图2)。3、理化性质核型实验将步骤1分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株 1病毒液(用肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1感染Vero细胞，当感染后 的Vero细胞出现95%左右的病变时，先吸出原有的细胞培养液，用一次性细胞刮刮起瓶底 的细胞，之后用原有的培养液悬浮细胞，反复冻融3次后，2000rpm离心5-lOmin，收集上清 后分装即为病毒液)分为加药组和无药组两组，加药组的细胞维持液加入5溴-2脱尿苷， 使其终溶度为50ug/ml，无药组不做任何处理，之后用含有2% (体积百分比)胎牛血清的 细胞维持液(向 500mlDMEM液体中加入 IOml 胎牛血清、lOOXAntibiotic-Antimycotic、IOOX NEAA、IOOul HEPES,之后用实验室配置的经过过滤除菌的7. 5% NaHC03(5!M^tfc)调节溶液的 PH值为7. 0-7. 2。上述液体均为GIBCO公司产品)进行10倍系列稀释(分别10—1、10_2、10_3、 10_4、10_5、10_6、ΙΟ"7, ΙΟ"8倍稀释)。最后将各稀释液接种于铺满单层Vero细胞(Invitrogen 公司)的96孔板中，每个稀释度接种4孔，0. 2ml/孔，37°C培养24-72小时连续观察记录细 胞生长情况。结果加药组和无药组均出现细胞病变，并且滴度均为10_5，证明步骤1分离得 到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1为RNA病毒。耐乙醚实验将步骤1分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离 株1病毒液(用肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1感染Vero细胞，当感染 后的Vero细胞出现95%左右的病变时，先吸出原有的细胞培养液，用一次性细胞刮刮起瓶 底的细胞，之后用原有的培养液悬浮细胞，反复冻融3次后，2000rpm离心5-lOmin，收集上清后分装即为病毒液)分为实验组和对照组两份，实验组用终浓度为20% (体积百分比) 的乙醚溶液处理，对照组不做任何处理，封口后都放入4°C放置过夜后，次日放入生物安全 柜中使乙醚完全挥发，用含有2% (体积百分比)胎牛血清的细胞维持液进行10倍系列 (分别 10-\10-2,10_3、10_4、10_5、10_6、10_7、10_8、10_9、10_10 倍稀释)稀释，分别接种于铺满单 层Vero细胞的96孔板中，每个稀释度分别接种个4孔，0. 2ml/孔，24-72小时连续观察记 录细胞生长情况。结果两组均出现明显的细胞病变，滴度均为10_4，证明步骤1分离得到的 肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1为无囊膜病毒。4、血清学特征用步骤1分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1感染Vero 细胞制备抗原片，抗原片制备的方法如下所述实验前准备把抗原片摆放在抗原架上，每个架上排放2排，1排4个，完毕后用罩 子盖上防止灰尘的进入。之后按照下面步骤进行1)待25cm2方瓶的Vero细胞生长至80%左右的时候，用实验病毒株2ml感染细 胞1小时后，吸出吸附液，补加新鲜的细胞维持液，放入培养箱中培养；2)当细胞出现细胞病变的时候(约25%-50%)，按照细胞传代的方法消化细胞， 用适量体积的培养液(含有10%胎牛血清的DMEM细胞生长液，具体配方向500mlDMEM液 体中加入 50ml 胎牛血清、100X Antibiotic-AntimycoticUOOX NEAA、lOOulHEPES，之后用 实验室配制的经过0. 22um滤膜过滤除菌的7. 5% (质量百分比)NaHCO3调节溶液的pH值 至7. 0-7. 2，上述液体均为GIBCO公司产品)；3ml)悬浮细胞，每个抗原孔加入40ul细胞悬 液，盖上盖子后放入培养箱中继续培养8小时；3)取一烧杯内盛PBS溶液(0. 01mol/L pH = 7. 2)，将吸附后的抗原片缓缓放入溶液中，浸泡Imin左右，取出放在工作台内晾干，约需30min ；4)将抗原片放入盛有丙酮(国药集团化学试剂有限公司分析纯浓度彡99. 5% ) 的烧杯中，-20 0C 30min或者过夜；5)取出晾干后保存于低温(-40°C以下)冰箱中备用。间接免疫荧光法用山东临床鉴定为手足口病恢复期患者的血清稀释液以及荧光 标记的IgG抗体分别进行间接免疫荧光检测，于显微镜下观察并照相。血清制备方法经过山东省成武县医院临床鉴定为手足口病患者，采集其恢复期 患者血液放置于37°C培养箱孵育30min，经800rpm离心15min后吸取上清得到。用0.005厘？!1值为7.2的？85配制2% (质量百分比)BSA(牛血清白蛋白)作为 血清稀释液，血清在使用前56°C水浴灭活30min，之后将血清按照实验要求进行稀释后进 行间接免疫荧光实验，具体实验步骤如下1)从冰箱中取出抗原片，肉眼观察上面的细胞是否脱落，如果有脱落孔，放弃不 用；2)在抗原片上用蜡笔在吸附有抗原的画圈周围划一圈，防止所加样品溢流；3)根据实验的需要稀释所检测的血清后加样，每孔20-25ul，一般需要做复孔，故 需要50ul，根据需要做倍比稀释；例首浓度按照1 10，故需要加入IOul血清+90ul抗体稀释液，在漩涡混合器 上充分混勻后取出50ul 1 10稀释液+50ul血清稀释液(1 20)，依此稀释下去，一般稀释至1 160 ；
4)把已经加样的抗原片放入铺有塑料板的饭盒中，放入37°C、5% CO2培养箱中孵 育 30min ；5)取出抗原片，放入洗板槽内，向里面加入洗涤液(0. 005M PBS+0. 02% (体积百分比) Tween 20)，在水平振荡器上洗涤5min，重复3次；6)待抗原片完全风干后，加入1 50稀释的荧光抗体25ul/孔，放入饭盒后在 37°C>5% CO2培养箱中孵育30min ；荧光抗体的稀释取出针对所加入血清来源的适量荧光抗体，用0.02% (质量 百分比)伊文斯兰溶液按照1 50稀释抗体，该实验所使用的抗体为FITC conjugate GoatAnti-Human IgG 购自 Sigma 公司。7)重复步骤5);8)风干后，滴加无菌水在荧光显微镜下观察荧光情况并记录结果。结果见图3和图4，根据间接免疫荧光检测的原理，图中的绿色点表明了所检测人 血清中的抗体可以与抗原片上吸附固定的病毒抗原发生特异性的反应，而且血清的效价可 以达到1 40。5、病毒全基因组序列测定和同源性分析按照步骤2的方法将步骤1分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆 分离株1感染Vero细胞后收集细胞以及培养上清，用试剂盒提取总的RNA，按照反转录酶的 说明书进行反转录。合成8对引物(F表示上游引物，R表示下游引物，引物序列均为5’-3’ 方向)，具体如下Fl TTAAAACAGCTGTGGGTTG ；Rl :ACTTCCAGTACCATCCCTTG。F2 :ATGGTCGGCTATGGTGAGTG ；R2 :AGTGAGTGTTGCTGATCCATGGT。F3 TGTTCACTGGGTCCTTTATGGC ； R3 :ACCAGCATAATTTGGGTTGGCT。F4 :ACCATTCATGTCACCTGCGA ；R4 :CTAGATACGACACATTCCCAAA。F5 :ATCAGCAAATTCATGGATTGGCT ；R5 ATGACATACACTAGCGATACAAC F6 TGCTTGTCATGCAATCCATCGC ； R6 :TAGCAGGCTTCCTCCATACTCAT。F7 :ACTAAGCTAGAGCCCAGTGT ；R7 :TCACGACCAGATTTCTGGTG。F8 GAAAAATTTGTGAGCACAAT ； R8 :GCTATTCTGGTTATAACAAAT。之后按照上述合成的引物进行扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，用凝胶纯 化试剂盒回收，之后送往上海英俊公司测序，经DNAstar Seqman软件拼接为全序列。采用 Blast、DNAstar、Meg Aligen 程序、Clustal W 软件以及 MEGA 4. 0 软件，对 EV-71 病毒株进 行同源性比对和核苷酸序列进化进行分析。结果表明8个片段经过拼接后组成基因组全 长，约7422个碱基(不包含poly (A)尾，序列如序列表中序列1所示)。基因组编码区起 于自序列表中序列1的5’端第744位核苷酸，止于自序列表中序列1的5’端第7326位， 共6582个碱基。5’和3’端各有一段非编码区，长度分别为743nt和97nt。碱基统计结果 表明，A含量最高，G含量最低，G+C含量为48%。将测得的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1的VPl的全序列(序列如序列表中序列1的5'第2439-3329位核苷酸) 与不同流行区和不同时间分离的多株EV-71型病毒相对应序列进行同源性比对，结果表明 其与本实验室分离肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分离株2同源性高达95. 3%，与首都儿科研究所2007年分离的BJ4211株同源性高达95. 4% (编码VPl蛋白的序列如序 列表中序列2 (GenBank :EU024958. 1))，与EV-71标准株BrCr (序列表中序列3，编码VP1蛋 白的序列如序列表中序列3的5'第2439-3329位核苷酸(GenBank :U22521. 1))在核苷酸 和氨基酸的同源性分别为83. 4%和95. 3%，而与CoxAie (编码VP1蛋白的序列如序列表中 序列4(GenBank :AF177911. 1))则分别为59. 5%和64. 2%。用Meg Aligen程序进行分析 表明所分离的C1V1病毒株在进化上属于C4基因亚型。二、肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1的致病性鉴定将步骤1分离的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1在Vero细胞 上大量增殖后，并在其上测定病毒的TCID5tl，结果表明该病毒的滴度为1X107。从北京军事 医学科学院实验动物中心领取2日龄Balb/c乳鼠进行该分离株致病性研究。实验采取腹 腔接种和脑内注射两种不同的接种方式，病毒的接种量为IOOOTCID5ci，同时设立对照组接种 PBS溶液，共4组(每组接种乳鼠1窝，平均8只，雌雄均有，各个剂量组腹腔注射lOOul、脑 内注射20ul)。连续观察小鼠结果表明，实验组 小鼠在接种后第3-7天内出现体重稍微减 轻、精神状态不佳外，与对照组小鼠无任何差异，连续观察21天，实验组小鼠无死亡。结果 表明，分离得到的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1为弱致病性毒株，为以 后减毒疫苗的制备提供了依据。
权利要求
一株肠道病毒，其名称为肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1，保藏登记号为CGMCC №.3674。
2.权利要求1所述的肠道病毒EV71型(Enterovirus71)重庆分离株1在制备手足口 病减毒疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株肠道病毒及其应用。该肠道病毒，其名称为肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1，保藏登记号为CGMCC №.3674。实验证明，本发明的肠道病毒EV71型(Enterovirus 71)重庆分离株1为弱致病性毒株，为以后减毒疫苗的制备奠定了基础。
文档编号A61K39/125GK101864399SQ20101017225
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月7日 优先权日2010年5月7日
发明者吴晓燕, 常国辉, 林磊, 祝庆余, 罗彦军 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所