专利名称：用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是用于扩增肠道病毒71型(EV71)的一套全面优化的工艺方法。
背景技术：
肠道病毒71型(EV71)是手足口病的重要病原体之一，由EV71感染引起的手足口病并发症较为严重，死亡率相对较高，因此研发EV71病毒相关疫苗是目前预防手足口病的研究热点.目前绿猴肾(Vero)细胞的大规模培养技术相对比较成熟，但在培养EV71病毒方面报导较少，目前有用Cytodexl作为载体培养EV71取得一定进展,但在聚纤维纸片(Fibradisk)载体上尚未报导。要完善这个工艺首先必须建立在对VERO细胞生理和生长特性的全面认识，以及对EV71感染细胞后的复制机理有全面把握。首先，细胞感染病毒前后会发生各种变化，如细胞干重、蛋白和核酸(DNA)含量、细胞大小都有不同程度的增加，Vero在不含血清的培养基中，Vero细胞感染病毒后直径扩大20%左右。在感染24，48小时后，细胞对葡萄糖的消耗以及氨和乳酸的生成量均增加了 30%- 100%，氧气(O2 )消耗和三磷酸腺苷(ATP)的生成也有类似的趋势，这可能是因为除了细胞正常生长外，感染的过程需要更多的能量。因此在培养病毒阶段更要注意营养物质的适度补给。一方面及时补充葡萄糖，因为在病毒扩增过程中，一旦葡萄糖耗竭会导致病毒扩增的停止。根据“细胞密度效应”，病毒的产量未必跟细胞密度成正比，当细胞密度大于某个数量级，病毒产量不再增加，其原因可能与单位体积内营养物质的争夺和代理产物毒性有关。在EV71扩增的过程中，之前的工艺摸索发现细胞密度在超过8X IO6个/ml后，病毒滴度将不再有明显成比例增长。有基础研究表明，EV71的复制的最短周期大概在20-24小时之间，从与细胞表面受体结合，经过内吞作用进入细胞，然后是DNA的复制、转录和表达以及病毒的组装，这个过程最快一批病毒的产 生在20-24小时左右,这一阶段病毒滴度
将会有一个指数级上升，从低不可测到105/ml以上，此外，初始接种病毒细胞数比值即感染复数(MOI)—般在1.0以下，实际上大部分细胞尚未被感染，病毒可以通过细胞连接或释放到细胞外，再次吸附两种方式再次感染细胞，在无血清培养基下让病毒继续吸附感染正常细胞将最终有利于病毒总体滴度的提高。由于在病毒培养阶段最好用不带有任何血清的培养基，因此探索一种较为廉价的无血清培养基非常关键。水解乳蛋白是一种安全有效的培养基添加剂，已有广泛的使用，在扩增EV71病毒中目前尚无报导使用，如何确定其添加成分在培养基中的浓度比例是一个值得摸索的方向。
发明内容
本发明的目的是要最大程度优化肠道病毒71型(EV71)的生物反应器扩增工艺，已期获得更高滴度的肠道病毒71型(EV71)，并且稳定该工艺，达到重复性好，稳定性高的特点，最终能用于肠道病毒71型灭活病毒疫苗的生产。
本发明以聚纤维纸片(Fibra disk)为载体，利用生物反应器扩增非洲绿猴肾(Vero)细胞，从而建立EV71复制扩增的全套工艺流程。本方法建立在对EV71复制扩增体系全面适应的条件下，在细胞培养阶段用含10%的血清的DMEM培养基，培养细胞第六天换液成无血清培养基，吸附肠道病毒71型病毒2.5-3.5小时，加入3-5%胎牛血清，继续培养22小时，弃去全部培养液，并用磷酸缓冲液(PBS)冲洗去除血清，全部换成无血清培养基加
0.5%水解乳蛋白，静止再吸附2小时利于更多细胞均匀感染病毒，另外，接种病毒后每24小时添加2g/L的葡萄糖，该方法在减轻后期纯化难度并适应生物制品的要求的基础上，使优化工艺达到较高的病毒滴度。本发明用生物反应器扩增EV71的优化工艺方法，具有如下步骤:1)在生物反应器内加入生长液，接种VERO细胞，批次换液培养5-6天，密度达到6X IO6个/ml以上，接种EV71，34°C静止吸附3小时，连续培养扩增病毒，每24小时左右批次换液收获；(2)72-96小时后，细胞每日葡萄糖消耗低于2g/L，共收获上清15-20L ; (3 )用膜包(mi 11 iporePellicon XL)浓缩20-50倍，用于进一步纯化。本发明的技术方案为:应用生物反应器全面优化EV71大规模扩增工艺，其具体包括如下步骤:
准备材料:
微载体:Fibra disk纸片载体150g ；
细胞:本发明所选细胞为可以扩增EV71病毒的细胞，优选非洲绿猴肾细胞(Veix)细胞)，购自美国ATCC ;病毒:本发明所用病毒为肠道病毒71型(EV71)等；接种感染复数MOI约为0.5 ；
细胞生长液:含体积浓度10%血清的DMEM培养基(美国Gibco公司)；
细胞维持液:含浓度0.5%水解乳蛋白(美国Gibco公司)的DMEM培养基(美国Gibco公
司)；
生长液葡萄糖含量测定方法:
葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法)，上海荣盛生物药业有限公司；将标明Rl和R2的试剂等量混合各1ml，加入20ul样品，37°C水浴13min，显色后，在波长505nm处读取吸光值；
葡萄糖(mmol/L)=样本吸光度(A) /校准吸光度(A) X校准液浓度；
葡萄糖(g/L) = mmol/LX 18 ；
糖耗(g/L)=原培养基葡萄糖含量(g/L)-培养24小时后葡萄糖含量(g/L)；
EV71病毒滴度测定:1.常规TCID法，病毒样品以10倍稀释度接种于96孔细胞培养板，96小时候通过显微镜下细胞病变效应(CPE)产生的噬斑计算病毒TCID50感染性滴度；
2.酶联免疫法(ELISA)测定病毒壳蛋白VPl蛋白的抗原滴度，用兔抗EV71血清抗体预包被酶标板，用双抗夹心法测定VPl抗原滴度，一抗为VPl单克隆抗体。种子细胞培养:细胞工厂培养种子细胞和病毒:细胞复苏后，在细胞培养瓶(美国Corning公司，)进行传代,每3天按1:3传,直至40瓶150ml培养瓶消化共得到8X IO8个细胞，接种到10层细胞工厂，(美国Corning公司)，底面积为640平方厘米，三天后消化得到2.3 X IO9个细胞左右。病毒种子培养:从最初构建后在2 5平方厘米(cm2)方瓶培养得到约为5.0LogTCID50/ml感染滴度的病毒，每次接种量即感染复数MOI在1.0以下，然后从75cm2扩增至150cm2，最后到细胞工厂(底面积640cm2)，得到种子病毒滴度大于7.5LogTCID50/ml。生物反应器细胞培养:10 L反应器内已加入灭菌后的150g Fibra disk载体，用PH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡过夜，弃去后加入细胞生长液，接种VERO细胞，接种量为(2.2±0.3)X IO9个细胞，进行培养。培养参数设定为:pH7.0-7.6、温度37°C、溶氧50_80%、搅拌速度50-60rpm。每天定时取样测定葡萄糖消耗情况,从而估计细胞生长情况，在稳定条件下，葡萄糖消耗与细胞密度线性相关。换液模式采用批式换液或连续灌注，具体根据细胞状态和葡萄糖消耗情况决定换液频率和体积，144小时细胞计数在(3.0±0.5) X IOici个细胞，密度达到8X IO6个/ml以上。病毒收获:144小时全换液,在无血清条件下吸附病毒3小时,然后加入5%的胎牛血清，继续培养22小时，换液成无血清培养基加0.5%水解乳蛋白，静止让新释放的病毒继续吸附未感染细胞。接毒后收获方式采用批式收获或连续灌注，同时补充相同体积的维持液，收获时间点为48、72、96和120小时各收获5L。本发明与其他生物反应器工艺比较，具有根据原理全面优化的特点，本工艺通过应用5L生物反应器和150g/5L Fibra disk纸片载体高密度连续培养宿主细胞，收获病毒的滴度最高点达108TCID50/ml以上，抗原滴度为320U/100ul以上。本发明具有以下优点和效果:本发明在减轻后期纯化难度并适应生物制品的要求的基础上，优化了生物反应器相关的培养条件和参数，尽可能达到了最大收获滴度，该方法同时具有很高的重复性和稳定性，高效EV71扩增工艺，可适用于任何以Fibra disk为载体的生物反应器扩增EV71。在一定规模下生产肠道病毒71型(EV71)疫苗具有很好性价比和应用前景，为节约人力物力成本 打下基础。
图1安普AP20sc反应器葡萄糖消耗和EV71病毒TCID50曲线。图2 NBS Bioflo310反应器葡萄糖消耗和EV71病毒TCID50曲线。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，以下用具体实施例来解释说明本发明。应理解，该实施例仅用于说明本发明而不是对本发明进行限制。实施例1
生物反应器:中国杭州安普生物工程有限公司IOL激流式生物反应器，工作体积为5L，型号:AP20sc ；
微载体=Fibra disk纸片载体(杭州安普生物工程有限公司)；
病毒:肠道病毒EV71浙江株C4亚型；接种MOI值约为0.5 ；
细胞生长液:含体积浓度10%血清的DMEM培养基(GIbco公司)；
细胞维持液:含体积浓度0.5%水解乳蛋白的DMEM培养基(Gibco公司)；
生物反应器细胞培养:10 L反应器内已加入灭菌后的150g Fibra disk载体，用PH7.2的磷酸盐缓冲液PBS浸泡过夜，弃去后加入细胞生长液，接种VERO细胞，接种量为(2.2±0.3)X IO9个细胞，进行培养。培养参数设定为:pH7.2-7.6、温度37°C、溶氧50_80%、搅拌速度50-60转/分(rpm)。每天定时取样测定葡萄糖消耗情况,从而估计细胞生长情况，在稳定条件下，葡萄糖消耗与细胞密度线性相关。换液模式采用批式换液，分别在48小时换液4L，96小时换液5L，120小时换液4L，144小时细胞计数在(3.5±0.3) X IO10个细胞，密度达到8X IO6个/ml以上。具体工艺流程参数见表I，葡萄糖消耗情况见图1。病毒收获:144小时换液8L,在无血清条件下吸附病毒3小时,然后加入5%的胎牛血清，继续培养22小时，换液成无血清培养基加0.5%水解乳蛋白，静止让新释放的病毒继续吸附未感染细胞。接毒后收获方式采用批式收获，同时补充相同体积的维持液，收获时间点为48、72、96和120小时各收获5L。共收获上清20L。病毒滴度测定结果见表2和图1。表1.安普AP20SC生物反应器工艺流程表
权利要求
1.一种用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法，其特征在于该方法以聚纤维纸片为载体，利用生物反应器扩增非洲绿猴肾细胞，在细胞培养阶段用含10%的血清的DMEM培养基，培养细胞第六天换液成无血清培养基，吸附肠道病毒71型病毒2.5-3.5小时，加入3-5%胎牛血清，继续培养22小时，弃去全部培养液，并用磷酸缓冲液PBS冲洗去除血清，全部换成无血清培养基加0.5%水解乳蛋白，静止再吸附1.5-2.5小时利于更多细胞均匀感染病毒，接种病毒后每24小时添加2g/L的葡萄糖，使优化工艺达到较高的病毒滴度。
2.根据权利要求1所述的用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法，其特征在于具有如下步骤:1)在生物反应器内加入生长液，接种绿猴肾VERO细胞，批次换液培养5-6天，密度达到6 X IO6个/ml以上，接种肠道病毒71型，34°C静止吸附2.5-3.5小时，连续培养扩增病毒 ，每24小时左右批次换液收获；(2) 72-96小时后，细胞每日葡萄糖消耗低于2g/L，共收获上清15-20L ；(3)用膜包浓缩20-50倍，用于进一步纯化。
3.根据权利要求1所述的用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法，其特征在于生物反应器所用聚纤维纸片载体为150克。
4.根据权利要求1所述的用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法，其特征在于肠道病毒71型接种量即感染复数MOI为0.5，即病毒颗粒数和细胞数比值。
5.根据权利要求1所述的用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法，其特征在于接毒后收获方式采用批式收获或连续灌注收获，同时补充相同体积的维持液，收获时间点为48、72、96和120小时。
6.根据权利要求1所述的用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法，其特征在于生物反应器设定参数:(I)细胞培养阶段PH7.0-7.6、温度37°C、溶氧50-80%、搅拌速度50-60rpm ；(2)接毒后，pH7.2-7.3、温度 34°C、溶氧 50-70%、搅拌速度 50_60rpm。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，特别是用于扩增肠道病毒71型时用到的一套优化的工艺方法。该方法以聚纤维纸片为载体利用生物反应器扩增非洲绿猴肾细胞，从而建立肠道病毒71型复制扩增的全套工艺流程。本方法建立在对肠道病毒71型复制扩增体系全面适应的条件下，在细胞培养阶段用含10%的血清的DMEM培养基，在病毒接种吸附后至24小时使用带3-5%的血清DMEM培养基，在收获病毒阶段采用无血清培养基添加0.5%的水解乳蛋白，同时每24小时补充2g/L的葡萄糖，该方法在减轻后期纯化难度并适应生物制品的要求的基础上，使优化工艺达到较高的病毒滴度。具有良好重复性、高效肠道病毒71型扩增工艺，可适用于任何以聚纤维纸片为载体的生物反应器扩增肠道病毒71型。
文档编号C12R1/93GK103215233SQ201310114730
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月3日 优先权日2013年4月3日
发明者陈科达, 姜云水, 高丽美, 王一虎, 周康凤, 朱莲, 王平, 毛子安, 高孟, 毛江森 申请人:浙江普康生物技术股份有限公司