专利名称：一种肠道病毒疫苗的制备方法
技术领域：
本发 明涉及一种肠道病毒疫苗的制备方法。
(ニ)
背景技术：
手足ロ病可由多种肠道病毒所引起，其中包括CoxA5，A10, A16，A19，EV71，以及部分埃可病毒和柯萨奇B组病毒，以CoxA16和EV71最为常见。肠病毒71型(EV71)是属人肠病毒属，小RNA病毒科,是手足ロ病的主要病原之一。婴幼儿感染后引起手足ロ及疱疹性咽峡炎，少数可发生无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿及急性弛缓性瘫痪等并发症，出现严重的神经系统、呼吸系统及循环系统症状。自1969年首次在美国加利福尼亚分离出病毒以来，全世界经历多次EV71的暴发流行。1997年以来，感染EV71的人数显著增加，特别在亚太地区，1997年马来西亚EV71感染约6000人，30多名儿童死亡，平均年龄I. 5岁。1998年台湾共报告129106例手足ロ感染，405名为严重中枢神经系统感染，78例死亡。2008年春季，我国安徽阜阳暴发手足ロ疫情，78名儿童死亡，近万人感染，引起了社会各界的普遍关注。我国卫生部自2008年5月，将该病列入法定报告传染病报告病种。近几年来，手足ロ病传染流行越来越广泛，尚未有有效的药物及疫苗可用于该病的治疗与预防。目前已有多家研究単位研究EV71疫苗，但尚有ー些不能令人满意的地方。目前用于生产EV71疫苗的基质细胞可分为ニ类ー类是二倍体细胞，主要是人胚肺细胞；ー类是Vero传代细胞。前者，EV71病毒在此二倍体细胞中繁殖滴度低，产量受到限制，扩大生产比较困难；对于后者，由于Vero细胞是传代细胞,疫苗中所含的传代细胞DNA含量需要在30ng以下，但去除病毒液中的DNA又较困难，导致生产成本较高、效率较低。因此，生产EV71疫苗的基质细胞尚需改进。
发明内容
本发明目的是提供EV71、CoxA16等肠道病毒疫苗的制备方法。本发明采用的技术方案是一种肠道病毒疫苗的制备方法，所述方法包括(I)取10 15天龄的沙鼠，处死，无菌取下肌肉组织(主要是骨骼肌)，剪碎，以含100U/ml卡那霉素的细胞培养液洗2次，去尽洗液；(2)肌肉组织加10倍质量的含O. 2% (w/v)胶原酶ΙΙ、0· 25% (w/v)胰蛋白酶的消化液，4°C消化过夜；w/v表示质量体积百分比浓度，某组分浓度1%表示IOOmL溶液中该组分含量为Ig ;(3)终止消化后弃去消化液，加质量为肌肉组织质量10倍的细胞培养液反复吹打，分散细胞，依次过100、200和400目的不锈钢滤网，收集滤液，离心，弃上清液，沉淀细胞用细胞培养液重新悬浮，加新生牛血清至其终浓度为10% (v/v)，接种至细胞瓶，36°C培养箱中培养；
(4)差速贴壁2h后，吸取细胞上清液，接种新培养瓶，36°C培养至细胞生长达到70% 80%融合时，换含5% (v/v)新生牛血清的细胞培养液继续培养，当细胞达到95%融合时，用于病毒接种；(5)取95%融合的肌肉单层细胞培养瓶，弃培养液，接种病毒滴度为IXlO3 tl 5 X IO3 0TCID50的含肠道病毒的病毒液，置35°C培养箱中使病毒吸附2h，弃病毒液，加含I %(v/v)新生牛血清、100U/ml卡那霉素的细胞培养液，35°C培养细胞出现病变(表现为细胞皱缩、变圆和脱落)，收获上清液(此为第2代病毒)；(6)收获的上清液作为病毒液接种至新制备的95%融合的肌肉单层细胞，按步骤
(5)重复操作4 5次，直至收获的上清液中病毒滴度大于I X IO6 tlTCID5ci (EV71经单层沙鼠肌肉细胞中连续传代5 6代后，细胞病变出现的时间可由原来的10天左右缩短至3天左右；病毒滴度可由原来的I 5X IO3tlTCID5。堤高至IXIO7qTCID5q以上)，离心去除细胞碎片，加10% (v/v)新生牛血清，再加病毒液2倍体积量的脱脂牛奶，即为病毒毒种，分装后，-80°C保存备用； (7)取步骤(6)病毒毒种，接种至新制备的95%融合的肌肉单层细胞培养瓶，置35°C培养箱中使病毒吸附2h，弃病毒液，用细胞培养液洗3次，加含100U/ml卡那霉素的无牛血清的细胞培养液，35°C培养2 3天，收获病毒上清液；(8)所得病毒上清液灭活后，经10万分子量孔径的超滤膜浓缩，再过S印harose或Sephacryl凝胶柱层析，收获第一峰，即为疫苗原液；疫苗原液经PBS稀释使抗原量为I 160左右，按0.5% (w/v)比例加人血白蛋白，得疫苗半成品，疫苗半成品再经检验、分装，即为疫苗成品；灭活采用常规β_丙内脂或甲醛灭活，用于病毒灭活的β_丙内脂体积用量为收获病毒体积量的三千之一至五千之一，如用甲醛灭活病毒，体积用量为收获病毒体积量的ニ千之一至四千之一。步骤(I) (7)中，所述细胞培养液为下列之一 ΜΕΜ培养液，FlO培养液或FlO/DMHM培养液。所述肠道病毒为肠道病毒EV71或CoxA16，可从手口足病患者水泡液中分离获得。所述疫苗也可为EV71与CoxA16双价疫苗，将肠道病毒EV71和CoxA16分别按步骤⑴ ⑶方法制得疫苗半成品，再按I : I体积比混合，经检验、分装后，得到EV71与CoxA16双价疫苗成品。本发明的有益效果主要体现在本发明选择沙鼠肌肉细胞作为培养EV71或CoxA16病毒的基质细胞，EV71或CoxA16病毒在此细胞上生长滴度高，可多次收液；此细胞可多次传代，并可建立成肌细胞株，用于疫苗的生产，节约沙鼠的消耗；它是原代细胞，不存在传代细胞DNA难以处理等问题，制备疫苗生产エ艺相对简単，纯化方便，它所制备的疫苗对婴幼儿接种，更安全、可靠。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :制备EV71单价疫苗(一 )制备细胞单层
取10 15天龄沙鼠，剪断颈动脉放血处死，置O. 2% (v/v)新洁而灭消毒液中浸泡30分钟，无菌取后腿肌肉细胞，剪碎，含100U/ml卡那霉素的MEM培养液洗二次，去尽洗液；加肌肉组织重10倍质量的O. 2% (w/v)胶原酶ΙΙ、0. 25% (w/v)胰蛋白酶消化液，置4°C消化；16 20小时后弃消化液，加肌肉组织重10倍质量的MEM液反复吹打分散细胞，依次过100、200和400目的不锈钢滤网，收集滤液，离心，弃上清液，沉淀细胞用MEM重新悬浮，加新生牛血清至最終浓度为10% (v/v)，接种细胞瓶，36 °C培养2 3天。当细胞生长达到70% 80%融合时，换5% (v/v)新生牛血清的MEM培养继续培养。细胞达到95%融合时，用于病毒接种；( ニ)病毒接种及传代原始EV71病毒株为现有已知的毒株(CGMCC No. 3650)，保存病毒的维持液为含10% (v/v)小牛血清、100U/ml卡那霉素的pH7. 2MEM培养液，其中病毒滴度约为Ixio3 0TCid50 ； 取上述步骤已生长良好的细胞瓶，弃培养液，加入EV71病毒，35 V培养箱中使病毒吸附2h，弃病毒液，加MEM培养液35°C培养至细胞出现病变(表现为细胞皱缩、变圆和脱落)，收获病毒液，冻融一次，使细胞中的病毒释放出来，离心去细胞碎片，收集上清液；病毒传代收获的上清液作为病毒液加入至新的95%融合的肌肉单层细胞培养瓶中，35°C培养箱中使病毒吸附2h，弃上清液，加MEM培养液35°C培养至细胞出现病变，收获病毒液，冻融一次，离心去细胞碎片，收集上清液重复上述操作直至获得第5代病毒的上清液，其病毒滴度约为I X IO7 tlTCID5ci，加10% (v/v)新生牛血清，再加病毒液2倍体积量的脱脂牛奶，经检定合格后，作为疫苗生产用毒种；(三)病毒増殖取以上病毒毒种，接种95%融合的肌肉单层细胞培养瓶，置35°C培养箱中使病毒吸附2h，弃病毒液，用MEM培养液洗3次，加含100U/ml卡那霉素的无牛血清的MEM培养液，35°C培养2 3天，收获上清液；(四)病毒灭活、浓缩与纯化将收获的病毒液加1/4000体积的丙内脂，灭活病毒2h。灭活的病毒，经10万分子量孔径的超滤膜浓缩适当倍数，再经S印harose或S印hacryl凝胶柱层祈，收获第一峰，即为疫苗原液。病毒原液需进行无菌试验、抗原量測定、残余牛血清測定和安全试验。各项试验和測定均合格者，进入下一道エ序。(五)加人血白蛋白将疫苗原液经PBS稀释使抗原量为I : 160左右，再按0.5% (w/v)加人血白蛋白，即为疫苗半成品。经无菌试验合格，进行分装，每支I. 1ml，即为成品。成品疫苗液体需进行外观检查、无菌试验、pH值测定、效カ測定、防腐剂试验、毒性试验。以上检测全部符合国家的疫苗制检规程的要求，即为EV71灭活疫苗。实施例2 :制备CoxA16疫苗在实施例I中将接种病毒更换为CoxA16病毒株(由杭州第六人民医院提供)，其它制备方法相同，可制备CoxAie疫苗半成品及疫苗成品。实施例3 :制备EV71与CoxA16双价疫苗在实例I制备的EV71疫苗半成品与实验例2制备的CoxA16疫苗半成品，按I : I体积比混合，进行分装，即为双 价肠道病毒疫苗。
权利要求
1.一种肠道病毒疫苗的制备方法，所述方法包括 (1)取10 15天龄的沙鼠，处死，无菌取下肌肉组织，剪碎，以含100U/ml卡那霉素的细胞培养液洗2次，去尽洗液； (2)加肌肉组织10倍质量的含O.2%胶原酶ΙΙ、0. 25%胰蛋白酶的消化液，4°C消化过夜； (3)終止消化后弃消化液，加质量为肌肉组织质量10倍的细胞培养液反复吹打，分散细胞，依次过100、200和400目的不锈钢滤网，收集滤液，离心，弃上清液，沉淀细胞用细胞培养液重新悬浮，加新生牛血清至其终浓度为10%，接种至细胞培养瓶，置36°C培养箱中培养； (4)差速贴壁2h后，将上清悬浮细胞转移至新的细胞培养瓶，36°C培养至细胞生长达到70% 80%融合时，换含5%新生牛血清的细胞培养液继续培养，当细胞达到95%融合时，用于病毒接种； (5)取95%融合的肌肉单层细胞培养瓶，弃培养液，接种病毒滴度为IX 103_° 5 X IO3 0TCID50的含肠道病毒的病毒液，置35°C培养箱中使病毒吸附2h，弃病毒液，加含I %新生牛血清、100U/ml卡那霉素的细胞培养液，35°C培养至细胞出现病变，收获上清液； (6)收获的上清液作为病毒液接种至新制备的95%融合的肌肉单层细胞，按步骤(5)重复操作4 5次，直至收获的上清液中病毒滴度大于I X IO6 ciTCID5tl，离心去除细胞碎片，加10 %新生牛血清，再加病毒液2倍体积量的脱脂牛奶，混匀，即为病毒毒种，分装后，-80°C保存备用； (7)取步骤(6)病毒毒种，接种至新制备的95%融合的肌肉单层细胞培养瓶，置35°C培养箱中使病毒吸附2h，弃病毒液，用细胞培养液洗3次，加含100U/ml卡那霉素的无牛血清的细胞培养液，35°C培养2 3天，收获病毒上清液； (8)所得病毒上清液灭活后，经10万分子量孔径的超滤膜浓縮，再过S印harose或Sephacryl凝胶柱层析，收获第一峰，即为疫苗原液；疫苗原液经PBS稀释使抗原量为1 160，按0.5%比例加人血白蛋白，得疫苗半成品，疫苗半成品再经检验、分装，即为疫苗成品； 步骤⑴ (7)中，所述细胞培养液为下列之一 MEM培养液，FlO培养液或F10/DMEM培养液。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述肠道病毒为肠道病毒EV71或CoxA16。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I) (7)中所述细胞培养液为MEM培养液。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述疫苗为EV71与CoxA16双价疫苗，将肠道病毒EV71和CoxAie分别按步骤(I) (8)方法制得疫苗半成品，再按比例混合，经检验、分装后，得到EV71与CoxA16双价疫苗成品。
全文摘要
本发明提供了一种以沙鼠肌肉细胞作为病毒培养的基质细胞制备肠道病毒疫苗的方法。本发明选择沙鼠肌肉细胞作为培养EV71或CoxA16病毒的基质细胞，EV71或CoxA16病毒在此细胞上生长滴度高，可多次收液；此细胞可多次传代，可建立成肌细胞株，用于疫苗的生产，节约沙鼠的消耗；它是原代细胞，不存在传代细胞DNA难以处理等问题，制备疫苗生产工艺相对简单，纯化方便，所制备的疫苗对婴幼儿接种，更安全、可靠。
文档编号A61P31/14GK102657858SQ20121012707
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月26日 优先权日2012年4月26日
发明者周小龙, 夏时畅, 姚苹苹, 徐芳, 朱函坪, 朱智勇, 杨章女, 谢荣辉, 钱磊 申请人:浙江省疾病预防控制中心