专利名称：基于量子点/氧化石墨烯纳米平台的单增李斯特菌多基因检测方法
技术领域：
本发明属于基因纳米检测技术领域，特别涉及基于量子点/氧化石墨烯纳米平台的单增李斯特菌多基因的检测方法。
背景技术：
食源性致病菌是影响食品安全的重要原因之一，严重威胁人类健康，并给人类社会带来巨大的经济损失。据美国疾病控制与预防中心报道，美国每年由食品致病菌导致的病例有7600例，其中死亡5000例。因此，完善的食品致病菌检测方法体系已成为世界各国监管食品安全性的重要措施。食源性致病菌来源多样、能在食品中快速繁殖、能在恶劣环境中存活，这给食源性致病菌的检测、预防及治疗带来了巨大挑战，并对食品安全构成直接威胁。因此，建立健全食源性致病菌检测体系对于食品安全具有重大意义。传统的食源性致病菌检测方法有:常规培养检测法、免疫分离法、显微观察法等，这些方法成本低廉、能给出定量及半定量信息。但是存在耗时长、灵敏度不高、特异性不好、仪器设备昂贵等缺点。近年来，随着分子生物学的飞速发展，一系列基于核酸水平的基因快速检测技术涌现出来。目前，基因快速检测方法主要包括有聚合酶链式反应(PCR)方法、核酸恒温扩增技术、Taqman探针技术，LightCycler探针技术,复合探针技术,基因芯片检测技术，生物传感器检测技术等。这些技术彻底的改变了原有的食源性致病菌检测技术体系，但以上方法存在各自的不足，存在信噪比较低、存在背景信号干扰、使用有毒有害试剂、步骤繁琐等缺点，且这些技术大多是基于单基因的检测技术，对于高传染性、高致病性且广泛传播的食源性致病菌，只着眼于单基因的检测技术显然不能得到足够的可靠性，容易发生假阴性及漏检等问题。
发明内容
为了克服现有方法存在的不足，`本发明的目的在于提供一种基于量子点/氧化石墨烯纳米平台的单增李斯特菌多基因检测方法。该检测方法通过选择单增李斯特菌两个或者两个以上的基因作为基因检测的靶点，对单增李斯特菌的检测可靠性高。本发明的目的通过以下技术方案实现:一种基于量子点/氧化石墨烯纳米平台的单增李斯特菌多基因检测方法，包括以下步骤:I)引物设计对目标基因进行分析，确定目标基因的保守区；利用引物设计软件分别对目标基因进行引物设计；设计引物时，保持限制引物的退火温度高于过量引物5 10°C ；2)基因组提取将菌种加入液体培养基中培养；对培养的单增李斯特菌进行基因组DNA抽提；3)验证引物可行性
通过PCR实验，扩增目标基因；对扩增产物进行电泳检测，选择选择电泳条带清晰且特异性好的引物作为LATE-PCR的扩增引物；4)优化 LATE-PCR对引物浓度比例位于1:50-100范围内的多组引物进行PCR反应，产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测，选择特异性较好、扩增效率高的引物作为LATE-PCR的引物；5)量子点荧光探针的制备选用两种或两种以上荧光发射峰不同的量子点，其表面分别标记链霉亲和素；将表面标记有链霉亲和素的量子点分别与5’生物素标记的DNA探针混匀，避光孵育，使表面标记有链霉亲和素的量子点与5’生物素标记的DNA探针充分结合，形成量子点荧光探针；再通过分子筛超滤使游离的DNA探针与量子点荧光探针分离，将分离后的量子点荧光探针溶解于磷酸盐缓冲液中；6)多元 LATE-PCR 实验根据步骤4)优化的引物比例添加引物，建立LATE-PCR反应体系，以同时扩增出多基因的单链产物，并适当调整不同基因间的引物配比，使不同基因的扩增效率相一致；7)杂交实验取步骤5)中制备的量子点荧光探针与步骤6)中的多元LATE-PCR扩增产物相混匀，进行杂交；然后，取适量的氧化石墨烯淬灭未杂交、游离的量子点荧光探针，最后用分光光度计检测信号。进一步的,步骤2)中采用TIANamp Bacteria DNA kit试剂盒对单增李斯特菌进打基因组DNA抽提。进一步的，步骤5)中表面标记有链霉亲和素的量子点分别与5’生物素标记的DNA探针按1:30的比例混匀，避光孵育30min。进一步的，步骤5)中分离后的量子点荧光探针的浓度为15nM。进一步的，步骤7)中量子点荧光探针与多元LATE-PCR扩增产物于37°C杂交30mino相对于现有技术，本发明的有益效果如下:1.利用氧化石墨烯吸附单链核酸并能淬灭其上标记的荧光标记物的原理，有机的将多元LATE-PCR的原理与量子点/氧化石墨烯纳米平台结合起来，以达到检测单增李斯特菌多基因的目的。2.本发明所使用的LATE-PCR扩增和量子点检测技术的效率都很高，因而测量的灵敏度很高。3.本发明避免了传统PCR检测技术在扩增过程完成后，还需要利用耗时的电泳检测等手段，检测过程更加简单，快速。4.本发明实现了单增李斯特菌的多基因检测，克服了在检测高传染性、高致病性且广泛传播的单增李斯特菌时，可靠性不足的缺点。
以下结合附图对本发明进行详细 描述。
图1为多元LATE-PCR扩增产物电泳图。图2为单增李斯特菌的hlyA基因检测灵敏度结果图。图3为单增李斯特菌的iap基因检测灵敏度结果图。图4为单增李斯特菌检测特异性结果图。
具体实施例方式本发明基于量子点/氧化石墨烯纳米平台的单增李斯特菌多基因检测方法包括以下步骤:I)引物设计利用DNAman对目标基因的保守区进行分析，确定目标基因的保守区。利用引物设计软件Primer Premier分别对hlyA和iap基因进行引物设计,设计出的序列从上海英骏购买，纯化方式选择iDSL。引物序列见下表:表1.hlyA及iap基因LATE-PCR引物序列
权利要求
1.一种基于量子点/氧化石墨烯纳米平台的单增李斯特菌多基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)引物设计 对目标基因进行分析，确定目标基因的保守区；利用引物设计软件分别对目标基因进行引物设计；设计引物时，保持限制引物的退火温度高于过量引物5 10°C ； 2)基因组提取 将菌种加入液体培养基中培养；对培养的单增李斯特菌进行基因组DNA抽提； 3)验证引物可行性 通过PCR实验，扩增目标基因；对扩增产物进行电泳检测，选择选择电泳条带清晰且特异性好的引物作为LATE-PCR的扩增引物； 4)优化LATE-PCR 对引物浓度比例位于1: 50-1OO范围内的多组引物进行PCR反应，产物用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染检测，选择特异性较好、扩增效率高的引物作为LATE-PCR的引物； 5)量子点荧光探针的制 备 选用两种或两种以上荧光发射峰不同的量子点，其表面分别标记链霉亲和素；将表面标记有链霉亲和素的量子点分别与5’生物素标记的DNA探针混匀，避光孵育，使表面标记有链霉亲和素的量子点与5’生物素标记的DNA探针充分结合，形成量子点荧光探针；再通过分子筛超滤使游离的DNA探针与量子点荧光探针分离，将分离后的量子点荧光探针溶解于磷酸盐缓冲液中； 6)多元LATE-PCR实验 根据步骤4)优化的引物比例添加引物，建立LATE-PCR反应体系，以同时扩增出多基因的单链产物，并适当调整不同基因间的引物配比，使不同基因的扩增效率相一致； 7)杂交实验 取步骤5)中制备的量子点荧光探针与步骤6)中的多元LATE-PCR扩增产物相混匀，进行杂交；然后，取适量的氧化石墨烯淬灭未杂交、游离的量子点荧光探针，最后用分光光度计检测信号。
2.根据权利要求1所述的单增李斯特菌多基因检测方法，其特征在于:步骤2)中采用TIANamp Bacteria DNA kit试剂盒对单增李斯特菌进行基因组DNA抽提。
3.根据权利要求1所述的单增李斯特菌多基因检测方法，其特征在于:步骤5)中表面标记有链霉亲和素的量子点分别与5’生物素标记的DNA探针按1:30的比例混匀，避光孵育 30min。
4.根据权利要求3所述的单增李斯特菌多基因检测方法，其特征在于:步骤5)中分离后的量子点荧光探针的浓度为15nM。
5.根据权利要求 1至4任一项所述的单增李斯特菌多基因检测方法，其特征在于:步骤7)中量子点荧光探针与多元LATE-PCR扩增产物于37V杂交30min。
全文摘要
本发明公开一种基于量子点/氧化石墨烯纳米平台的单增李斯特菌多基因检测方法，属于基因纳米检测技术领域。该单增李斯特菌多基因检测方法通过选择单增李斯特菌两个或者两个以上的基因作为基因检测的靶点，根据基因保守区分析结果，设计两对或者两对以上基因的PCR扩增引物，通过LATE-PCR的原理，同时扩增两个或者两个以上基因的特定序列，得到相应的单链扩增产物；然后，再让单链扩增产物与量子点荧光探针杂交，最后用氧化石墨烯去淬灭掉未杂交的量子点探针，当目标基因不存在时，所有的量子点荧光探针都会被淬灭；相反当目标基因存在时，就会得到相对应的荧光信号。利用该检测方法对单增李斯特菌的检测可靠性高。
文档编号C12Q1/68GK103233078SQ20131017881
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月14日 优先权日2013年5月14日
发明者周小明, 邢达, 廖玉辉 申请人:华南师范大学