专利名称：一种苹果酸乳酸转化高活力菌株的制作方法
一种苹果酸乳酸转化高活力菌株技术领域：
本发明涉及一种微生物，尤其涉及一种苹果酸乳酸转化高活力菌株，该菌株为植物乳杆菌植物亚种 RF17 (Lactobacillus pi ant arum subsp. plantarum)。
背景技术：
果酒中高含量的苹果酸会导致酒体酸涩、粗糙感强，苹果酸-乳酸发酵是乳酸菌以双羧基的L-苹果酸为底物，在苹果酸-乳酸酶催化下转变成单羧基L-乳酸和CO2的过程，此过程可使酒体变柔和，并起到风味修饰作用，是酿造优质果酒的重要生物降酸工序之一。但是果酒中高含量的二氧化硫和酒精浓度、低PH值、及较低的发酵温度等均抑制了乳酸菌的生长，从而大大降低了乳酸菌的降酸效果。为了解决上述问题，本申请人于2011年09月20日申请的公开号为CN102358888A、名称为“一株植物乳杆菌R23”中国专利；《中国农学通报(增刊)》，2010年8月，26 =204-208 ;及《福建农业学报》2009年12月，24 (6):570_574等文献上均揭露了一株从枇杷酒醪中筛选出的菌株即植物乳杆菌R23，该植物乳杆菌R23具有较强的苹果酸乳酸发酵能力和抗逆性，已在枇杷酒、刺葡萄酒、杨梅酒等果酒生物降酸，以及酸性果蔬汁的乳酸发酵饮料生产中得到良好应用；其主要作用机制是，果酒中的苹果酸在菌体合成的苹果酸乳酸酶的催化下转化为乳酸，从而使酒体酸度下降，口感柔和，此过程是生产高品质果酒的关键技术；而在果蔬汁乳酸发酵中，该菌株能快速适应PH3. O以上的酸性环境，并以有机酸为主要碳源进行增殖，突破乳酸发酵的技术瓶颈，同时赋予果蔬汁愉快协调的发酵香；苹果酸乳酸转化活力的大小间接反映了苹果酸乳酸酶活力的大小，并直接影响着苹果酸乳酸发酵进行的程度，是选择优良苹果酸乳酸发酵(malolactic fementation,MLF)菌株的基本标准。虽然上述植物乳杆菌R23能够对果酒起到良好的降酸效果，但从业人员希望获得苹果酸乳酸转化活力更高的菌株，从而为果酒的生物降酸及乳酸发酵功能性饮料的研究等·提供新菌源。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种苹果酸乳酸转化高活力菌株，该菌株为植物乳杆菌植物亚种 RF17(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum RF17),且该植物乳杆菌植物亚种RF17于2012年03月16日保藏于位于武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:M2012085o本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的本申请人对植物乳杆菌R23 (Lactobacillus plantarum)进行紫外亚硝基胍复合诱变得到的菌株，通过对该菌株进行形态学、生理生化和分子生物学鉴定，最终鉴定其为植物乳杆菌植物亚种的一个菌株。进一步地，该菌株能在具有如下至少一个条件的酒体内正常生长
SO2 含量120±10mg/L;
酒精度(v/v)13 ±2%;
pH 值1.5±0_2;
总酸(以苹果酸计)1.0 + 0.2%; 培养温度18±2 。本发明的有益效果在于提供一种植物乳杆菌植物亚种RF17 (Lactobacillusplantarum subsp. plantarum),该菌株不仅具有较强的苹果酸乳酸转化活力、益生特性,而且抗逆性高，可在苹果酸乳酸酶的催化作用下进行苹果酸乳酸发酵，能更有效降低果酒、果
汁中的苹果酸、增加乳酸及挥发酯等的含量，从而使果酒、果汁口感更加柔和、协调，气味芳香浓郁，为提高果酒、果汁品质奠定基础，进而为果酒的生物降酸及乳酸发酵功能性饮料的研究提供新的菌源。
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。图I是本发明中菌株RF17的革兰氏染色示意图。图2是本发明中菌株RF17的扫描电镜示意图。图3是本发明中菌株RF17的透射电镜示意图。图4是本发明中菌株RF17与相关种的16SrDNA序列系统发育树示意图。图5是本发明中菌株RF17与相关种的pheS序列系统发育树示意图。图6是本发明中菌株RF17与植物乳杆菌R23的凝集特性示意图。图7是本发明中菌株RF17与对照菌株的抗氧化能力示意图。
具体实施方式本发明植物乳杆菌植物亚种RFlKLactobacillus plantarum subsp. plantarum)是对植物乳杆菌R23 (Lactobacillus plantarum)进行紫外亚硝基胍复合诱变得到的。一、该菌株RF17的获得将2mL浓度为2. O 3. O X 107cfu/mL植物乳杆菌R23的菌悬液进行离心收集菌体，并往收集到的菌体中添加亚硝基胍以形成亚硝基胍溶液，且该亚硝基胍溶液中亚硝基胍的浓度为2mg/mL,之后置28°C摇床150r/min振荡处理60min,振荡结束后按2. 5倍亚硝基胍溶液体积加入25%硫代硫酸钠溶液终止反应,接着于12000rpm下离心IOmin,弃去上清液，用5mLPBS溶液洗涤菌体三次；然后于洗涤后的菌体中加2mLPBS溶液以混匀菌体得菌液，取该菌液O. ImL涂布于计数平板上，再将计数平板置于距离15w紫外灯20cm下照射20s，照射完毕后用黑布包好计数平板并置于28°C下培养3d;将形态特征相同的菌株进行剔除，用接种环挑取剩余菌株于改良TJA斜面培养基中，并编号，28 °C培养3d ;之后将改良TJA斜面培养基中的菌株等量接种于测试培养基中，28°C培养18h后，分别测定接种不同菌株的测试培养基中的总酸，且以植物乳杆菌R23为对照菌，筛选出降酸能力最强的菌株，并命名该菌株为菌株RF17。
其中，植物乳杆菌R23的菌悬液制备方法为将植物乳杆菌R23接种于LH18培养基中进行培养，取对数生长期菌液5mL于IOmL无菌离心管中，并将该无菌离心管置于12000r/min下离心IOmin,弃去上清液,用无菌PBS溶液5mL洗漆两次,再加5mL无菌PBS溶液混匀，最后将此菌液稀释100倍，所得的菌体悬浮液即为浓度为2. O 3. OX 107cfu/mL的菌悬液，待用；PBS溶液的配制按照O. 2mol/L磷酸氢二钠26. 5mL 0. 2mol/L磷酸二氢钠73. 5mL的比例混合，并调节溶液的pH至6. 4即得所需的PBS溶液；计数平板与改良TJA斜面培养基的组分均为番茄汁50mL，酵母抽提液5g，牛肉膏10,乳糖20g,葡萄糖2g,磷酸氢二钾2g,吐温80. Ig,乙酸钠5g,加蒸懼水至1L,ρΗ6· 8±0· 2，121°C下灭菌 20min ；测试培养基的组分为番茄汁10%，酵母膏O. 2%，牛肉膏O. 4 %，MgSO4O. 02%,乙酸钠 O. 5%, Tween-800. 1%，柠檬酸铵 O. 2%, MnSO4 O. 005%,胰蛋白胨 1%，苹果酸 O. 5%, ρΗ4· 8±0· 2，I X IO5Pa 下灭菌 20min ；LH18培养基(下同)的组分为番茄汁IOOmL,酵母膏7.4g，牛肉膏10g，葡萄糖30g，MgSO4 O. 36g，苹果酸钠20g，吐温lg，胰蛋白胨15g，柠檬酸铵2g，MnS04 O. 05g，加水补足1L。二、该菌株RF17的鉴定I.初步鉴定一形态学及生理生化鉴定将筛选所得的菌株RF17进行形态及理化特性等研究，得到该菌株RF17的主要形态及培养特征如下菌落直径1.0 I. 8mm，菌落乳白色，圆形，表面光滑、凸起、湿润，不透明，边缘整齐；对菌株RF17进行革兰氏染色(示意图如图I所示)、并将菌株RF17置于扫描电镜及透射电镜分别进行观察(其中扫描电镜示意图如图2所示、透射电镜示意图如图3所示)得知，菌体杆状，O. 5 μ mX I. 33 I. 67 μ m，单个、成对或呈短链状排列，不生孢，革兰氏阳性；液体培养无菌膜、无气泡、菌液浑浊、分层明显、菌体不易离心且底部有白色沉淀。以下表I中是其具体生理生化鉴定指标表I菌株RF17的生理生化鉴定指标
权利要求
1.一种苹果酸乳酸转化高活力菌株，其特征在于所述菌株为植物乳杆菌植物亚种RF17 (Lactobacillus pi ant arum subsp. plantarum)，于 2012 年 03 月 16 日保藏于位于武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:M 2012085。
全文摘要
本发明提供一种苹果酸乳酸转化高活力菌株，该菌株为植物乳杆菌植物亚种RF17(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)，于2012年03月16日保藏于位于武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2012085。本发明的优点在于利用该菌株即植物乳杆菌植物亚种RF17能够更有效降低果酒、果汁中的苹果酸、增加乳酸及挥发酯等的含量，从而使果酒、果汁口感更加柔和、协调，气味芳香浓郁，为提高果酒、果汁品质奠定基础，进而为果酒的生物降酸及乳酸发酵功能性饮料的研究提供新的菌源。
文档编号C12N1/20GK102925384SQ20121038560
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月11日 优先权日2012年10月11日 公开号201210385606.发明者何志刚, 任香芸, 梁璋成, 李维新, 林晓姿, 魏巍 申请人:福建省农业科学院农业工程技术研究所