一种禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成的诱导物及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种真菌毒素合成的诱导物及方法，具体涉及一种禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成的诱导物及方法。
【背景技术】
[0002]禾谷镰刀菌是引起小麦赤霉病(Fusarium head blight or scab)的病原真菌，不仅严重影响作物产量，而且可以产生多种对人畜有害的真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，使粮食或饲料的品质降低。脱氧雪腐镰刀菌稀醇(deoxynivalenol，D0N)是一种倍半萜烯化合物，不易降解、稳定性高，被认为是主要由镰刀菌在缺乏营养物质时，合成并作为主要天然毒素存在于赤霉病发病小麦中。DON毒素是污染率最高的真菌毒素之一，主要污染小麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，如面包、饼干、麦制点心等；另外，在动物的奶、蛋中也有DON残留的报道。该毒素可抑制真核生物细胞蛋白质合成，破坏人和动物的免疫系统，可随食品、饲料进入食物链，严重威胁人畜健康。
[0003]我国是世界上受DON危害最严重的国家之一。因此，对谷物类制品中DON毒素的筛查及危害评估势在必行，对DON毒素形成机理的研究也同样需要大规模、大范围的开展起来。事实上，我国检验检疫部门一直十分重视这种毒素的检测监控研究，相关的科学研究也一直是赤霉病科研工作者的工作重点。然而，这些工作由于需要用到大量的DON毒素标准品，这些毒素标准品的价格又非常昂贵(lmg价格约为1000元人民币)，而且多是从国外出口，由此这些因素严重限制了相关工作的开展。由于真菌毒素涉及食品安全、环保、医疗等领域，需求广泛。因此，相关标准物制备已成为世界上各国研究的热点。
[0004]我国在真菌毒素标准物质制备方面的工作起步较晚，当前，合成真菌毒素标准品主要利用化学合成的方法，通过菌株培养、发酵、提取、纯化等制备工艺获得，虽然经历了不断的优化和工艺的完善，提取效率相对上世纪已有明显提高，但是真菌毒素得率仍相当有限，且纯化成本高昂。因此，若筛选出一种较为低廉的化学物质刺激毒素的合成，必然是一条可行的途径。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是，提供一种可提高产毒量及缩短毒素合成周期的禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成的诱导物及方法，以达到在工业生产中利用少量原材料菌丝大量合成脱氧雪腐镰刀菌烯醇，同时缩短周期提高产量的目的。
[0006]本发明解决其技术问题采用的技术方案，一种禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成的诱导物，为,57 -环单磷酸、,57 -环单磷酸钠盐或8?12mg/ml的咖啡因。
[0007]进一步，所述诱导物为4mM的腺苷-3' ,57 -环单磷酸、4mM的腺苷-3' ,57 -环单磷酸钠盐或10mg/ml的咖啡因。
[0008]进一步，所述诱导物为10mg/ml的咖啡因，。
[0009]本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案，一种禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成的方法，包括以下步骤:
[0010](3)产孢培养:将CMC液体培养基中培养4?6天的禾谷镰刀菌孢子，转入到液体产毒培养基至终浓度0.8?1.2 X 104个孢子/毫升(优选终浓度为1 X 104个孢子/毫升)；
[0011 ] (4)诱导合成:加入浓度2mM?4mM的腺苷-3' ,57 -环单磷酸、2mM?4mM的腺苷-3'，57 -环单磷酸钠盐或8?12mg/ml的咖啡因，黑暗静置诱导培养3?7天(优选诱导时间为5?7天，更优选7天)，即成；
[0012]禾谷镰刀菌在产毒阶段的细胞内的腺苷-3'，5。环单磷酸(cAMP)水平要远高于在普通菌丝生长阶段。因此，本发明采用cAMP、诱导禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成，可大大提高产毒量及缩短毒素合成周期。再则利用相对易溶的cAMP钠盐作为cAMP的替代物，同样可以诱导DON的生物合成；尤其筛选到了价格低廉，且相对稳定、高效的咖啡因作为cAMP的替代物诱导物同样可以诱导DON的合成。
[0013]本发明采用cAMP、cAMP钠盐或咖啡因诱导禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成，可大大提高产毒量及缩短毒素合成周期。尤其，cAMP的替代物咖啡因是廉价、高效、相对稳定的毒素合成诱导物。
[0014]实验证明，4mM浓度的cAMP可以大幅提高禾谷镰刀菌DON的生物合成，几乎上调了40倍;4mM cAMP处理禾谷镰刀菌菌丝5天，合成的毒素量甚至已经达到对照组第7天毒素合成量的5倍以上；10mg/ml的咖啡因产毒量可达170?180ppm。
【附图说明】
[0015]图1为本发明中不同浓度cAMP诱导毒素合成的对比。
[0016]图2为本发明中4mM cAMP处理禾谷镰刀菌菌丝不同时间的结果对比。
[0017]图3为本发明中cAMP对毒素合成相关基因的表达量的诱导。
[0018]图4为本发明中作为cAMP替代物的咖啡因诱导毒素合成的情况。
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
[0020]实施例1:不同浓度cAMP诱导禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成
[0021 ]收集CMC液体培养基中培养5天的禾谷镰刀菌孢子，加入到液体产毒培养基至终浓度104个孢子/毫升;然后分别加入终浓度lmM，2mM以及4mM的cAMP，黑暗静置培养7天;最后对培养基中的毒素进行测定。
[0022]液体产毒培养基(1升):30克蔗糖、1克硝酸铵、1克磷酸二氢铵、0.5克七水硫酸镁、
0.5克氯化钾、10毫克七水硫酸亚铁、0.03%植物凝胶以及200微升微量元素混合液，pH值用氢氧化钠调至6.5。微量元素混合液(100毫升):5g柠檬酸、5克七水硫酸锌、0.25克五水硫酸铜、50毫克一水硫酸锰、50毫克硼酸、50毫克二水钼酸钠)。
[0023]毒素测定利用Beacon公司生产的ELISA试剂盒，具体操作为:先吸取培养基，离心去除菌丝，获得样品；然后向试剂盒中配备的反应杯中依次加入酶、样品、抗体，混合均匀，静置反应10分钟，弃反应液;接着用试剂盒中的清洗液，洗反应杯5次;然后加入底物反应5分钟，最后用终止液终止反应。
[0024]在酶标仪中测0D45()数值并与标样所作的标准曲线进行对比，算出具体数值，不同浓度cAMP诱导毒素合成实验结果见图1。由图1可知，ImM浓度的cAMP对产毒几乎没有诱导作用，2mM浓度的cAMP可以轻微的诱导产毒，而4mM浓度的cAMP可以大幅提高禾谷镰刀菌DON的生物合成，几乎上调了 40倍。
[0025]实施例2:cAMP诱导不同时间禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇的合成
[0026]收集CMC液体培养基中培养5天的禾谷镰刀菌孢子，加入到液体产毒培养基至终浓度104个孢子/毫升;然后加入终浓度4mM的cAMP，在黑暗静置分别培养1天、3天、5天和7天，并对培养基中的毒素进行测定，由此对cAMP诱导毒素合成进一步观察。
[0027]4mM cAMP处理禾谷镰刀菌菌丝不同时间的实验结果见图2，由图2可知，未经处理的对照组直到培养5天后才开始产毒，而用cAMP处理后的菌丝第3天就可以检测到一定量的毒素，继续培养至第5天，cAMP处理组所产的毒素量甚至已经达到对照组第7天毒素合成量的5倍以上，表明采用cAMP处理样品可以大大缩短毒素合成周期以及提高产毒量，对生产中缩短周期提高产量至关重要。
[0028]实施例3:分析cAMP诱导下的TRI基因的表达模式
[0029]DON的生物合成是由一个基因簇完成的，基因簇中的基因被称之为TRI基因，因此，为了进一步确认cAMP对DON生物合成的诱导作用，对cAMP诱导下的TRI基因的表达模式进行分析。
[0030]收集液体诱导产毒培养基中培养3天的菌丝(未加cAMP的样品和加入4mMcAMP的样品)，液氮研磨后，转入2毫升的离心管中，然后加入1毫升的Trizol (购自Invitrogen公司)，涡旋混匀后静置5分钟，加入200微升的氯仿，混匀静置2分钟，离心10分钟，吸取上清，加入等体积的氯仿，混匀离心5分钟，吸取上清加入三分之二体积的异丙醇，静置15分钟，离心弃上清，用70 %乙醇清洗沉淀一次，晾干，加入一定体积的DEPC水溶解。
[0031 ]利用B1-Rad公司的cDNA试剂盒iScript? cDNA Synthesis Kit进行cDNA的反转录，利用iQ SYBR Green Supermix试剂盒进行定量PCR。
[0032]cAMP对毒素合成相关基因的表达量的诱导效果见图3，由图3可知，所有TRI基因的表达都明显上调，有的甚至上调了几百倍，这表明cAMP可以通过调控毒素合成相关基因的表达来刺激毒素的合成。
[0033]实施例4:cAM的替代物诱导禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成。
[0034 ] cAMP对毒素合成具有极为显著的诱导作用，但是cAMP价格比较昂贵，细胞内的cAMP浓度会受到cAMP磷酸二酯酶的负调控。因此，cAMP磷酸二酯酶抑制剂的添加就可以达到提高cAMP浓度的目的。
[0035]咖啡因是公认的较为廉价的cAMP磷酸二酯酶抑制剂，为了进一步节省成本，采用化学物质咖啡因代替较为昂贵的cAMP，添加了终浓度10mg/ml的咖啡因到产毒培养基中，具体操作同cAMP诱导和产毒方法，cAMP替代物的咖啡因诱导毒素合成的结果见图4。由图4可知，禾谷镰刀菌毒素合成大幅提高，说明咖啡因是一种廉价高效的毒素合成诱导物。
【主权项】
1.一种禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成的诱导物，其特征在于，所述诱导物为2mM?,57 -环单磷酸、2mM?4mM的腺苷-3' ,57 -环单磷酸钠盐或8?12mg/ml的咖啡因。2.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成的诱导物，其特征在于，所述诱导物为4mM的腺苷-3' ,57 -环单磷酸、4mM的腺苷-3' ,57 -环单磷酸钠盐或10mg/ml的咖啡因。3.根据权利要求2所述的禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成的诱导物，其特征在于，所述诱导物为1 Omg/ m 1的咖啡因。4.一种如权利要求1?3之一所述的禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)产孢培养:将CMC液体培养基中培养4?6天的禾谷镰刀菌孢子，转入到液体产毒培养基至终浓度0.8?1.2 X 104个孢子/毫升； (2)诱导合成:加入浓度Y-环单磷酸、,5,-环单磷酸钠盐或8?12mg/ml的咖啡因，黑暗静置诱导培养3?7天，即成。5.根据权利要求4所述的禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述禾谷镰刀菌孢子终浓度为1 X 104个孢子/毫升。6.根据权利要求4或5所述的禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成的方法，其特征在于，步骤(2)中，诱导培养时间为5?7天。7.根据权利要求6所述的禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成的方法，其特征在于，步骤(2)中，诱导培养时间为7天。
【专利摘要】一种禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成的诱导物及方法，所述诱导物为2mM～4mM的腺苷-3′，5′-环单磷酸、2mM～4mM的腺苷-3′，5′-环单磷酸钠盐或8～12mg/ml的咖啡因。本发明还包括一种诱导禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成的方法。本发明采用cAMP、cAMP钠盐或咖啡因诱导禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成，可大大提高产毒量及缩短毒素合成周期。
【IPC分类】C12R1/77, C12P17/18
【公开号】CN105483175
【申请号】CN201610041250
【发明人】江聪, 王晨芳, 许金荣, 刘慧泉, 王建华, 项萍, 张强, 尹涛, 唐喆
【申请人】西北农林科技大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月21日