专利名称：枯草芽孢杆菌在降解真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌的应用，尤其涉及一种枯草芽孢杆 菌在降解真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用。
背景技术：
随着人们对食品安全重视程度的提高，许多国家和地区纷纷采取
多种生产质量管理规范，如良好农业规范(Good Agricultural Practices, GAP)、良好药品生产规范(Good Manufacture Practice, GMP)和危害分析及关键控制点(Hazard Analysis and Critical Control Point, HACCP)等，保障从"田园到餐桌"的食品安全供应 链体系。我国科技部也于2002， 2006年分别启动了 "十五"、"十一五" 国家科技重大专项"食品安全关键技术"，强调建设和加强我国食品 安全的支撑体系。真菌毒素作为影响食品安全的一大隐患，成为这次 科技攻关的核心问题。
目前用于控制食物链真菌毒素水平的方式有物理、化学的方法。 加热、紫外照射和离子辐射等物理方法虽能破坏霉菌孢子活性，但不 能完全有效地控制食品或饲料中真菌毒素的水平，而化学方法虽然能 破坏真菌毒素，但也会对营养成分造成极大的破坏，并导致化学试剂 残留对健康危害的不确定性。国外研究的热点是寻找生物技术的方法 和手段替代上述物理化学方法来控制食品和饲料中的真菌毒素水平。 近年来，采用微生物的方法控制食物链中的真菌毒素已被科学界所关注。许多学者试图通过微生物发酵的方法减少或消除谷物中脱氧雪腐 镰刀菌烯醇的污染，并取得了一定的进展。
本发明着力于益生菌降解真菌毒素的研究，是基于益生菌良好的 生理功能，以乳酸菌、双歧杆菌和枯草芽孢杆菌为代表的益生菌可促 进动物或人体原生微生物菌群生长而对宿主产生有益的影响，还具有 抑制有害菌的生长、消除致癌因子、提高机体免疫力、降低胆固醇等 重要生理功效，而且具有使用安全、无残留、不产生抗药性等优点。 目前，国内外很少有关益生菌降解或清除真菌毒素的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌在降解脱氧雪腐镰刀菌 烯醇中的应用，该枯草芽孢杆菌菌株具有很强的降解脱氧雪腐镰刀菌 烯醇的能力，使用安全、无残留、不产生抗药性。
本发明应用如下
1 、消除液体培养基对间接竞争ELISA检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇 干扰的方法-
在大规模筛选降解菌株时，发明人发现MRS( Mann-Rogosa-Sharpe medium)培养基对间接竞争ELISA反应产生强烈的干扰。为消除培养 基的干扰，发明人设计了一系列MRS稀释度实验，以纯水为参照物， 实验结果显示经8倍稀释，MRS培养基的干扰可以忽略。
2 、菌株培养产物制备酶制剂的方法
酶制剂是工业应用的添加剂之一，目前酶制剂有粉剂、片剂等， 以枯草芽孢杆菌培养物制成的酶制剂是利用生化分离的手段(包括各种分离柱、制备色谱等)将菌株代谢产物加以纯化得到较纯的毒素降 解酶，制成干粉或通过压片等方式做成片剂产品。
3 、制备活菌制剂的方法-
在大规模工业处理污染物时，利用生物学方法获得的活菌株进行 液体发酵处理来达到消除污染的效果是目前科学界非常感兴趣的应 用。本发明获得的菌株可经过简单的培养而大量获得降解脱氧雪腐镰 刀菌烯醇的活菌体，在培养至菌体对数期(12到16小时)时，取出 并添加部分营养装成活菌液体制剂或添加固形物制成固体活菌制剂。
4、制备人体或动物体解毒的口服制剂或药品的方法
目前许多厂家将枯草芽孢杆菌制成调节肠道的口服制剂，而不是 专门用于排除误食入人体或动物体的脱氧雪腐镰刀菌烯醇。本发明获 得菌株的一个重要的应用就是将液体培养获得的菌体在4000转离心 10分钟，并用生理盐水洗涤3次后，添加到以脱脂奶粉等可食用蛋 白粉和牛肉膏配成的营养液中制成菌悬液。
本发明的优点是枯草芽孢杆菌可以在温和的条件下，利用生物 合成和酶学途径将食物或词料中污染的脱氧雪腐镰刀菌烯醇完全降 解，并且可避免用物理或化学方法处理真菌毒素导致的降解不完全和 营养成分被破坏的缺点。
图1为本发明的菌株降解液体培养基中脱氧雪腐镰刀菌烯醇实验图。 图2为本发明的菌体和上清液降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素实验图。 图3为本发明的枯草芽孢杆菌上清液热处理后降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇实验图。
具体实施例方式
实施例1:
1. 将待测菌株从保藏的冻干管中分别接至平板上活化2次，37
"C培养18小时取出备用；
2. 将活化好的待测菌株接入MRS或营养肉汤(NB)液体培养基， 并根据文献模拟成1 y g/mL的食品污染模型。在37。C、厌氧或180 rpm 摇床培养12小时，培养液于3000 rpm离心15分钟，上清液备用；
3. 用预先调成微碱性的超纯水进行8倍稀释，并确定其pH值为 中性；
4. 用间接竞争ELISA试剂盒对所有待测菌株的培养液进行检测；
5. 实验结果如图1所示横坐标为测试菌株编号(1号为枯草
芽胞杆菌ZZ; 2号为枯草芽胞杆菌KM; 3号为地衣芽胞杆菌；4号为
鼠李糖乳杆菌；5号为保加利亚乳杆菌；6号为嗜酸乳杆菌2c菌株； 7号为纤维二糖乳杆菌；8号为巻曲乳杆菌；9号为发酵乳杆菌；10 号为嗜酸乳杆菌124a菌株；ll号为德氏乳杆菌；12号为嗜酸乳杆菌 160b菌株；13号为植物乳杆菌)，同时设NB培养基+脱氧雪腐镰刀菌 烯醇为对照组14号；MRS培养基+脱氧雪腐镰刀菌烯醇为对照组15 号。纵坐标为测试样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的残留浓度。ND表示 没有检测到样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的残留浓度(ng/mL)。从图1 可以看出1号枯草芽胞杆菌ZZ中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的残留浓度 低于检测限，说明其有强烈的降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇作用。实施例2:
1. 将芽孢杆菌分别于37'C， 180 rpm振荡培养12 h， 4000 rpm 离心10 min分离上清液和菌体。
2. 上清液用0.22 um微滤膜过滤，收集过滤液；
3. 菌体用生理盐水洗涤两次，以清除残留的上清液，最后用生 理盐水悬浮，使得菌体浓度为10lfl CFU/mL;
4. 分别取过滤除菌的上清液和菌悬液980 UL，并分别加入50 w g/mL的脱氧雪腐镰刀菌烯醇水溶液20 u L，使得脱氧雪腐镰刀菌 烯醇终浓度为l ug/mL， 37"C静止温育3 h和14 h取样；
5. 用间接竞争ELISA试剂盒检测样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的 残留浓度；
6. 实验结果如图2所示横坐标表示测试菌株编号(1号为枯
草芽胞杆菌ZZ; 2号为地衣芽胞杆菌；3号为蜡样芽孢杆菌；口代表
上清液，目代表菌体)，同时设三个对照组(水+脱氧雪腐镰刀菌烯醇
为对照组4; NB培养基为对照组5; NB培养基+脱氧雪腐镰刀菌烯醇 为对照组6)。纵坐标为测试样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的残留浓度 (ng/mL)。 ND表示没有检测到样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的残留浓 度。从图2中可以看出，枯草芽孢杆菌的上清液(口)中脱氧雪腐镰刀 菌烯醇残留浓度低于ELISA检测试剂盒的最低检测限(20ng/mL)，而 枯草芽孢杆菌的菌体(固)基本无降解毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇的能 力。1. 按实施例2中的方法收集枯草芽孢杆菌的上清液备用；
2. 将上清液分别在65、 75、 85、 95、 IO(TC下加热10 min，然 后加入脱氧雪腐镰刀菌烯醇(终浓度为1000 ng/mL)共培养3小时；
3、 所有样品用间接竞争ELISA检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的残留 浓度；
4、 实验结果如图3所示横坐标表示热处理的温度(°C)，纵坐 标为测试样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的残留浓度(ng/mL)。 ND表示 没有检测到样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的残留浓度。从图3中可以看 出上清液中的有效降解组分随热处理温度的上升而逐步失去活性，在 65-75i:间，活性丧失比例较大。
实施例4:
1. 将枯草芽孢杆菌大量培养，其上清液做如下处理(1)经过 真空浓縮，低温干燥获得粗酶制剂；(2)经过分级超滤、酸分级沉淀、 阴离子交换等分离纯化程序获得降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的酶 物质，制成高纯度酶制剂。
2. 将粗酶制剂或高纯度酶制剂溶解在少量水中，通过喷雾的方
式使其均匀分散在批量真菌毒素污染的谷物饲料中，饲料经过多次翻 晒堆积，其内部温度控制在25-37°C，酶作用一段时间后，测定脱氧
雪腐镰刀菌烯醇的降低污染程度。
3. 取少量谷物依次用甲醇水二h l的浸泡、离心弃沉淀、过 固相萃取柱、免疫亲和柱等处理后，用HPLC在218nm检测其中的毒 素残留。
权利要求
1、一种枯草芽孢杆菌在降解真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用，其特征是在食品和饲料安全中的应用，枯草芽孢杆菌能完全降解农作物中污染的脱氧雪腐镰刀菌烯醇。
2、 根据权利要求l所述的一种枯草芽孢杆菌的应用，其特征是枯草芽 孢杆菌在营养肉汤液体培养基中37°C、 180rpm摇床培养12小时，可完全 降解液体中脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素，降解产物为无毒性的产物。
3、 根据权利要求l所述的一种枯草芽孢杆菌的应用，其特征是将枯草 芽孢杆菌在营养肉汤液体培养基中37°C、 180rpm摇床培养12小时，并纯 化得到相应的降解毒素的酶，制成酶制剂。
4、 根据权利要求l所述的一种枯草芽孢杆菌的应用，其特征是将枯草 芽孢杆菌在营养肉汤液体培养基中37°C、 180rpm摇床培养12小时，并制 备成降解真菌毒素或其它类型毒素的活菌制剂。
5、 根据权利要求l所述的一种枯草芽孢杆菌的应用，其特征是将枯草 芽孢杆菌在营养肉汤液体培养基中37°C、 180rpm摇床培养12小时，并制 成用于人体或动物体解毒的口服制剂或药品。
全文摘要
一种枯草芽孢杆菌在降解真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇中的应用，其应用方法如下1.消除液体培养基对间接竞争ELISA检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇干扰的方法；2.菌株培养产物制备酶制剂的方法；3.制备活菌制剂的方法；4.制备人体或动物体解毒的口服制剂或药品的方法。本发明的优点是枯草芽孢杆菌可以在温和的条件下，利用生物合成和酶学途径将食物或饲料中污染的真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇完全降解，并且可避免用物理或化学方法处理真菌毒素导致的降解不完全和营养成分被破坏的缺点。
文档编号C12N1/20GK101412976SQ200810106969
公开日2009年4月22日 申请日期2008年7月2日 优先权日2008年7月2日
发明者万翠香, 锋 徐, 扬史良, 明 曾, 程波财, 许恒毅, 亮 郭, 华 魏 申请人:南昌大学