一种脱氧雪腐镰刀烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素a复合免疫亲和柱的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型属于分析检测技术领域，具体涉及一种脱氧雪腐镰刀烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A复合免疫亲和柱。
【背景技术】
[0002]真菌毒素是由真菌生长产生的有毒次生代谢产物，在粮食或饲料生产过程中，由于温度、湿度等因素的影响，为真菌的生长繁殖提供适宜条件，从而引起真菌毒素的污染。据世界粮农组织报告，全球每年约有25%的农作物遭受真菌及其毒素污染，约有2%的农作物因污染严重而失去营养和经济价值。真菌毒素对人类和动物健康可产生严重的影响，许多国家在近几十年来制定了诸多有关食品和饲料中真菌毒素的法规，以保护人类和动物的健康，并保障生产者和贸易商的经济利益。到2003年末，大约有100个国家已经为食品和饲料中的真菌毒素制定了各种特定的限量标准，而且该数目还在继续增加之中。脱氧雪腐镰刀烯醇、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素是粮食饲料中常见的真菌毒素，在被真菌污染的谷物中，经常可以同时检测出。
[0003]脱氧雪腐镰刀烯醇(呕吐毒素，DON)和玉米赤霉烯酮同属镰刀霉毒素，主要是由镰刀菌属真菌产生，常见于小麦，玉米等谷物中。可对人、畜产生广泛的毒性效应，如食欲降低、体重减轻、代谢紊乱等。脱氧雪腐镰刀烯醇污染谷物的状况非常普遍，是检出率和检出量最高的真菌毒素之一，人畜摄入了被脱氧雪腐镰刀烯醇污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳和反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡，但不同的动物对脱氧雪腐镰刀烯醇的敏感程度不一，猪最敏感。另外脱氧雪腐镰刀烯醇对免疫系统有影响，有明显胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遗传毒性，但无致癌、致突变作用。玉米赤霉稀酮是一种酸的二轻基苯酸的内醋结构，主要由禾谷镰刀菌产生，粉红镰刀菌、窜珠镰刀菌、三线镰刀菌等多种镰刀菌也能产生，首先由赤霉病玉米中分离得出。玉米赤霉烯酮具有雌激素样作用，具有较强的生殖毒性和致畸作用，可引起动物发生雌激素亢进症，导致动物流产、死胎、返情等生殖异常现象，对家禽、猪、牛和羊的影响较大，给畜牧业带来很大的经济损失。2003年止，据世界粮农组织公布已有19个国家制定了食物中玉米赤霉烯酮的限量标准。赭曲霉毒素A在真菌毒素中分布最广。赭曲霉毒素A已被国际癌症研宄机构确定为II B类致癌物的一种霉菌毒素，它能致癌、致畸、致突变、破坏免疫系统，对肝、肾脏造成损害，还可导致神经中毒。
[0004]目前，真菌毒素的检测方法主要有薄层色谱法，免疫分析法及精密仪器分析法。其中，免疫分析方法主要有酶联免疫法和胶体金免疫层析法，可以对样品中的真菌毒素进行快速的定量、定性检测；精密仪器分析法主要有高效液相色谱法、超高效液相色谱法和液质联用法，可以对样品中的真菌毒素进行精确定性、定量分析，是真菌毒素检测的确认方法。但是，由于需要检测样品种类繁多，影响因素各种各样，要想使这些检测方法能够达到理想的检测效果，则需要将样品进行不同程度的前处理。
[0005]免疫亲和柱是利用抗原抗体反应的高特异性和高亲和力，用适当的方法将特异性的抗体结合到固相载体上，以便有效的分离、纯化目标物质，具有选择性高、富集能力强等优点，用于真菌毒素检测的样本前处理，可以更好的消除影响因素，减小基质效应，减少假阳性和假阴性的出现。
【实用新型内容】
[0006]本实用新型的目的在于提供一种脱氧雪腐镰刀烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A复合免疫亲和柱，用于样品中脱氧雪腐镰刀烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A检测的样品前处理方法。
[0007]本实用新型所述的免疫亲和柱由柱管、琼脂糖凝胶、筛板、上下帽组成；琼脂糖凝胶上偶联了抗脱氧雪腐镰刀烯醇单克隆抗体和抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体，由上下各一块筛板固定在柱管底部；柱管的两端分别盖有上帽和下帽。其所用琼脂糖凝胶为CNBr-Sepharose 4B，每根亲和柱含量为0.3ml_0.5ml ;每根亲和柱所含抗脱氧雪腐镰刀稀醇单克隆抗体、抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体和抗赭曲霉毒素A单克隆抗体分别为0.8 mg-2.5mg、0.5 mg -2mg 和 0.4 mg -1mg ;柱管为 3ml 或 Iml 的柱管。
[0008]本实用新型所述的免疫亲和柱的制备方法，按照下述步骤进行:
[0009](I)抗体预处理:将纯化好的抗脱氧雪腐镰刀烯醇单克隆抗体、抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体和抗赭曲霉毒素A单克隆抗体置于pH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHC03缓冲液中透析12h ；
[0010](2)凝胶活化:称取适量的CNBr-S印harose 4B干粉，用ImM盐酸浸泡使其充分溶胀后，在砂心漏斗中用ρΗ8.3含有0.5Μ NaCl的0.1M NaHC03缓冲液快速抽洗3次；
[0011](3)偶联:将活化好的凝胶加入到透析好的抗体溶液中，迅速混匀，室温下震荡充分反应2h，在砂心漏斗抽滤中用5倍体积的0.1M NaHC03缓冲液抽洗；
[0012](4)封闭:将凝胶转入5倍体积ρΗ8.0含0.5Μ NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液中，室温下震荡充分反应2h ；
[0013](5)洗涤:用5—10倍凝胶体积的pH4.0含0.5M NaCl的0.1M醋酸盐缓冲液和5—10倍凝胶体积的pH8.0含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液交替抽洗三次，然后用5—10倍凝胶体积的ρΗ7.3含0.5Μ NaCl的0.05Μ PBS缓冲液抽洗三次；
[0014](6)装柱:将偶联好的凝胶分装入Iml或者3ml的空柱中，用筛板将凝胶固定在柱的底部，并用PH7.3含0.5M NaCl的0.05M PBS缓冲液平衡，盖上上下帽，4°C保存。
[0015]本实用新型亲和柱具有如下有益效果:
[0016](I)特异性好。本实用新型亲和柱使用的是分别针对脱氧雪腐镰刀烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A的单克隆抗体，只特异性纯化富集脱氧雪腐镰刀烯醇、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A。
[0017](2)减少了样品前处理过程中有机化合物的使用。
[0018](3)可以对样品中的脱氧雪腐镰刀烯醇、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A同时进行纯化、富集。
【附图说明】
[0019]图1:亲和柱结构示意图。I为上帽，2为柱管，3、5为筛板，4为凝胶，6为下帽。
[0020]图2:亲和柱样本纯化流程图。
【具体实施方式】
[0021]1、脱氧雪腐镰刀烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A复合免疫亲和柱的制备
[0022](I)抗体预处理:将纯化好的抗脱氧雪腐镰刀烯醇单克隆抗体、抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体和抗赭曲霉毒素A单克隆抗体置于pH8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHC03缓冲液中透析12h ；
[0023](2)凝胶活化:称取适量的CNBr-S印harose 4B干粉，用ImM盐酸浸泡使其充分溶胀后，在砂心漏斗中用ρΗ8.3含有0.5Μ NaCl的0.1M NaHC03缓冲液快速抽洗3次；
[0024](3)偶联:将活化好的凝胶加入到透析好的抗体溶液中，迅速混匀，室温下震荡充分反应2h，在砂心漏斗抽滤中用5倍体积的0.1M NaHC03缓冲液抽洗；
[0025](4)封闭:将凝胶转入5倍体积ρΗ8.0含0.5Μ NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液中，室温下震荡充分反应2h ；
[0026](5)洗涤:用5—10倍凝胶体积的pH4.0含0.5M NaCl的0.1M醋酸盐缓冲液和5—10倍凝胶体积的pH8.0含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液交替抽洗三次，然后用5—10倍凝胶体积的ρΗ7.3含0.5Μ NaCl的0.05Μ PBS缓冲液抽洗三次；
[0027](6)装柱:将偶联好的凝胶分装入Iml或者3ml的空柱中，用筛板将凝胶固定在柱的底部，并用PH7.3含0.5M NaCl的0.05M PBS缓冲液平衡，盖上上下帽，4°C保存。
[0028]2、脱氧雪腐镰刀烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A复合免疫亲和柱的使用方法
[0029](I)取25g粉碎的样品与10ml甲醇-水(7:3)溶液混合；
[0030](2)加入5.0g氯化钠以均质器高速搅拌，提取2分钟；
[0031](3) 4000r/min离心5min或用定性滤纸过滤；
[0032](4)取1ml滤液并加入40ml水稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤；
[0033](5)取20ml (4)步滤液，以约6ml/min流速缓慢通过免疫亲和柱；
[0034](6)以10.0ml水淋洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2ml~3ml空气通过柱体；
[0035](7)准确加入1.0ml色谱级甲醇洗脱，流速为I ml/min ~2ml/min,收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。
【主权项】
1.一种脱氧雪腐镰刀烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A的复合免疫亲和柱，由柱管、琼脂糖凝胶、筛板、上下帽组成；琼脂糖凝胶上偶联了抗脱氧雪腐镰刀烯醇单克隆抗体、抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体和抗赭曲霉毒素A单克隆抗体，由上下各一块筛板固定在柱管底部；柱管的两端分别盖有上帽和下帽。
2.根据权利要求1所述免疫亲和柱，其特征在于所述的琼脂糖凝胶为CNBr-Sepharose4B。
3.根据权利要求1所述免疫亲和柱，其特征在于每根亲和柱所含抗脱氧雪腐镰刀烯醇单克隆抗体、抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体和抗赭曲霉毒素A单克隆抗体分别为0.8 mg-2.5mg、0.5 mg -2mg 和 0.4 mg -1mg0
4.根据权利要求1所述免疫亲和柱，其特征在于每根亲和柱所含琼脂糖凝胶为0.3ml_0.5ml。
5.根据权利要求1所述免疫亲和柱，其特征在于所述的柱管为3ml或Iml的柱管。
【专利摘要】本实用新型涉及一种脱氧雪腐镰刀烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A的复合免疫亲和柱，由柱管、琼脂糖凝胶、筛板、上下帽组成，琼脂糖凝胶上偶联了抗脱氧雪腐镰刀烯醇单克隆抗体、抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体和抗赭曲霉毒素A单克隆抗体，由上下各一块筛板固定在柱管底部，柱管的两端分别盖有上帽和下帽。本实用新型能够与脱氧雪腐镰刀烯醇、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A特异结合，可用于饲料、食品等样本中脱氧雪腐镰刀烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A污染检测的样本前处理，起到净化、富集作用。
【IPC分类】G01N33-577
【公开号】CN204514929
【申请号】CN201520249909
【发明人】张波, 王松雪, 谢刚
【申请人】北京康源泰博生物科技有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月23日