一种用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇富集净化的固相萃取柱的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及农产品安全检测技术领域，具体地说涉及一种用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇富集净化的固相萃取柱。
【背景技术】
[0002]脱氧雪腐镰刀菌稀醇(Deoxynivalenol，DON)，又称呕吐毒素，属于单端孢霉稀族类化合物，是雪腐镰刀菌稀醇的一种脱氧衍生物，主要由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)在霉变的农作物中产生。DON具有很强的细胞毒性、免疫毒性和胚胎毒性，对血液系统、中枢系统、消化系统及钙磷代谢也有严重的影响，并具有一定的致畸作用。此外，研宄表明，DON可能是一种潜在的弱的致癌剂。多种食用农产品及其加工品如小麦、大麦、玉米等在其保存、运输过程中非常容易遭受DON的污染，造成巨大的经济损失，2011年我国最新的国家标准GB2761-2011规定玉米及其制品(玉米澄、玉米片、玉米面)、小麦、大麦、麦片、小麦粉中DON的限量为lOOOyg/kg。由于农产品基质复杂多样，容易造成基质干扰，所以前处理的富集净化对于农产品中DON的检测分析至关重要；另外，DON属于产毒真菌的次级代谢产物，极难通过人工合成途径获得，获得大量DON标准品最简单有效得方法就是将产毒菌接种在大米培养基，获得高含量的DON大米基质，然后分离纯化。由于基质中含有的大量色素、鞣质等杂质，利用简单吸附净化的方法很难去除，如果直接将基质提取液进中压制备色谱分离纯化，将大大缩短制备柱的使用寿命，所以对DON富集净化十分必要。本实用新型固相萃取净化柱不仅能除去提取液中的色素、油脂、鞣质等对色谱柱有严重损害的杂质，还能对样品中微量的DON毒素实验富集，提高了检测分析方法的灵敏度，为农产品中DON的风险评估奠定基础。
[0003]传统的DON净化方法通常是使用液液萃取或者层析柱来进行净化，但是，此方法操作复杂，耗时耗力，且产生了大量的废弃物，对环境产生较大破坏。固相萃取SPE(SolidePhase Extract1n)是一种基于色谱分离的样品前处理方法，利用吸附剂将液体样品中的特定化合物吸附，与样品的基质和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，达到分离或者富集目标化合物的目的，从而大大提高工作效率，提高灵敏度和准确度，达到既定量准确又快速简便的要求，但是由于商品化的固相萃取柱其价格昂贵，单支价格超过15元，不适合大量样品的检测及标准物质的制备工作，极大地限制了其应用的普遍性。目前，尚缺乏操作简单、价格低廉的能够用于DON富集、净化的前处理固相柱。
【发明内容】
[0004]本实用新型首先提供了一种用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇富集净化的固相萃取柱中的装填材料，该装填材料由硅胶、中性氧化铝和弗罗里硅土组成；
[0005]其中硅胶、中性氧化铝和弗罗里硅土的重量比为0.5-2:0.1-1:0.1_1。
[0006]本实用新型还提供一种用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇富集净化的固相萃取柱，其包括萃取容器、上述装填材料以及筛板；
[0007]其中装填材料在萃取容器内，筛板在装填材料上部；
[0008]萃取容器内下部还有容器内筛板。
[0009]所述的萃取容器可为下层带筛板的聚丙烯固相萃取空管；
[0010]其中装填材料中的硅胶、中性氧化铝和弗罗里硅土可分三层叠放，也可以混合；分三层叠放时，三层没有特定的顺序要求，可以依次从上到下分别为硅胶层、中性氧化铝层和弗罗里硅土层，也可以依次从下到上分别为硅胶层、中性氧化铝层和弗罗里硅土层。
[0011]具体的说，本实用新型的一种用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇富集净化的固相萃取柱，其包括萃取容器、硅胶层、中性氧化铝层、弗罗里硅土层和筛板，如图2。
[0012]本实用新型利用硅胶、中性氧化铝、弗罗里硅土研制了一种简便、高效、经济的装填材料，利用该装填材料制备的用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇富集净化的固相萃取柱，可以用以除去鞣质、色素等干扰物，提高了脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)检测分析方法的灵敏度，可满足农产品中DON的痕量检测分析。本实用新型建立的固相萃取柱具有很高的回收率(90.5±1.8%、98.4±2.1 %、106.9±4.4% )和灵敏度(采用液相色谱串联质谱法分析后，灵敏度均低于10yg/kg)的同时，制作更加简单、使用方便，单支固相萃取柱的成本不超过5元，且操作简单，满足了国内外DON检测及标准品制备前处理的要求。
【附图说明】
[0013]图1脱氧雪腐镰刀菌烯醇富集净化的固相萃取柱简略图
[0014]图2 —种脱氧雪腐镰刀菌烯醇富集净化的固相萃取柱
[0015]图3a对照溶液组UPLC-PDA全扫描图
[0016]图3b过柱溶液组UPLC-PDA全扫描图
[0017]其中，1、萃取容器；2、装填材料；3、筛板；4、容器内筛板；5、硅胶层；6、中性氧化铝层；7、弗罗里硅土层
【具体实施方式】
[0018]实施例1:
[0019]取市场随机采集的玉米，粉碎后过筛，取三支20mL离心管，准确称取2±0.0lg，加入DON标准溶液，使样品中DON含量分别为100 μ g/kg、200 μ g/kg、1000 μ g/kg，加入1mL的乙腈-水溶液(84:16, V/V)超声I小时提取，离心，收集提取液。
[0020]固相萃取柱制备:准确称取硅胶lg(200_300目，购自中国医药上海化学试剂公司)，中性氧化铝0.5g，(100-200目，购自中国医药上海化学试剂公司)，弗罗里硅土 0.5g，(100-200目，购自中国医药上海化学试剂公司)，依次装入下层带筛板的5mL聚丙烯固相萃取容器，使每层表面平坦，最后在弗罗里娃土上面加一个筛板(直径:12.8mm厚度:2.5mm孔径:20um)用以保证接触面的平整。
[0021]所制备成的固相萃取柱，如图2，包括萃取容器1，萃取容器I内从上到下依次为筛板3、硅胶层5、中性氧化铝层6和弗罗里硅土层7，萃取容器I内下部还有一层容器内筛板4。
[0022]过柱液制备:用5mL甲醇活化自制净化柱，5mL加标玉米样本提取溶液过柱，1mL甲醇洗脱，收集洗脱液，45°C氮气吹干，ImL甲醇-水溶液(20:80，V/V)复溶，过0.22 μπτ滤膜后，检测分析。
[0023]对照液制备:另取5mL加标玉米样本提取液(DON浓度为1000 μ g/kg)不过柱，洗脱液在45°C氮气下吹干，ImL甲醇-水溶液(20:80，V/V)复溶，过0.22 μ m滤膜后，作为对照检测分析。
[0024]实验结果:
[0025]1.净化效果表观比较:
[0026]过柱溶液颜色由深褐色变为淡黄色，且使用后的固相萃取柱上面留有明显的色素，而对照液仍为深褐色。可见，色素、鞣制等对昂贵的色谱柱及色质谱仪器损害较大的杂质明显减少，表明该固相萃取柱能够有效的去除鞣制、色谱等杂质。
[0027]2.净化效果超高效液相色谱-二极管阵列检测器(UPLC-PDA)全扫描比较
[0028]色谱条件:WatersACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mmX 100mm，1.7 μ m);流动相A为甲醇，B相为水；流速0.2mL/min ;洗脱程序为:0?5.5min，10% A?100% A ;5.5?6.5min，100% A ?100% A ;6.5 ?7.0min, 100% A ?10% A ;7 ?lOmin，10% A ?10% A ;紫外检测器；波长220nm ;进样量5 μ L0
[0029]将未经过固相萃取柱净化，添加水平为1000 μ g/kg (对照液)和经固相萃取柱净化的提取液(过柱液)在200nm-400nm紫外全扫描，结果如图3，过柱液(图3b)中杂质峰明显少于对照液(图3a)，尤其在对色谱柱及仪器损害较大的l_3min处，杂质减少的尤为明显O
[0030]实施例2:
[0031]取市场随机采集的玉米，粉碎后过筛，取3支20mL离心管，准确称取2±0.0lg，其中一支加入DON标准溶液，使提取液中DON浓度为100 μ g/kg,分别加入1mL乙腈-水溶液(84:16, V/V)超声I小时提取，离心，收集提取液。
[0032]固相萃取柱如实施例1中所述。
[0033]阳性对照溶液制备:用5mL甲醇活化自制净化柱，5mL加标玉米样本提取液过固相萃取柱，1mL甲醇洗脱，收集洗脱液，45°C氮气吹干，ImL甲醇-水溶液(20:80，V/V)复溶，过0.22 μ m滤膜后，检测分析。
[0034]样品溶液制备:另取5mL玉米样本提取液过固相萃取柱，洗脱液在45 °C氮气下吹干，ImL甲醇-水溶液(20:80，V/V)复溶，过0.22 μ m滤膜后，检测分析。
[0035]阴性对照溶液制备:取5mL甲醇-水溶液(20:80，V/V)过固相萃取柱，洗脱液在45°C氮气下吹干，ImL甲醇-水溶液(20:80，V/V)复溶，过0.22 μ m滤膜后，检测分析。
[0036]净化效果表观比较:
[0037]阳性对照过柱溶液和样品液的颜色由深褐色变为淡黄色，且使用后的固相萃取柱上面留有明显的色素，而阴性对照溶液仍为深褐色。可见，色素、鞣制等对昂贵的色谱柱及色质谱仪器损害较大的杂质明显减少，表明该固相萃取柱能够有效的去除鞣制、色谱等杂质。
[0038]采用液相色谱质谱联用仪(LC-MS/MS)测定三种样品中DON浓度。
[0039]色谱条件:Agilent C18色谱柱(3.0mmX 100mm, 2.7 μ m);流动相A为5mM醋酸钱溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱程序:0?2min，10%B?90%B ;2?6min，90%B?90%B ;6.0 ?6.1min,90% B ?10% B ;6.I ?8.5min，10% B ?10% B ;流速 0.3mL/min ;进样量5yL ;柱温40°C。
[0040]质谱条件:采用电喷雾电离源(ESI)负离子模式扫描；扫描范围:m/z100-400 ；，雾化气压力:0.175Mpa ;干燥气流速:15.0L/min ;干燥器温度:350°C ;毛细管电压:3500V ；碰撞能量:15V ;离子源温度:400°C。
[0041]通过检测，得到阳性对照样本中DON含量为110?130 μ g/kg ;样品液中DON含量为20?30 μ g/kg ;阴性对照液中DON含量为O。
[0042]实施例3:
[0043]采用实施例2中液相色谱质谱联用仪(LC-MS/MS)方法分别检测计算实施例1三种添加水平下过固相萃取净化柱后的回收率及方法灵敏度的测定。
[0044]实验结果:
[0045]通过检测，得到实施例1中三组过柱后溶液的回收率分别为90.5± 1.8%、98.4±2.1%和106.9±4.4%，实施例1中过柱后溶液的灵敏度为10 μ g/kg，极大了提高了方法的灵敏度(未过柱溶液中DON的灵敏度低于100 μ g/kg)，满足国内外相关标准要求。
[0046]本实用新型的保护范围并不限于实施例中所作的描述，不偏离本实用新型方案中心的修改都属于本实用新型的保护范围。
【主权项】
1.一种用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇富集净化的固相萃取柱，其特征在于其包括萃取容器(1)、硅胶层(5)、中性氧化铝层￠)、弗罗里硅土层(7)和筛板(3);其中硅胶层(5)、中性氧化铝层￠)、弗罗里硅土层(7)在萃取容器(I)内自上而下排列，筛板(3)在硅胶层(5)的上部。
【专利摘要】本实用新型公开了一种用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇富集净化的固相萃取柱，其包括萃取容器、装填材料以及筛板。本实用新型的固相萃取柱可以用以除去鞣质、色素等干扰物，提高了脱氧雪腐镰刀菌烯醇检测分析方法的灵敏度，可满足农产品中DON的痕量检测分析。
【IPC分类】G01N1-40, B01D15-20, G01N1-34
【公开号】CN204337832
【申请号】CN201420556892
【发明人】韩铮, 郭文博, 赵志辉, 杨俊花, 陈慧英, 孙真真
【申请人】上海市农业科学院
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2014年9月25日