一种蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生物领域，特别涉及一种蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法和应用。一种蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂，包含以下组分：按重量百分比计，蜡样芽孢杆菌冻干粉50-70％，助剂8-12％，稳定剂0.5-1.5％，紫外保护剂0.05-0.15％，余量为载体。通过以下方法制备：将各组分混合均匀，粉碎，制得目数不大于150目的粉剂，整个制备过程中温度保持在0～45℃。本发明提供的蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂，对板栗等果实储藏过程中常见的真菌病害，如栗疫菌、黑葡萄穗霉、腐皮镰刀菌、扩展青霉、炭疽菌和黑曲霉等具有较好的抑制作用，对人畜无毒，成本低；能够很好的解决板栗室温贮藏问题，降低储藏成本。
CCTCC NO:M 2014112
2014.04.01
【专利说明】一种蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备 方法和应用。
【背景技术】
[0002] 板栗，俗称"铁杆庄稼"，是我国重要的木本粮食树种之一。然而，板栗贮藏期间极 易发生腐变，生产中常采取化学抑菌剂处理后低温冷藏等方式进行贮藏；其贮藏成本高，并 且化学试剂的使用对人类健康及环境存在安全隐患。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法和应用，以解 决上述的问题。
[0004] 在本发明的实施例中提供的錯样芽孢杆菌（Bacillus cereus)，2014年4月1日 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC Μ 2014112,保藏名称为蜡样芽孢杆菌 CE-D10. 3. 2,保藏地址为：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072。
[0005] 本发明实施例提供的一种蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂，包含以下组分：按重量 百分比计，蜡样芽孢杆菌冻干粉50-70 %，助剂8-12 %，稳定剂0. 5-1. 5 %，紫外保护剂 0.05-0. 15%，余量为载体。
[0006] 优选地，所述蜡样芽孢杆菌冻干粉通过以下方法制备：
[0007] (a)、将所述蜡样芽孢杆菌培养至对数生长期，得到种子液；
[0008] (b)、将所述种子液以体积百分数为1?5%的接种量接种于种子罐中，所述种 子罐的培养条件为：通气比1 :〇. 9-1. 1，搅拌转速150?200r/min，温度35?37°C，罐压 0. 015-0. 020MPa，培养至活菌含量为1?3X 109cfu/ml，得到菌悬液；
[0009] (c)、在所述菌悬液中加入冷冻保护剂后放置于-75?_85°C超低温冰箱预冻 2. 5-3. 5h ;然后在-55?-65°C，真空度为95-105Pa，冻干20-30h ;然后在0?45°C进行粉 碎，得到所述蜡样芽孢杆菌冻干粉。
[0010] 优选地，所述载体为白炭黑、轻质碳酸钙、硅藻土中的任一种。
[0011] 优选地，所述分散剂为木质素磺酸钠、烷基萘磺酸缩聚物钠盐中的任一种；所述助 剂包括润湿剂和分散剂，所述润湿剂为Morwet EFW和茶皂素中的任一种。
[0012] 优选地，所述分散剂为木质素磺酸钠，所述润湿剂为Morwet EFW，且所述木质素磺 酸钠与所述Morwet EFW的重量比为3 :7?6:4。
[0013] 优选地，所述稳定剂为碳酸钙或磷酸氢二钾。
[0014] 优选地，所述紫外保护剂为β -环糊精。
[0015] 本发明的实施例还提供了蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，将各组分混合均 匀，粉碎，制得目数不大于150目的粉剂，整个制备过程中温度保持在0?45°C。
[0016] 本发明还提供了蜡样芽孢杆菌在贮藏保鲜中的应用。
[0017] 本发明还提供了蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂在贮藏保鲜中的应用。
[0018] 本发明实施例中提供的蜡样芽胞杆菌是由板栗坚果中分离筛选而来，属于板栗内 生菌，对人畜及环境无害；本发明实施例中提供的蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂，对板栗等果实 储藏过程中常见的真菌病害，如栗疫菌、黑葡萄穗霉、腐皮镰刀菌、扩展青霉、炭疽菌和黑曲 霉等具有较好的抑制作用，对人畜无毒，成本低；能够很好的解决板栗室温贮藏问题，降低 储藏成本。本发明的蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂在生产中没有用到有机溶剂，降低了生产过 程中和产品中的污染，不会产生溶剂中毒；不会造成对人类健康的危害，以及对环境的污染 等问题，具有重要的环保意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1示出了本发明实施例3中各载体、润湿剂及分散剂与蜡样芽胞杆菌 CE-D10. 3. 2相容性检测数据的柱状图。
【具体实施方式】
[0020] 下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。
[0021] 实施例1
[0022] 蜡样芽孢杆菌的筛选
[0023] 蜡样芽孢杆菌CE-D10. 3. 2是从湖北省罗田县耐储藏板栗品种"玫瑰红"坚果中通 过分离、纯化以及筛选步骤获得的。
[0024] 采用形态特征、生理生化实验确定为蜡样芽胞杆菌，通过分子生物学鉴定法 16S rDNA同源序列比对，比对结果为同源性为100%，最终确定该菌株为蜡样芽胞杆菌 (Bacillus cereus)〇
[0025] 实施例2
[0026] 蜡样芽孢杆菌冻干粉的制备
[0027] (1)蜡样芽孢杆菌CE-D10. 3. 2接种到灭菌的LB液体培养基中，37°C，100?120r/ min条件下振荡培养至对数生长期，得到种子液，LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g/L，酵 母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH = 7. 4?7. 6 ;
[0028] (2)将种子液按照1?5% (V/V) %的接种量，接种于种子罐中，种子罐中的培养 基为通步骤（1)的LB液体培养基，在以下条件下进行培养：通气比1:0. 9-1. 1，搅拌转速 150?200r/min，温度35?37°C，罐压0. 015-0. 020MPa，培养时间为46?48h，得到活菌含 量为1?3X 109cfu/mL的菌悬液；
[0029] (3)在菌悬液中加入5%的甘油冷冻保护剂后，放置于-75?_85°C超低温冰箱预 冻2. 5-3. 5h ;然后在-55?-65°C，真空度为95-105Pa，冻干20-30h ;控制低温（0?45°C ) 在气流粉碎机中粉碎后，即得蜡样芽孢杆菌冻干粉，将其置于4°C保存，若长期保存需要真 空密封。制得的蜡样芽孢杆菌冻干粉中含菌量> l〇1(lcfu/g，活菌率>85%。
[0030] 实施例3
[0031] 蜡样芽胞杆菌可湿性粉剂的制备及优化
[0032] 1.各载体、润湿剂及分散剂与蜡样芽胞杆菌CE-D10. 3. 2相容性检测
[0033] 将载体（白炭黑、轻质碳酸钙、硅藻土、膨润土、高岭土、玉米粉、滑石粉，细度均通 过325目筛），润湿剂（十二烷基硫酸钠、烷基奈磺酸盐、茶皂素、十二烷基苯磺酸钠），及 分散剂（木质素磺酸钠、聚乙烯醇、烷基萘磺酸缩聚物钠盐、六偏磷酸钠、羧甲基纤维素纳） 各按照5%的比例分别加入lOOmL LB液体培养基中（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L， 氯化钠 l〇g/L，pH = 7. 4?7. 6)混匀，灭菌后接入lmL蜡样芽胞杆菌CE-D10. 3. 2种子液， 37°C，100?120r/min条件下振荡培养24h。以不加载体、润湿剂及分散剂的培养液作为 对照，每处理重复3次，采用平板菌落计数法，测定培养液中菌体含量，以此考察各组分对 CE-D10. 3. 2的生物相容性。
[0034] 以不加载体的培养液作为对照，每个处理重复3次，采用平板菌落计数法，测定培 养液中菌体含量，以此鉴定各组分对蜡样芽胞杆菌CE-D10. 3. 2的生物相容性。得到的结果 如图1所示。
[0035] 从图1可以看出，膨润土、滑石粉、十二烷基硫酸钠和羧甲基纤维素纳对蜡样芽胞 杆菌CE-D10. 3. 2的菌体生长影响较大，与对照相比，添加上述物质后，菌体生长率下降大 于40%，其它物质成分对菌体的生物相容性较高。
[0036] 对润湿剂来说：烷基奈磺酸盐、茶皂素和十二烷基苯磺酸钠与蜡样芽胞杆菌 CE-D10. 3. 2相容性较好。
[0037] 对分散剂来说：木质素磺酸钠、聚乙烯醇、烷基萘磺酸缩聚物钠盐和六偏磷酸钠与 蜡样芽胞杆菌CE-D10. 3. 2相容性较好。
[0038] 去除对菌体生长量影响较大（与对照相比生长量下降大于40% )的载体和助剂， 使用其余材料进行后续优化试验。
[0039] 2.载体的筛选
[0040] 选择上述检测对蜡样芽胞杆菌CE-D10. 3. 2的生物相容性较高的载体物质：白炭 黑、轻质碳酸钙、硅藻土、高岭土、玉米粉分别与蜡样芽胞杆菌CE-D10. 3. 2冻干原粉按照4 : 6的质量比进行混合均勻，以不含载体的冻干原粉为对照，分别在室温中贮藏15d后测定菌 体存活率及悬浮率，筛选出最适载体。结果如表1所示。
[0041] 表1载体对蜡样芽胞杆菌CE-D10. 3. 2菌体生长的影响
[0042]
【权利要求】
1. 蜡样芽孢杆菌，其特征在于，保藏号为CCTCC Μ 2014112,保藏名称为蜡样芽孢杆菌 (Bacillus cereus)CE_D10. 3. 2。
2. -种蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，包含以下组分：按重量百分比计，蜡样 芽孢杆菌冻干粉50-70 %，助剂8-12 %，稳定剂0. 5-1. 5 %，紫外保护剂0. 05-0. 15 %，余量 为载体。
3. 根据权利要求2所述的蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌 冻干粉通过以下方法制备： (a) 、将所述蜡样芽孢杆菌培养至对数生长期，得到种子液； (b) 、将所述种子液以体积百分数为1?5%的接种量接种于种子罐中，所述种子 罐的培养条件为：通气比1:0. 9-1. 1，搅拌转速150?200r/min，温度35?37 °C，罐压 0. 015-0. 020MPa，培养至活菌含量为1?3X 109cfu/ml，得到菌悬液； (c) 、在所述菌悬液中加入冷冻保护剂后放置于-75?-85 °C超低温冰箱预冻 2. 5-3. 5h ;然后在-55?-65°C，真空度为95-105Pa，冻干20-30h ;然后在0?45°C进行粉 碎，得到所述蜡样芽孢杆菌冻干粉。
4. 根据权利要求2所述的蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，所述载体为白炭黑、 轻质碳酸钙、硅藻土中的任一种。
5. 根据权利要求2所述的蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，所述助剂包括润湿 剂和分散剂，所述分散剂为木质素磺酸钠、烷基萘磺酸缩聚物钠盐中的任一种；所述润湿剂 为Morwet EFW和茶皂素中的任一种。
6. 根据权利要求5所述的蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，所述分散剂为木质 素磺酸钠，所述润湿剂为Morwet EFW，且所述木质素磺酸钠与所述Morwet EFW的重量比为 3 :7 ?6:4〇
7. 根据权利要求2所述的蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，所述稳定剂为碳酸 钙或磷酸氢二钾；优选地，所述紫外保护剂为β-环糊精。
8. 权利要求1-7任一项所述的蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，将 各组分混合均匀，粉碎，制得目数不大于150目的粉剂，整个制备过程中温度保持在0? 45。。。
9. 权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌在贮藏保鲜中的应用。
10. 权利要求2-7任一项所述的蜡样芽孢杆菌可湿性粉剂在贮藏保鲜中的应用。
【文档编号】A01P3/00GK104232518SQ201410428209
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年8月27日 优先权日:2014年8月27日
【发明者】程水源, 李琳玲, 王燕, 程华, 华娟, 袁红慧, 张雪花, 黄小花 申请人:武汉轻工大学