专利名称：一株产酸蜡样芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株产酸蜡样芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
乳酸菌在发酵过程中产生有机酸、各种消化酶及乳酸菌素，畜禽饲料中添加乳酸菌类益生素能有效降低胃肠道内的PH，抑制病原菌的生长，提高饲料报酬，增强畜禽免疫力。近年来乳酸菌类益生素的研究越来越深入。但是，一般乳酸菌的营养要求较高，对不良环境的抵抗力差，特别是抗干燥、抗高温、抗胃酸和胆汁的能力较弱，因此，能活着进入肠道的乳酸菌种类和数量为数不多。普通的乳酸菌对环境耐受性差影响了乳酸菌的应用，它不耐高温，在高温制粒的过程中存活率极低，因此在饲喂颗粒料的生产应用中受到了很大的限制。产酸芽孢杆菌是优选出能产乳酸的芽孢菌，兼具乳酸菌和芽孢菌的优势，可作为一种新型的微生物添加剂开发和应用。国内最早报道的产酸芽孢菌是1996年王艳萍等筛选的一株名为TQ33的菌株，后来鉴定TQ33为凝结芽孢杆菌，随后对产酸芽孢菌的研究慢慢展开。苏勇等O006)研究表明产酸芽孢菌Sl能提高断奶后仔猪空肠和结肠食糜中乳酸菌与大肠杆菌的数量比值，而乳酸菌所占比例的提高能够预防仔猪腹泻；研究发现产酸芽孢菌对哺乳仔猪黄白痢有良好的预防效果，连续灌服3d产酸芽孢菌制剂对乳猪黄白痢的预防率可达到99. 5% ；在仔猪出生时即投喂产酸芽孢菌TPY-211 口服液，对防治7日龄内仔猪腹泻有明显效果(P < 0. 01)。另外，产酸芽孢菌在肉鸡上的试验也取得了良好的效果，产酸芽孢菌制剂能提高AA肉鸡生产性能，显著提高21 42日龄黄羽肉鸡平均日采食量、平均日增重和饲料转化率，同时可增强试验组肉鸡的免疫性能。不仅如此，产酸芽孢菌在水产养殖中的应用越来越受欢迎，鱼虾颗粒料对制粒条件的要求更加严格，普通的乳酸菌制剂根本不可能成活，因此开发可以产乳酸的芽孢菌不仅能承受高温高压的制粒过程，发挥芽孢菌的优势，并且被鱼虾采食后，可以发挥乳酸菌的优势，起到调节胃肠PH，提高饲料报酬， 增强免疫力的作用。由上可见，筛选具有产酸能力的芽孢菌不仅具有乳酸菌的优势，而且在发酵后期可以产生芽孢，可以很好地耐受高温、高压的制粒过程，提高存活率。目前所报道的产酸芽孢菌多为凝结芽孢杆菌，尚未见到有产酸蜡样芽孢杆菌的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明经筛选得到了一株产酸蜡样芽孢杆菌及其应用，为开发肉禽及水产专用益生素提供了平台。本发明是通过以下技术方案实现的一株产酸蜡样芽孢杆菌，该菌株命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，已于 2011年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2011352。所述菌株的菌学特征为菌落为圆形或近似圆形，呈无色素的白色，菌体细胞杆状，成短或长链，培养48h，菌落不透明，直径可达10mm，表面粗糙，边缘不整齐，平铺似毛玻璃状。产芽孢，中生，革兰氏阳性，无荚膜。所述菌株的最适培养条件为培养基酵母膏0.5%，蛋白胨0.6%，葡萄糖1.0%， 磷酸氢二钾0.5%，硫酸镁0.02%，硫酸锰0.08% (按质量百分数)，调pH至7. 5。最适温度35°C，好氧。本发明还对产酸蜡样芽孢杆菌的液体工业大规模生产的工艺及培养基做了摸索研究，经研究，其最佳培养基配方如下 种子培养基酵母膏0. 5 %，蛋白胨0. 6 %，葡萄糖1.0%，磷酸氢二钾0. 5 %，硫酸镁0.02%，硫酸锰0.08% (按质量百分数)。液体发酵培养基玉米粉3. 0 %，豆粉3. 2 %，麸皮2. 5 %，硫酸铵0. 8 %，硫酸镁0. 01%，磷酸氢二钠1%，磷酸二氢钠0. 075%，柠檬三钠0. 1% (按质量百分数)。其最佳生产工艺流程如下(1) 一级种子斜面接种，500mL三角瓶装量lOOmL，35°C，220rpm摇床培养10 16h ；接入二级种子液扩大培养。(2) 二级种子5L三角瓶装量1L，接种量6% (ν/ν)，35°C，220rpm摇床培养12 18h ；接入三级种子液扩大培养。(3)三级种子100L 发酵罐装量 60L，4% (ν/ν)接种，35°C，220rpm 培养 10 16h ； 接入发酵罐进行工业化生产。(4)发酵罐培养条件2%接种(v/v)，35°C，220rpm培养沈 32h，镜检形成芽孢 90 %左右，放罐，喷干，获得芽孢菌粉。所述产酸蜡样芽孢杆菌菌粉可以用于制备微生态制剂，应用时，产酸蜡样芽孢杆菌菌粉可以单独作为有效成分与玉米淀粉混合制成微生态制剂，或产酸蜡样芽孢杆菌菌粉与其它至少一种有效成分或菌粉以及玉米淀粉混合制成复合微生态制剂。优选的，产酸蜡样芽孢杆菌菌粉与枯草芽孢杆菌N9-1-35菌粉、丁酸梭菌Cb-2菌粉和玉米淀粉混合制成复合微生态制剂。本发明还提供了一种复合微生态制剂M3，其是以三大耐高温菌种枯草芽孢杆菌 N9-1-35 (已于2011年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为=CCTCC M2011301)、丁酸梭菌Cb-2 (已于2011年11月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2011384)以及本发明的产酸芽孢菌GFl (10X 108cfu/g)及玉米淀粉混合制成，三种菌粉及玉米淀粉的质量比为1 :2:2: 5，各菌粉的活菌数分别大于或者等于 1. OX 109cfu/g、5. OX 108cfu/g、5. OX 108cfu/g。其功能及效果如下1、可以提高饲料报酬，降低料肉比，从而降低养殖成本。2、可以增强机体的总抗氧化水平，降低各种氧化应激所产生的副作用。3、可以提高脾脏、法氏囊器官指数。4、可以增加免疫器官指数，提高机体内IgG水平，增强机体产生抗体的能力，从而增强抵抗力。具体应用时，可以按照0. 5%。 2. 0%o (质量比)的比例添加于饲料中。本发明的产酸蜡样芽孢杆菌，不仅具有良好的生长性能，而且在发酵终点能够有效地形成芽孢。不仅具备乳酸菌的特点可以代谢产生有机酸，主要为乙酸和乳酸及少量丙酸和丁酸，而且可以形成芽孢，增强了其抗应激性，能够耐热、耐酸、耐胆盐，可以耐受高温制粒、低PH和高胆盐环境，顺利通过胃和十二指肠，进入肠道内发挥其益生菌的作用，因此，可以用于制备复合微生态制剂M3。实际应用时，可以与部分抗生素同时使用，但为了保证本发明的菌能够充分发挥益生素的作用，应尽量避免与抗生素同时使用或使用时先做抑菌试验。另外，通过小鼠的急性毒性试验表明，本发明的产酸蜡样芽孢杆菌安全无毒副作用，可以放心地作为益生素在饲料中添加使用。
本发明提供的菌株命名为蜡样芽孢杆菌GF-IBacillus cereus GF-1，已于2011年 10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO =M 2011352，保藏地址为中国武汉武汉大学。菌株枯草芽孢杆菌N9-l-35Bacillus subtilis N9-1-35，已于 2011 年 08 月 31 日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO =M 2011301，保藏地址为中国武汉武汉大学。菌株丁酸梭菌Cb-2Clostridium butyricum Cb_2，已于 2011 年 11 月 09 日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO =M 2011384，保藏地址为中国武汉武汉大学。图1为GFl菌落融钙图，图中菌落周围透明的部分即为融钙圈，表示产酸。图2为16srDNA的PCR扩增产物电泳图，其中，M代表marker，1禾Π 2为16S rDNA 序列的两个重复。图 3 为 GFl 与 GU056812. 1，GU250444. 1，FJ665379. 1 序列对比结果示意图。图4为LYN3发酵液pH变化曲线图。图5为GFl抗生素药敏图，图中，数字代表1、盐酸林可霉素；2、硫酸粘杆菌素；3、 盐酸土霉素；4、酒石酸泰乐菌素；5、多西环素。图6为GFl生长曲线。图7为各试验组料重比对照图。图8为血清总抗氧化能力T-AOC测定结果示意图。图9为各试验组IgG水平比较。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例一产酸芽孢杆菌的筛选及其它研究一、产酸芽孢杆菌的筛选1试验材料1. 1分离源鸡肠道、鸡粪便、猪粪便、牛粪便1. 2 培养基1. 2. 1菌种分离用培养基基础培养基酵母膏0. 5 %，蛋白胨0. 5 %，葡萄糖0.5%，磷酸氢二钾0. 5 %，硫酸镁0. 02%,硫酸锰0. 08%,碳酸钙1. 5%，琼脂1. 5%。
1. 2. 2菌种培养用培养基种子培养基酵母膏0. 1%，蛋白胨0. 1%，葡萄糖0. 1%，磷酸二氢钾0. 1%，硫酸镁 0.02%，硫酸锰 0.02%，pH 7.0 7. 5。发酵培养基(基础)酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，葡萄糖0.5%，磷酸氢二钾 0.5%，硫酸镁0.02%，硫酸锰0. 08 %。2菌种筛选2. 1产酸芽孢菌分离纯化方法采用菌种分离培养基，涂布分离，40°C培养48h，挑选生长速度快、周围产生融钙圈的单个菌落作为分离菌株，取一环分离菌使其分散于生理盐水中，90°C水浴15min，再按上述方法进行分离，选取单一菌落划线培养。2. 2鉴定方法菌种鉴定采用16S rDNA保守序列的PCR鉴定法和常规生理生化检测试验，16S rDNA保守序列的PCR鉴定法具体方法如下细菌16S rDNA扩增的引物序列为上游5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，下游5’ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，， 序列由上海生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为dNTP Mixture 4yL, 5XPrimeSTARBuffer 10 μ L，上下游引物各 0. 6 μ L，基因组模板 0. 8 μ L, PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0. 6 μ L，用无菌去离子水补充至50 μ L。PCR循环参数为95 °C 5min ； 94°C lmin，58°C 15s，72°C 2min，30个循环；72°C IOmin0将PCR反应产物送上海桑尼生物科技有限公司测序，测序结果应用DNAMar软件下的MegAlign子软件进行分析。3产酸蜡样芽孢菌的性能检测3. 1菌株芽孢形成率测定发酵液中芽孢百分数的测定将筛选得到的菌株GFl在发酵培养基中37°C， 220rpm培养48h。处理一取ImL菌液梯度稀释法计发酵液中活菌总数；处理二 取部分菌液在沸水中加热lOmin，然后取ImL菌液梯度稀释法计热处理后活菌数。计算芽孢形成率。 芽孢形成率=热处理后活菌数/发酵液中活菌总数X 100%。3. 2菌株代谢产物(有机酸)分析菌株经摇瓶液体发酵培养，每隔池取发酵液5mL，直至发酵培养48h，绘制pH变化曲线，根据检测结果选取发酵初期PH迅速下降的6 12h，发酵液5000rpm离心lOmin，所得上清进行液相色谱分析有机酸的含量及组成成分。3. 3菌株应用稳定性的研究菌株的耐酸、耐胆盐和耐热性能检测分别将GFl菌株液体发酵培养48h，镜检至大部分菌体形成芽孢，未形成芽孢的菌体80°C水浴15min灭活，平板培养计数，作为待测菌株耐受性试验的起始浓度，经热处理(80°C水浴15min)的发酵液作为待测液，备用。3. 3. 1酸耐受试验将液体发酵培养基的起始pH分别调节为2. 0,3. 0,4. 0,5. 0，接种lh、2h、;3h后取样，平板培养计数。3. 3. 2胆盐耐受试验液体发酵培养基高压灭菌后，加入胆盐母液(10% )，使其胆盐浓度分别为0. 2%, 0. 3%,0. 4%，接种0. 5h、l. 5h,2h后取样，平板培养计数。3. 3. 3热稳定性试验菌株液体发酵培养48h，残留菌体80°C水浴15min灭活处理后，设定温度梯度为85°C、90°C、95°C，水浴15min后取样，平板培养计数。3. 3. 4产酶性能检测分别取不同生长阶段对数生长前期他、中期16h、后期24h和^h以及发酵终点 48h的发酵液，进行酶活检测。采用Folin福林酚法测定中性蛋白酶和酸性蛋白酶，采用 CMC糖化力法测定发酵液纤维素酶活力。3. 4对抗生素的敏感性试验选取盐酸林可霉素、硫酸粘杆菌素、盐酸土霉素、酒石酸泰乐菌素、多西环素五种抗生素，按推荐用量配成不同梯度溶液，管碟法测定抑菌圈直径，其中指示菌为所分离菌株，浓度为 1. 8X108cfu/mL。4产酸芽孢菌液体发酵条件优化研究产酸芽孢菌液体发酵中的发酵温度、初始pH值、通风量、发酵时间和接种量等各项因素对菌体产量和芽孢形成的影响。4.1发酵温度的确定温度通过影响微生物膜液晶结构、酶和蛋白质的合成和活性，以及RNA的结构及转录等影响微生物的生理活动，对微生物的生长直接产生影响。分别在^°C、30°C、33°C、 35°C、37°C、40°C不同温度下，对所筛选的菌进行发酵培养48h，于不同时段测定活菌数。4. 2发酵最佳初始pH测定微生物需要在一定的酸碱度的环境中才能正常的生长繁殖，pH过高或过低都会抑制微生物的生长。本试验分别在PH为6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0下培养至发酵终点48h，于不同时段测定活菌数。4. 3通风量的确定供氧量的多少会直接影响菌株的生长或代谢作用。因此发酵过程中通风量的大小直接影响菌体的生成，试验以装样量和摇床转速为通风量大小的代表，研究了芽孢菌在不同装样量(500mL三角瓶装样50mL、100mL、150mL、200mL)和摇床转速(160rpm、180rpm、 200rpm、220rpm)下菌体生成量的变化。分别在35°C培养3 后测定菌体含量。4. 4培养基碳源和氮源组成配比优化将发酵培养基中碳源和氮源的含量上下适当调整，将作为主要碳源的葡萄糖含量为别设为0. 75 %、1. 0 %、1. 25 %，氮源蛋白胨的含量分别设为0. 4 %、0. 6 %、0. 8 %，进行两因素三水平的正交试验，在发酵20h取发酵液测定发酵4 平板计数法记录活菌数，同时 95°C煮15min灭活菌体，计芽孢数，确定碳源和氮源的最佳配比。5生长曲线的绘制按照发酵优化结果，将GFl经500mL摇瓶液体发酵培养，每隔池取发酵液lmL，平板梯度稀释法，35°C培养24h计菌落总数，绘制生长曲线。6动物安全性试验6. 1试验动物昆明种小鼠，动物级别二级，雌雄各半共50只，体重18 22g。6. 2试验动物分组与饲喂基础日粮预饲1周后随机分为5组，其中1组为对照组，其余4组为试验组。根据人每天大约需要5 X IO8个活菌，设定试验组小鼠每天服用活菌数为人每天需要量的1/5倍、1倍、5倍和10倍。将喷干菌粉稀释后拌料、重新制粒，连续饲喂30天。试验区封闭、清洁级，试验期间观察小鼠体态，试验结束时解剖小鼠心脏、肝脏、肾脏和脾脏，观察有无病变。二、结果与分析2. 1菌株的分离与鉴定2. 1. 1产酸芽孢菌的分离从鸡肠道内容物以及鸡、猪和牛新鲜粪便中分离得到25株目标菌株，使得平板内菌落周围的培养基颜色由白色不透明变为透明淡黄色，说明所选菌株产酸并将培养基中的碳酸钙融解，其中菌株GFl较其它菌株发酵液生物量高，融钙圈大(如图1所示)，因此选择 GFl为试验备选菌株。2. 1. 2产酸芽孢菌的分子生物学和生理生化鉴定产酸芽孢菌的分子生物学检测取GFl发酵液lmL，提取总DNA，PCR扩增16S rDNA 序列，PCR产物电泳结果显示，在分子量大小为1400bp左右得到一条特异性好的条带，与预期结果一致(如图2所示)。将GFl菌株的16S rDNA目的片段切胶回收(TAKARA胶回收试剂盒)，送TAKARA测序，将序列测定结果(如序列表1所示)输入GeneBank中与已知序列进行比较，测定结果表明GFl与编号为GU056812. 1,GU250444. 1,FJ665379. 1菌株同源性为99. 4% (如图3所示)°GFl生理生化检测结果(如表1所示)在选择性培养基上，35°C，培养Mh，可形成圆形或近似圆形、无色素的白色菌落，菌体细胞杆状，成短或长链，培养48h，菌落不透明， 直径可达10mm，表面粗糙，边缘不整齐，平铺似毛玻璃状。产芽孢，中生，革兰氏阳性，无荚膜。表1分离菌株的生理生化特征
权利要求
1.一株产酸蜡样芽孢杆菌，其特征在于该菌株命名为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus,已于2011年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2011352。
2.根据权利要求1所述的产酸蜡样芽孢杆菌，其特征在于所述菌株的特征为菌落为圆形或近似圆形，呈无色素的白色，菌体细胞杆状，成短或长链，培养48h，菌落不透明，直径可达10mm，表面粗糙，边缘不整齐，平铺似毛玻璃状。产芽孢，中生，革兰氏阳性，无荚膜。
3.权利要求1所述的产酸蜡样芽孢杆菌在制备微生态制剂中的应用。
4.一株产酸蜡样芽孢杆菌菌粉，其特征在于是通过培养权利要求1所述的产酸蜡样芽孢杆菌制备得到的。
5.权利要求4所述的产酸蜡样芽孢杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，步骤如下(1)一级种子斜面接种，500mL三角瓶装量100mL，35°C，220rpm摇床培养10 16h ； 接入二级种子液扩大培养；(2)二级种子5L三角瓶装量1L，接种量6%，35°C，220rpm摇床培养12 18h ；接入三级种子液扩大培养；(3)三级种子100L发酵罐装量60L，4%接种，35°C，220rpm培养10 16h；接入发酵罐进行工业化生产；(4)发酵罐培养条件2%接种，351，220印111培养沈 3211，镜检形成芽孢90(%，放罐， 喷干，获得芽孢杆菌菌粉。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中种子培养基的配方为酵母膏0. 5 %，蛋白胨0. 6 %，葡萄糖1.0%，磷酸氢二钾0.5%，硫酸镁0.02%，硫酸锰 0. 08% ；所述步骤( (3) (4)中液体发酵培养基的配方为玉米粉3.0%，豆粉3.2%，麸皮2. 5 %，硫酸铵0. 8 %，硫酸镁0. 01 %，磷酸氢二钠1 %，磷酸二氢钠0. 075 %，柠檬三钠0. 1%ο
7.权利要求4所述的产酸蜡样芽孢杆菌菌粉在制备微生态制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于应用时，产酸蜡样芽孢杆菌菌粉单独作为有效成分与玉米淀粉混合制成微生态制剂，或产酸蜡样芽孢杆菌菌粉与其它至少一种有效成分或菌粉以及玉米淀粉混合制成复合微生态制剂。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于应用时，产酸蜡样芽孢杆菌菌粉与枯草芽孢杆菌N9-1-35菌粉、丁酸梭菌Cb-2菌粉和玉米淀粉混合制成复合微生态制剂。
10.一种复合微生态制剂，其特征在于由产酸蜡样芽孢杆菌菌粉、枯草芽孢杆菌 N9-1-35菌粉、丁酸梭菌Cb-2菌粉及玉米淀粉混合制成，其中，三种菌粉及玉米淀粉的质量比为1 2 2 5，各菌粉的活菌数分别大于或者等于1.0X109CfU/g、5.0X108CfU/g、 5. 0X108cfu/g。
全文摘要
本发明公开了一株产酸蜡样芽孢杆菌，该菌株命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，已于2011年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2011352。本发明的菌株可以用于制备微生态制剂，应用时，产酸蜡样芽孢杆菌菌粉可以单独作为有效成分与玉米淀粉混合制成微生态制剂，或产酸蜡样芽孢杆菌菌粉与其它至少一种有效成分或菌粉以及玉米淀粉混合制成复合微生态制剂。本发明还提供了一种复合微生态制剂M3，其是以三大耐高温菌种枯草芽孢杆菌N9-1-35、丁酸梭菌Cb-2以及本发明的产酸芽孢菌GF1及玉米淀粉混合制成，三种菌粉及玉米淀粉的质量比为1∶2∶2∶5，各菌粉的活菌数分别大于或者等于1.0×109cfu/g、5.0×108cfu/g、5.0×108cfu/g。
文档编号C12N1/20GK102517238SQ20111045528
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者刘巧利, 单宝龙, 张建梅, 穆熙军, 翟延庆, 胡顺珍, 谢全喜, 谷巍 申请人:山东宝来利来生物工程股份有限公司