一种蜡样芽孢杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种蜡样芽孢杆菌及其应用，而提供一种能够同时分泌两种分子量类型的胶原酶的蜡样芽孢杆菌及其制备方法和应用。本发明的蜡样芽孢杆菌为Bacillus?cereus，保藏编号为CGMCC?NO.8614，所产生的酶液中包含两种分子量不同的胶原酶，即分子量为106kDa的胶原酶Ⅰ和分子量为95kDa的胶原酶Ⅱ。本发明的蜡样芽孢杆菌能够分泌两种分子量类型的胶原酶，能够高效降解鱼鳞、鱼皮、鱼骨、牛骨、猪皮中的胶原蛋白或明胶，有利于农副产品的开发利用、水产品加工、环境污染治理、医疗以及食品工业开发。同时，有利于作为复合酶制剂应用于工业生产中，可大大提高原料的利用率，扩大了微生物胶原酶的应用领域。
【专利说明】一种蜡样芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物【技术领域】，更具体地说是涉及一种蜡样芽孢杆菌及其在降解胶原蛋白或明胶方面的应用。
【背景技术】
[0002]胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理pH和温度条件下特异性地降解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。
[0003]胶原酶广泛应用于医学以及工业生产上。例如，目前临床上应用最广泛的药用胶原酶是指从溶组织梭状芽孢杆菌的发酵液中提取、纯化并精制而得的白色或类白色无菌冻干粉针生物制剂。胶原酶可使创口边缘胶原纤维降解，具有较好的清创作用，继而促使肉芽生长，上皮化，加快伤口愈合且对正常血管和神经组织无损伤作用。在临床上主要用于严重(I1-1II度)烧伤的清创、脱痂和植皮，亦可用于皮肤溃疡、褥疮等，治疗确切，安全可靠。此外，在工业方面，胶原酶也被广泛的应用于皮革工业的脱毛及软化过程，代替了传统的浸灰方法，既节省时间，又改善劳动卫生条件，且对环境危害小。同时，胶原酶还被广泛应用于蚕丝脱胶，肉类嫩化及酒类澄清等过程。
[0004]目前已研究的胶原酶以动物基质金属蛋白酶(MMPs)为主，细菌来源的胶原酶较少，最早研究的微生物来源胶原酶是溶组织梭状芽孢杆菌胶原酶，现已广泛应用于临床。细菌来源胶原酶与动物胶原酶不同之处主要在于:(I)底物种类不同:微生物胶原酶底物范围更为广泛，对动物胶原酶不能降解的IV、V型胶原也能轻易降解；(2)裂解方式不同:一般微生物胶原酶可作用于胶原的多个位点，产生小分子短肽或氨基酸，而动物胶原酶只作用于胶原N端3/4处Gly-Lue或Gly-1le肽键，产生一个3/4片段和1/4片段，分别命名为TCA(Tropocollagen “A，，fragment)和 TCB(Tropocollagen “B，，fragment) ； (3)获得的难易不同:微生物胶原酶绝大多数可分泌到胞外，通过发酵培养可大量获得，而动物胶原酶需要进行组织培养和提取，较难获得；(4)潜在的降解胶原能力不同:微生物胶原酶具有更高的降解活性。因而，微生物来源的胶原酶具有更广的应用价值。
[0005]目前，利用生物技术途径筛选具有胶原酶活性的微生物已成为国内外研究的热点。目前已发现的分泌胶原酶的微生物具有多样性的特点，比如从深海到土壤，从需氧到厌氧，从细菌到真菌等等。
[0006]我国在微生物胶原酶方面的研究与应用还处于刚起步阶段，国内市场依赖大量高价进口胶原酶产品，限制了微生物胶原酶的应用。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，提供一种能够同时分泌两种分子量类型的胶原酶的蜡样芽孢杆菌。
[0008]本发明的另一个目的是提供一种蜡样芽孢杆菌在生产胶原酶及降解胶原蛋白或明胶方面的应用。[0009]本发明的再一个目的是提供一种利用蜡样芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法。
[0010]为实现本发明的目的所采用的技术方案是:
[0011]—种腊样芽孢杆菌，拉丁文名称为Bacillus cereus,其保藏编号为:CGMCCN0.8614。
[0012]一种所述蜡样芽孢杆菌在生产含有胶原酶的酶液方面的应用，所得含有胶原酶的酶液中包含两种分子量不同的胶原酶，即分子量为106kDa的胶原酶I和分子量为95kDa的胶原酶II。
[0013]一种所产含有胶原酶的酶液在降解胶原蛋白和明胶方面的应用。
[0014]一种利用蜡样芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法，包括下述步骤:
[0015](I)将权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌使用LB液体培养基扩大培养，然后离心除去菌体，得到粗酶液；在冰浴条件下向粗酶液中加入硫酸铵粉末，沉淀所得粗酶液中的蛋白，得到沉淀物；所得沉淀物用PH值为7.5的Tris-HCl缓冲液复溶，所得复溶溶液用pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液在4°C条件下透析，透析后得到浓缩酶液；
[0016](2)将含胶原蛋白和/或明胶的溶液与步骤(1)所得浓缩酶液混合后于37°C水浴条件下降解胶原蛋白和/或明胶。
[0017]所述含有胶原蛋白和/或明胶的溶液为鱼鳞或鱼皮或鱼骨或牛骨或猪皮的提取液。 [0018]所述鱼鳞的提取液通过下述方法得到:
[0019](I)将干燥的鱼鳞浸于HCl溶液中在室温下搅拌脱钙；再将脱钙后的鱼鳞浸于Na2CO3溶液中，在室温条件下搅拌，使胶原蛋白中的胶原纤维的致密结构变疏松；最后，用蒸馏水将鱼鳞反复漂洗至中性；
[0020](2)将漂洗至中性的鱼鳞与蒸馏水混合，在压力为102.9kPa，温度为121°C条件下提取15-20min ;待提取液冷却至室温后，在室温下离心去除提取液中的杂质，所得上清液即为鱼鳞的提取液。
[0021]所述鱼鳞的脱钙的方法为:将清洗后干燥的鱼鳞浸于0.5mol/L的HCl溶液中在室温条件下搅拌脱钙2-4h。
[0022]含有胶原蛋白或明胶的提取液与浓缩酶液等体积混合。
[0023]所述鱼皮、鱼骨、牛骨或猪皮的提取液的制备方法为:将鱼皮、鱼骨、牛骨或猪皮作为原材料除去杂质后用电热鼓风干燥箱充分干燥；将每4g干燥后的原材料与IOOmL超纯水混合，在压力为102.9kPa，温度为121°C条件下提取15_20min ;待提取体系冷却至室温后，在室温下离心去除原材料提取液中的杂质，所得上清液即分别为鱼皮、鱼骨、牛骨或猪皮的提取液。
[0024]蜡样芽孢杆菌在LB液体培养基中扩大培养的培养时间为24h ；Tris-HCl缓冲液浓度为50mmol/L，按照每Img沉淀用5mL Tris-HCl缓冲液的比例复溶沉淀。
[0025]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0026]1、本发明的蜡样芽孢杆菌为一种新的胶原酶产生菌，能够分泌产生包含两种分子量类型的胶原酶，即胶原酶I和胶原酶II。一株细菌同时分泌两种具有胶原蛋白以及明胶降解能力的胶原酶，有利于作为复合酶制剂应用于工业生产中，可大大提高原料的利用率，减少了生产工序，从而降低了生产成本，扩大了微生物胶原酶的应用领域。[0027]2、本发明的蜡样芽孢杆菌能够分泌两种分子量类型的胶原酶，能够高效降解鱼鳞、鱼皮、鱼骨、牛骨、猪皮中的胶原蛋白或明胶，有利于农副产品的开发利用、水产品加工、环境污染治理、医疗以及食品工业开发。
[0028]3、本发明的利用蜡样芽孢杆菌降解鱼鳞、鱼皮、鱼骨、牛骨、猪皮中胶原蛋白的方法工艺过程简单，效果明显，实用性强。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1所示为本发明菌株蜡样芽孢杆菌R75E在5% (W/V)脱脂奶粉平板培养后的结果图；
[0030]图2所示为本发明菌株蜡样芽孢杆菌R75E16SrDNA的PCR扩增结果图；图中:M为DNA标准；1为16S rDNA扩增片段；
[0031]图3所示为本发明菌株蜡样芽孢杆菌R75E粗酶液的胶原蛋白酶谱图；图中-M为蛋白标准；1为粗酶液；
[0032]图4所示为本发明菌株蜡样芽孢杆菌R75E粗酶液明胶酶谱图；图中:M为蛋白标准；1为粗酶液；
[0033]图5所示为本发明菌株蜡样芽孢杆菌R75E粗酶液经硫酸铵沉淀复溶后所得浓缩酶液的银染结果，图中:M为蛋白标准；1、2均为浓缩酶液；
[0034]图6为本发明菌株蜡样芽孢杆菌R75E浓缩酶液对草鱼鱼鳞中I型胶原蛋白的降解的SDS-PAGE电泳图；图 中:M为蛋白标准；1为未经浓缩酶液处理的草鱼鱼鳞胶原蛋白；2为浓缩酶液与草鱼鱼鳞中I型胶原蛋白的反应产物；3_10分别为浓缩酶液稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍后与草鱼鱼鳞中I型胶原蛋白的反应产物；
[0035]图7所示为本发明菌株蜡样芽孢杆菌R75E浓缩酶液对草鱼鱼鳞中总胶原蛋白的降解的SDS-PAGE电泳图；图中:M为蛋白标准；1为未经浓缩酶液处理的草鱼鱼鳞胶原蛋白；2为经浓缩酶液降解后草鱼鱼鳞胶原蛋白。
【具体实施方式】
[0036]以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0037]本发明的实施例中所用培养基及溶液的配置如下:
[0038]5%脱脂奶粉平板的配制方法:在90mL TS溶液中加入5g脱脂奶粉、0.5%酵母提取物以及I %琼脂，用上述TS溶液定容至IOOmL,于115°C高压蒸汽灭菌锅中灭菌15min后倒平板，冷却后备用。所述TS溶液中含50mmol/L Tris-HCl缓冲液，150mmol/L NaCl，pH值为 8.0。
[0039]LB液体培养基的配制方法:在90mL去离子水中加入胰蛋白胨lg、酵母提取物0.5g、NaCllg,用5mol/L NaOH调pH值至7.0,用去离子水定容至IOOmL,于121°C高压蒸汽灭菌锅中灭菌20min后冷却待用。
[0040]LB固体培养平板的配制方法:在90mL去离子水中加入胰蛋白胨lg、酵母提取物0.5g、NaCllg、琼脂lg，用5mol/L NaOH调pH值至7.0，用去离子水定容至IOOmL,于121。。高压蒸汽锅中灭菌20min后倒平板，冷却后备用。
[0041]5 X 上样缓冲液:250mmol/L Tris-HCl 缓冲液(ρΗ6.8)，内含 0.5% (V/V)溴酚兰，50% (V/V)甘油，10% (W/V)十二烷基硫酸钠，5% (V/V) β-巯基乙醇组成。
[0042]洗脱液:50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.6)，内含2.5% (V/V)聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、5mmol/L CaCl20
[0043]漂洗液:50mmol/LTris-HCl 缓冲液(ρΗ7.6)，内含 5mmol/L CaCl20
[0044]孵育液:50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.6)，内含0.02 %十二烷基聚乙二醇醚(Brij)、200mmol/L NaCl、5mmol/L CaCl20
[0045]考马斯亮蓝染色液:考马斯亮蓝R-2501.0g溶于450mL甲醇与冰醋酸IOOmL的混合溶液后用蒸馏水定容至1L。
[0046]脱色液:IOOmL无水甲醇和IOOmL冰乙酸混合后用蒸懼水定容至1L。
[0047]本发明所用的分离胶和浓缩胶的浓度是指丙烯酰胺的浓度。
[0048]实施例1:具有蛋白降解活性的蜡样芽孢杆菌R75E的分离纯化
[0049](I)取ImL采集的人初乳用无菌超纯水稀释100倍后取200 μ L稀释液均匀涂布于5 %脱脂奶粉平板上，于37 °C培养12h，获得菌落周围具有明显透明圈的菌落。将涂布获得的菌落用牙签挑取分离，于5%脱脂奶粉平板上进行多次划线培养，每次培养条件均为37°C、12h，获得具有最佳蛋白降解效果的菌株，将其命名为R75E。R75E菌株在5%脱脂奶粉平板上37°C培养12h后的结果如图1所示，从图1中可以看出，在5%脱脂奶粉平板上菌株R75E的单菌落周围出现明显透明圈，经测量发现菌落直径大小约为3mm，透明圈直径约8mm ο
[0050](2)从步骤⑴中的5%脱脂奶粉平板上挑取菌株R75E的单菌落，分别接种至两管5mL LB液体培养基中培养，培养条件为37°C，150r/min，培养12h。培养结束后于1.5mL无菌离心管分别加入0.8mL菌液和0.2mL灭过菌的浓度为80%的甘油溶液，混合均匀后可长期保存于_80°C冰箱中。
[0051 ] 实施例2蜡样芽孢杆菌R75E的鉴定
[0052](I)细菌的形态特征
[0053]菌落形态:将实施例1中得到的具有最佳蛋白降解效果的菌株R75E于37°C下在LB固体培养平板上划线培养生长12h后，菌落为灰白色，不透明，边缘不整齐、表面较粗糙，似融蜡状，菌落较大，约3mm。细菌形态:菌体细胞呈杆状，菌体两端较平整，多数呈链状排列。芽胞呈椭圆形，多位于菌体中央或稍偏于一端。菌体大小:通过光学显微镜利用其目镜测微尺与镜台测微尺对菌株R75E单个细胞的大小进行测量，通过测量可知单个细胞宽约为1-2 μ m，长约为3-5 μ m。细菌好氧性观察:挑取实施例1中菌株R75E的单菌落于LB液体培养基中，试管密封，于37°C，培养15h。如果细菌分布于整个溶液中，则是兼性厌氧菌；如果主要分布于培养液表面而内部几乎无菌，则是好氧菌。菌株R75E在LB液体培养基中密封培养后，澄清透明的LB液体培养基变浑浊，细菌分布于整个溶液，表明R75E菌株为兼性厌氧菌。
[0054](2)菌株R75E的16S rDNA序列分析
[0055]根据细菌基因组16S rDNA的保守序列设计用于PCR鉴定的引物对，如SEQID No:l 所示的引物 Pl (5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和 SEQ ID No:2 所示的引物P2 (5-CTACGGCTACCTTGTTACGACT-3)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0056]用无菌牙签挑取实施例1中所得菌株R75E的单菌落于100 μ I无菌水充分混匀，获得菌悬液即为扩增16S rDNA片段的模板。50 μ L菌落PCR反应体系中各成分如下:
[0057]
【权利要求】
1.一种腊样芽孢杆菌，拉丁文名称为Bacillus cereus,其保藏编号为:CGMCCN0.8614。
2.—种权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌在生产含有胶原酶的酶液方面的应用，所得含有胶原酶的酶液中包含两种分子量不同的胶原酶，即分子量为106kDa的胶原酶I和分子量为95kDa的胶原酶II。
3.—种权利要求2所产含有胶原酶的酶液在降解胶原蛋白和明胶方面的应用。
4.一种利用权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法，其特征在于，包括下述步骤: (1)将权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌使用LB液体培养基扩大培养，然后离心除去菌体，得到粗酶液；在冰浴条件下向粗酶液中加入硫酸铵粉末，沉淀所得粗酶液中的蛋白，得到沉淀物；所得沉淀物用PH值为7.5的Tris-HCl缓冲液复溶，所得复溶溶液用pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液在4°C条件下透析，透析后得到浓缩酶液； (2)将含胶原蛋白和/或明胶的溶液与步骤(1)所得浓缩酶液混合后于37°C水浴条件下降解胶原蛋白和/或明胶。
5.根据权利要求4所述的利用蜡样芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法，其特征在于，所述含有胶原蛋白和/或明胶的溶液为鱼鳞或鱼皮或鱼骨或牛骨或猪皮的提取液。
6.根据权利要求5所述的利用蜡样芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法，其特征在于，所述鱼鳞的提取液通过下述方法得到: (1)将干燥的鱼鳞浸于HCl溶液中在室温下搅拌脱钙；再将脱钙后的鱼鳞浸于Na2CO3溶液中，在室温条件下搅拌，使胶原蛋白中的胶原纤维的致密结构变疏松；最后，用蒸馏水将鱼鳞反复漂洗至中性； (2)将漂洗至中性的鱼鳞与蒸馏水混合，在压力为102.9kPa，温度为121°C条件下提取15-20min;待提取液冷却至室温后，在室温下离心去除提取液中的杂质，所得上清液即为鱼鳞的提取液。
7.根据权利要求6所述的利用蜡样芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法，其特征在于，所述鱼鳞的脱钙的方法为:将清洗后干燥的鱼鳞浸于0.5mol/L的HCl溶液中在室温条件下搅拌脱钙2-4h。
8.根据权利要求4所述的利用蜡样芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法，其特征在于，含有胶原蛋白或明胶的提取液与浓缩酶液等体积混合。
9.根据权利要求5所述的利用蜡样芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法，其特征在于，所述鱼皮、鱼骨、牛骨或猪皮的提取液的制备方法为:将鱼皮、鱼骨、牛骨或猪皮作为原材料除去杂质后用电热鼓风干燥箱充分干燥；将每4g干燥后的原材料与IOOmL超纯水混合，在压力为102.9kPa，温度为121°C条件下提取15_20min ;待提取体系冷却至室温后，在室温下离心去除原材料提取液中的杂质，所得上清液即分别为鱼皮、鱼骨、牛骨或猪皮的提取液。
10.根据权利要求4-9中任一项所述的利用蜡样芽孢杆菌降解胶原蛋白或明胶的方法，其特征在于，蜡样芽孢杆菌在LB液体培养基中扩大培养的培养时间为24h ；Tris-HCl缓冲液浓度为50mmol/L，按照每Img沉淀用5mL Tris-HCl缓冲液的比例复溶沉淀。
【文档编号】C12R1/085GK104017761SQ201410283436
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月23日 优先权日:2014年6月23日
【发明者】阮海华, 张西轩, 王素英, 李晔 申请人:天津商业大学