30分钟后，弃上清，取沉淀；沉淀用20mM PB缓冲液溶解，并过0.45 μ m滤膜，取液体得菌丝霉素蛋白溶解液。
[0017]将菌丝霉素蛋白溶解液经Sephadex G25层析脱盐，再经阳离子交换层析CM柱进一步纯化。蛋白挂柱后，用0.3mM NaCl洗脱杂质蛋白(不含菌丝霉素)，用0.5mM NaCl洗出目的蛋白(含有菌丝霉素)，将0.5M NaCl洗脱液溶液进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，RP-HPLC色谱图如图1所示。从中可以看出，纯化后的菌丝霉素蛋白纯度很高，可达到90%以上，为药用级。
[0018]3)质谱鉴定
对上述纯化后的菌丝霉素蛋白进行质谱检测，检测结果如图2所示。从质谱图中可以看出在4414.8062处有最高峰，与理论分子量一致，说明纯化后的蛋白的确为菌丝霉素蛋白。
[0019]实施例2菌丝霉素蛋白对痤疮丙酸杆菌的抑制作用 I)对金黄色葡萄球菌26003的抑菌效果
取上述高效液相色谱纯化后的菌丝霉素蛋白，配成浓度为I μ g/ μ L，点样到含有金黄色葡萄球菌26003的琼脂平板上；同时，平板中还点有氨苄青霉素Amp和无菌水分别作为阳性对阴性对照；具体设置情况如图3所示，I为20 μ L的lug/uL菌丝霉素蛋白；2为40 μ L的I μ g/μ L菌丝霉素蛋白；3为60 μ L的的I μ g/μ L菌丝霉素蛋白；4为80 μ L的的I μ g/μ L菌丝霉素蛋白；5、为10yL的的I μ g/μ L菌丝霉素蛋白；“6”为无菌水，作为阴性对照；“7”为氨苄青霉素Amp，作为阳性对照；37°C过夜培养，观察结果。
[0020]结果如图3所示，所有点有不同体积菌丝霉素溶液和氨苄青霉素地方均出现了明显的抑菌圈，而点有无菌水处无抑菌圈，说明菌丝霉素具有抑金黄色葡萄球菌26003的作用。
[0021]2)对痤疮丙酸杆菌ATCC 11827的抑菌情况
取上述高效液相色谱纯化后的菌丝霉素蛋白，配成浓度为I μ g/ μ L，点样到含有痤疮丙酸杆菌ATCC 11827的琼脂平板上；同时，平板中还点有氨苄青霉素Amp和无菌水分别作为阳性对阴性对照；具体设置情况如图4所示，37°C过夜培养，观察结果。
[0022]结果如图4所示，所有点有不同体积菌丝霉素溶液地方均出现了与阳性对照一样明显的抑菌圈，而点有无菌水处无抑菌圈，说明菌丝霉素具有抑痤疮丙酸杆菌的作用。
[0023]实施例3菌丝霉素在制备治疗痤疮药剂中的应用一种治疗痤疮的菌丝霉素凝胶剂
1.一种治疗痤疮的菌丝霉素凝胶剂的配方为:菌丝霉素0.005%，卡波姆940 0.8%，甘油8%，尼泊金甲酯0.1%，尼泊金丙酯0.05%，三乙醇胺1.5%，余量为水，其中百分比均指质量百分比。
[0024]2.一种治疗痤疮的菌丝霉素凝胶剂的制备方法:
将菌丝霉素蛋白用少量蒸馏水溶解备用；按照配方中的含量将尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、甘油加入余下的蒸馏水中，加热溶解，然后加入卡波姆940，约24h使其充分溶胀，适量搅拌，加入三乙醇胺，调节pH值至6，加入菌丝霉素蛋白溶液，搅拌均匀，制成凝胶1000g，即为菌丝霉素凝胶剂。
[0025]3.菌丝霉素凝胶剂治疗人体皮肤痤疮的效果检测
方法:将上述制备的菌丝霉素凝胶剂用于治疗人体痤疮，选择面部有痤疮的患者20人，早晚各涂抹一次，每次涂抹1mL于患处；连续涂抹20天，对比治疗前后的效果，统计具有治疗效果的人数。
[0026]结果:连续治疗20天后，具有治疗效果的人数达16人，占80%。治疗前后的对比图如图5和图6所示。
[0027]图5为本发明菌丝霉素凝胶剂治疗面部痤疮前后的对比图'K、B分别为痤疮患者正面治疗前后对比图；C、D为左侧面治疗前后的对比图；E、F为右侧面治疗前后的对比图；其中B、D、F为红色区图片，以观察皮下毛细血管分布情况；痤疮越多皮下毛细血管越密集不均匀；从中可以明显看到治疗前患者皮下毛细血管较治疗后更加密集和不均匀。
[0028]图6为另一患者用本发明菌丝霉素凝胶剂治疗面部痤疮前后的对比图；A、B分别为痤疮患者正面治疗前后对比图；C、D为左侧面治疗前后的对比图；E、F为右侧面治疗前后的对比图；其中B、D、F为红色区图片，以观察皮下毛细血管分布情况；从中可以明显看到治疗前患者皮下毛细血管较治疗后更加密集和不均匀。
[0029]上述结果说明菌丝霉素和菌丝霉素凝胶剂对痤疮具有很好疗效，其中凝胶剂抗菌消炎作用更好，由于凝胶的胶黏特性，作用时间和保湿效果持久，并能有效的隔绝作用部位与空气的接触，避免炎症部位接触空气引发感染。使用方便，无需清洗。
[0030]为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。
【主权项】
1.一种菌丝霉素蛋白的表达方法，其特征在于:包括以下步骤: . 1)根据菌丝霉素NZ2114的蛋白序列SEQID NO: 1，合成优化的编码菌丝霉素NZ2114蛋白的基因序列SEQ ID NO:2 ;将所得的菌丝霉素基因序列SEQ ID N0:2连接到酵母表达载体PPicZa的a -factor信号肽下游的多克隆位点，将构建好的重组表达载体转化到毕赤酵母GSl 15中，筛选出阳性重组菌； .2)将上步筛选出的阳性重组菌进行诱导表达培养，提取并纯化所表达的目的蛋白，即为菌丝霉素蛋白。2.菌丝霉素蛋白在制备抑痤疮丙酸杆菌药剂中的应用。3.菌丝霉素蛋白在制备治疗痤疮药剂中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述的痤疮为由痤疮丙酸杆菌引发的痤疮。5.一种治疗痤疮的菌丝霉素凝胶剂，其特征在于:该菌丝霉素凝胶剂由以下质量百分比的成分组成:菌丝霉素0.001%?0.01%，卡波姆940 0.5%?1.0%，甘油5%?10%，尼泊金甲酯0.05%?0.20%，尼泊金丙酯0.01%?0.1%，三乙醇胺1.0%?2.0%，余量为水。6.一种治疗痤疮的菌丝霉素凝胶剂的制备方法，其特征在于:包括以下操作步骤: . 1)将菌丝霉素蛋白用蒸馏水溶解备用； .2)尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、甘油加入到蒸馏水中，加热溶解完全，然后加入卡波姆.940，使其充分溶胀，搅拌均匀，加入三乙醇胺，调节pH值至5.8?6.2，最后加入菌丝霉素蛋.白溶液，搅拌均匀，即可获得治疗痤疮的菌丝霉素凝胶剂； 上述所制得的菌丝霉素凝胶剂中含有以下质量百分比的成分:菌丝霉素0.001%?.0.01%，卡波姆940 0.5%?1.0%，甘油5%?10%，尼泊金甲酯0.05%?0.20%，尼泊金丙酯.0.01%?0.1%，三乙醇胺1.0%?2.0%，余量为水。
【专利摘要】本发明公开了一种菌丝霉素蛋白的表达方法及其在抑痤疮丙酸杆菌中的应用。本发明将所得的菌丝霉素基因序列SEQ？ID？NO:2连接到酵母表达载体pPicZα的α-factor信号肽下游的多克隆位点，将构建好的重组表达载体转化到毕赤酵母GS115中，筛选出阳性重组菌；进而融合分泌表达所需的菌丝霉素蛋白。本发明首次发现菌丝霉素具有抑制痤疮丙酸杆菌的作用，可用于制备痤疮丙酸杆菌的抑菌剂；可进一步用于治疗痤疮等皮肤炎症，尤其是对目前难以治疗的由痤疮丙酸杆菌引发的痤疮等皮肤炎症具有良好的疗效。本发明将纯化后得到的菌丝霉素蛋白，以一定的浓度，再添加其他铺助成分，制备成外用制剂，用于治疗寻常性痤疮。
【IPC分类】C07K14/37, A61P31/04, A61K9/06, A61P17/10, C12N15/31, A61K38/16, C12N15/81
【公开号】CN105018516
【申请号】CN201510397908
【发明人】周玉岩, 孙丹丹, 黄亚东, 张敏静, 项琪, 杨虹坤, 张齐
【申请人】广东海纳川生物科技股份有限公司, 广州暨南大学医药生物技术研究开发中心
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月7日