自上而下）：23· 1,9. 4, 6. 6, 4. 4, 2. 3, 2. Okb
[0028] [2]以13032原株基因组DNA为模板，R1437-R1438PCR扩增得到1446bp ;
[0029] [3]以crtI2基因敲除变株基因组DNA为模板，R1437-R1419PCR扩增得到IlOObp ;
[0030] [4]以crtI2基因敲除变株基因组DNA为模板，R1420-R1438PCR扩增得到1368bp ;
[0031] [5]以crtI2基因敲除变株基因组DNA为模板，R1437-R1438PCR扩增得到2446bp ;
[0032] [6]DL2000DNA 分子量标准（自上而下）：2. 0, 1. 0, 0· 75, 0· 5, 0· 25, 0· lkb。
【具体实施方式】
[0033] 在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。
[0034] 下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施 例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0035] 在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相 同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
[0036] 实施例中所用到的菌株和质粒，均为已公开的菌株和质粒：
[0037] I. Escherichia coli DH10B。 基因型 FlncrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80ΔIacZ ΔM15ΔlacX74 deoR recAl araD139A (ara, leu)7697 galU galK rpsL endAl nupG。文献：Life Technologies, Inc.Focus, 1990, 12:19。购自美国 Invitrogen 公司。
[0038] 2.谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)。文 献：Kalinowski, J 等 The complete Corynebacterium glutamicum ATCC 13032genome sequence and its impact on the production of L-aspartate-derived amino acids and vitamins. J. Biotechnol. 2003, 104(1-3) :5-25。来自捷克科学院微生物学研宄所的 Jan Nesvera 博士。
[0039] 3. pBluescript II KS(-)。文献：Alting-Mees MA, Short JM. pBluescript II: gene mapping vectors. NucleicAcids Res. 1989, 17 (22) :9494.购自美国 Novagen 公 司。
[0040] 4·ρΕΚΕχ3〇 文献：Citrate synthase in Corynebacterium glutamicum is encoded by two gitA transcripts which are controlled by RamA, RamB, and GlxR. J. B iotechnol. 2011，154(2-3) : 140-148.来自德国尤里希研宄中心的 Lothar Eggeing 教授。
[0041] 5.pSN101。文献：张飞飞，王瑞青，朱宇鹏，马超，尚广东.大肠杆菌系列融合表达 载体的构建，南京师大学报（自然科学版），2013, 36 (3) :97-102.申请者研宄组所构建。
[0042] 6.pKsacB和pLS1662。文献：杨运文，蒋伏欢，宋杰，尚广东，重组工程法敲除恶臭 假单胞菌KT2440的染色体基因，南京师范大学学报（自然科学版），2011，34(4) :96-101. 申请者研宄组所构建。
[0043] 实施例1.构建诱导表达重组酶基因的质粒
[0044] 首先克隆含核糖体结合位点的填充片段。设计引物R1407 :5' -GGGCTGCAGAAGGAGA TATAGATCCATGGCCTTCACCAGCACCTTGGTG-3'，（SEQ ID NO. 1)，酶切位点 PstI 和 NcoI 以下划线 表示，PstI和NcoI之间、以斜体表示的序列为核糖体结合位点序列，为克隆在质粒上的基 因在谷氨酸棒杆菌 ATCC 13032 中表达所必需；R1408 :5, -GGGGAATTCACCCCCGGCCAGGCCAACT AC-3'，（SEQ ID NO. 2)，酶切位点BamH以下划线表示。以pSNIOl为模板，R1428和R1409PCR 获得I. 5kb的片段，I. 5kb以PstI和BamHI双酶切后和3. Okb以同样酶切的pBluescript II KS(-)连接，转化大肠杆菌（Escherichia coli)DH10B的电转化感受态细胞，在含异丙 基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷（X-Gal)的氨苄 青霉素抗性平板上，蓝白斑筛选转化子，经培养、提质粒酶切和通用引物M13F和M13R的测 序验证序列正确后，所得重组克隆命名为PLS2333。其次将填充片段至表达载体ρΕΚΕχ3,将 PLS2333以PstI和BamHI酶切，回收I. 5kb片段，将之和8. 3kb以PstI和BamHI酶切，并经 碱性磷酸酯酶处理的pEKEx3载体部分相连，转化E. coli DH10B，在含100 μ g/ml大观霉素 筛选之下，获得重组克隆PLS3005。
[0045] 重组酶基因片段reda和red0的克隆。设计引物R1409 :5' -GAAGAGCTCCCATGGA TGAGTACTGCACTCGCAAC-3'，（SEQ ID NO. 3)，酶切位点 SacII 和 NcoI 以下划线表示；R1410 : 5'-GGG TCTAGAGTCATCGCCATTGCTCCCCAAATAC-3'，(SEQ ID NO. 4)，酶切位点 XbaI 以下划线 表示。以λ噬菌体DNA(来自上海生工公司）为模板，以R1409和R1410PCR扩增得到I. 5kb 的reda和red|3片段，以SacI和XbaI酶切后，克隆至以相同酶切的载体pBluescript II KS(-)获得重组克隆pLS3014。
[0046] SacI 和 XbaI 酶切 pLS3014 中的 I. 5kb red α 和 red β 片段、XbaI 和 BamHI 酶切 pKsacB 中的 I. 9kb sacB 片段，SacI 和 BamHI 酶切的 pBluescript II KS(-)得到 2. 9kb 片 段，三片段连接后获得重组克隆PLS3016。NcoI和BamHI酶切分离pLS3016中的3. 3kb片 段和以NcoI和BamHI酶切的8. 3kb的pLS3005载体部分连接，在100 μ g/ml大观霉素抗性 筛选之下，提取质粒酶切验证而获得最终的重组酶表达载体PLS3023。
[0047] 实施例2.谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组上crtI2基因的敲除
[0048] 1.谷氨酸棒杆菌ATCC 13032电转化感受态细胞的制备和pLS2406的转化
[0049] 谷氨酸棒杆菌ATCC 13032自-80 °C冻存管划线至BHIS固体培养基，30°C培养 24h。单菌落转接至3ml BHIS液体培养基，于30°C，220rpm振荡培养约24h后，2ml转接 100ml BHIS，调节0D600约为?0. 1，继续培养至0D600约为0. 6时，离心，弃上清。菌体沉 淀以冰上预冷的10%甘油轻轻洗涤三次，最终悬浮于200 μ 1冰冷10%甘油中，每50 μ 1 分装至一个Eppendorf管。将IOOng的pLS2303质粒DNA加至感受态细胞中，轻弹混勾， 转移至冰上冷却的2mm电转杯，以2. 5kV电击转化，电转化仪为美国Bio-Rad公司的Gene Pulser11。电转化后，立解加入Iml的SOC悬浮，混匀后转至4ml预热至46°C的BHIS培养 基（置于15m试管中），46°C，水浴处理6min。随后铺布于含100 μ g/ml大观霉素的BHIS 固体培养基，30 °C培养48h获得转化克隆。
[0050] BHIS培养基的配制:脑心浸出液固体粉末52. 0g，91g山梨醇，加至IL去离 子水后溶解，以IN NaOH调节至pH 7. 2。115°C灭菌20min。固体培养基需加入1. 5% (质 量体积比）的琼脂。用于质粒消除时的固体培养基不加 NaCl。
[0051] 2.诱导重组酶表达的13032/pLS2303的电转化感受态细胞的制备和DNA转化
[0052] 含PLS2303的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的固体平板和液体培养均加入100 μ g/ml 大观霉素。同上扩大培养至0D600约为0. 2时，加入0. 5mM的IPTG，继续震荡培养至0D600 为0. 6时，离心，弃上清，后续的菌体洗涤以及电转化同上。
[0053] 3.crtI2 基因敲除
[0054] 基因敲除的策略如图1所示。根据谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基因组（GenBank登 陆号：NC_006958)上crtI2基因的序列和卡那霉素抗性基因的序列设计三对引物R1411 : 5'-CAAATAGGACCATGGCTATTGC-3'，（SEQ ID NO. 5)，R1412 :5'-ATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTT AAATTTTGATCCCTATCAT