专利名称：一株γ-聚谷氨酸产生菌及利用其制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法
技术领域：
本发明属于微生物和发酵技术领域，具体涉及一种Y-聚谷氨酸的合成菌株以及 利用其制备低分子量且窄分子量分布的Y-聚谷氨酸及其盐的方法。
背景技术：
Y-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，以下简称γ-PGA)是由D-谷氨酸和L-谷 氨酸单体通过Y-酰胺键连接而成的一类均聚氨基酸，可由微生物发酵合成。由于Y-PGA 具有极佳的成膜性、成纤维性、可塑性、粘合性、保湿性、生物相容性和可降解性等优异的理 化和生物学特性，在工农业、食品与医药等领域极具应用潜力。目前文献报道的Y-PGA产生菌大多为Bacillus species (如炭疽芽孢杆菌，巨大 芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌等)，合成的Y -PGA分子量在10 IOOOKDa之间 (AshiuchiM,Misono H. Biopolymers [M]. Weinheim =Wiley-VCH, 2002, 7 123.)，且分子量分 布较宽，其多分散系数(Polydispersity 重均分子量Mw/数均分子量Mn)在1. 2 5. O之 间。高分子量的Y-PGA(IOOOKDa)作为增稠剂以及制备高吸水性树脂很有用，这类Y-PGA 合成菌文献报道较多；较低分子量的Y-PGA(IOOKDa)用于药物的控缓释载体更为有利，但 一直未能筛选到既能高效合成Y-PGA且又适合工业化生产的菌株，其制备只能采用物理 或化学降解的方法，工艺繁琐，成本较高；此外，分子量窄分布的Y-PGA更利于其精细化应 用。因此如何获得窄分子量分布和低分子量的Y-PGA值得深入开发研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株Y -聚谷氨酸产生菌，该菌株能够发酵合 成低分子量且窄分子量分布的Y-PGA。本发明还要解决的技术问题是提供利用上述Y-聚谷氨酸产生菌制备Y-聚谷氨 酸及其盐的方法。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下申请人:从苏南地区高盐、中性土壤中筛选得到一株Y-聚谷氨酸产生菌Y-PGA合 成菌株，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGS-l，该菌株已保藏于中国微 生物菌种保藏委员会普通微生物中心。保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏编号为=CGMCC No. 4034。保藏日期为2010 年7月23日。该菌株以下简称CGMCC No. 4034，其性状特征如下所述。(1)形态特征在蛋白胨琼脂培养基上营养细胞为0. 6 1. OX 1. 2 2. 5 μ m大小的杆菌，37°C 培养3 5天形成芽孢，芽孢大小0. 6 0. 9 X 1. 0 1. 5 μ m，为长圆形或圆柱形。⑵培养性质1)牛肉膏、葡萄糖、琼脂培养基平板培养30 40°C培养1天可大量生长，菌落呈黄白色，表面有褶皱，不透明，不反光，边缘形状不规则<
2)牛肉膏、葡萄糖、琼脂培养基斜面培养同1)。
3)牛肉膏、葡萄糖液体培养在液体表面可形成菌膜，培养液略显浑浊t
4)牛肉膏、葡萄糖穿刺培养菌体在表面生长，底部不生长。 ⑶生理生化性质如表1所示
表1 CGMCC No. 4034的生理生化性质
权利要求
一株γ 聚谷氨酸产生菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PGS 1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.4034，保藏日期为2010年7月23日。
2.利用权利要求1所述的Y-聚谷氨酸产生菌制备Y-聚谷氨酸及其盐的方法，其特 征在于该方法包括如下步骤(1)种子培养将经斜面活化的CGMCCNo. 4034菌株接种于含有碳源、氮源、谷氨酸或 谷氨酸盐、无机盐和水的无菌种子培养基中，摇床转速150 400r/min，30 37°C下培养 3 15h至对数生长期中期；(2)发酵培养将种子液接入含有碳源、氮源、谷氨酸或谷氨酸盐、无机盐和水的无菌 摇瓶发酵培养基中，接种量1 10 % (ν/ν)，摇瓶装液量20 200mL/500mL，摇床转速150 400r/min, 30 37°C下培养24 72小时；或者接入含碳源、氮源、谷氨酸或谷氨酸盐、无机 盐和水的无菌发酵培养基的发酵罐中，接种量1 10% (ν/ν)，通气量0. 5 3. Ovvm, 30 37°C下培养24 72小时；(3)Y -聚谷氨酸的提取与纯化①发酵醪液酸化调发酵醪液pH至2 4 ；②微滤除 菌采用微滤膜滤除菌体；③超滤浓缩加入5 20倍体积的蒸馏水稀释，采用超滤膜对稀 释去菌液进行浓缩，重复稀释浓缩步骤2 4次，直至浓缩液体积为原发酵液体积的20 50% ；④产物沉淀超滤浓缩液直接采用低级醇或丙酮进行沉淀，收集沉淀，真空干燥，最终 制得Y-聚谷氨酸成品；或将超滤浓缩液调PH5.0 7. 5，再采用低级醇或丙酮进行沉淀， 收集沉淀，真空干燥，最终制得Y-聚谷氨酸盐成品。
3.根据权利要求2所述的利用Y-聚谷氨酸产生菌制备Y-聚谷氨酸及其盐的方法， 其特征在于所制得的Y -聚谷氨酸分子量为300 400KDa，分子量分布的多分散系数为 1. 2 2. O0
4.根据权利要求2所述的利用Y-聚谷氨酸产生菌制备Y-聚谷氨酸及其盐的方法， 其特征在于种子培养基或发酵培养基中，碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、可溶性 淀粉、淀粉和糖蜜中的任意一种或几种任意比例的组合；氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母浸汁、 玉米浆、玉米粉、黄豆饼粉、尿素、NaN03、KN03、NH4Cl、(NH4)#04和(NH4)2CO3中的任意一种或 几种任意比例的组合；谷氨酸或谷氨酸盐采用添加味精、谷氨酸钠、谷氨酸发酵液、谷氨酸 结晶母液和麸酸等含谷氨酸物质中的任一方式；无机盐为NaCl，K2HPO4 ·3Η20，CaCl2和MgSO4 中的任意一种或几种的组合。
5.根据权利要求2或4所述的利用Y-聚谷氨酸产生菌制备Y-聚谷氨酸及其盐的方 法，其特征在于种子培养基包含如下浓度的组分碳源10 100g/L、氮源10 100g/L、谷 氨酸或谷氨酸盐10 100g/L、无机盐1 100g/L，其余为水，pH 6. 5 7. 5 ；发酵培养基包 含如下浓度的组分碳源10 100g/L、氮源10 100g/L、谷氨酸或谷氨酸盐10 150g/ L、无机盐1 150g/L，其余为水，pH 6. 5 7. 5。
6.根据权利要求2所述的利用Y-聚谷氨酸产生菌制备Y-聚谷氨酸及其盐的方法， 其特征在于步骤(3)中，所述的微滤膜孔径为0.22 0.65 μ m。
7.根据权利要求2所述的利用Y-聚谷氨酸产生菌制备Y-聚谷氨酸及其盐的方法， 其特征在于步骤(3)中，所述的超滤膜截留分子量为10 lOOKDa。
8.根据权利要求2所述的利用Y-聚谷氨酸产生菌制备Y-聚谷氨酸及其盐的方法，其特征在于步骤(3)中，所述的低级醇为甲醇或乙醇。
9.根据权利要求2所述的利用Y-聚谷氨酸产生菌制备Y-聚谷氨酸及其盐的方法， 其特征在于步骤(3)中，发酵醪液酸化所用酸为硫酸、盐酸、三氯乙酸、乙酸或甲酸；调节最 终超滤浓缩液的PH所用碱为NaOH、KOH或Ca (OH)20
全文摘要
本发明公开了了一株γ-聚谷氨酸产生菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PGS-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.4034，保藏日期为2010年7月23日。本发明还公开了利用上述γ-聚谷氨酸产生菌制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法。与现有技术相比，本发明的γ-聚谷氨酸产生菌合成的γ-聚谷氨酸分子量较低(300～400KDa)，分子量分布较窄，可适用于低分子量要求的应用领域，因此极具开发应用前景。
文档编号C12N1/20GK101948785SQ20101027119
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者姚俊, 孙荣斌, 曹新, 阮文辉, 魏钦俊, 鲁雅洁 申请人:南京医科大学