一种人免疫活性细胞dc-cik细胞制剂及其有效制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人免疫活性细胞DC-CIK细胞制剂及其有效制备方法。
【背景技术】
[0002]近年来，随着生物技术的发展，研宄发现非特异性免疫细胞可以杀伤癌细胞的干细胞，防止癌细胞的复发和转移(R.Tallerico et al，The Journal of Immunology，2013，190(5):2381-90) ?目前应用最多的非特异性免疫细胞治疗方法是CIK细胞、DC-CIK细胞治疗。
[0003]树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前研宄发现的人体内功能最强的专职抗原提呈细胞(antigen presenting, APC)它能识别抗原，激活获得性免疫系统；而细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-1nduced killers, CIK细胞)是一种增殖能力强，非特异性杀伤癌细胞的免疫细胞。
[0004]DC细胞就像“雷达”，能识别抗原，激活免疫应答；CIK细胞就像“导弹”，能通过发挥自身细胞毒性，分泌细胞因子，精确杀伤肿瘤细胞。“雷达+导弹”产生了一个高效和谐的免疫系统。临床证明，DC-CIK细胞疗法能克服手术、放疗、化疗三大传统治疗方式的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端，部分患者可提高三到五年生存率，是国际公认的有望消灭癌细胞的肿瘤治疗新技术。
[0005]研宄证明DC细胞与CIK细胞共培养后产生的细胞比同源CIK细胞具有更强的增殖活性，DC细胞能促进CIK细胞的增殖，提高CIK细胞的抗癌细胞活性，同时DC-CIK细胞共培养时上清液也能促进DC细胞的成熟(Marten，A et al J Immunother，2001，24(6):502-510)。
[0006]DC-CIK细胞的常规培养方法都是先从人外周血单个核细胞(PBMC)中分离出贴壁的单核细胞和悬浮的淋巴细胞后再分别诱导，等到单核细胞诱导出成熟的DC细胞后再与悬浮的淋巴细胞共同培养，该方法操作繁琐，容易造成污染，增殖速度慢，需要培养20天以上。近年来有人对DC-CIK细胞的培养方法进行了改进，直接在单个核细胞的培养基中加入细胞因子和刺激因子，简化了操作步骤，培养时间也有所缩短，但仍需15?17天，且所得的DC-CIK细胞对癌细胞的杀伤活性不够强，只能达到32.9%。根据以往的研宄报道可知，在免疫细胞培养过程中，细胞因子的添加种类、添加顺序、添加量是影响免疫细胞增殖速度和杀伤活性的主要因素，因此可以通过优化DC-CIK细胞培养方案来达到提高DC-CIK细胞的增殖速度和杀伤活性。由于DC-CIK细胞的常规培养方法培养时间长且培养所得的DC-CIK细胞杀伤活性低，这些缺陷阻碍了 DC-CIK细胞在临床上的推广应用。因此缩短DC-CIK细胞的培养时间与提高DC-CIK细胞的杀伤活性是当前需要解决的问题。
【发明内容】
[0007]为了解决现有技术存在的问题和缺陷，即DC-CIK细胞增殖速度慢和对癌细胞的杀伤活性低，本发明通过优化培养方案来达到提高DC-CIK细胞的增殖速度和对癌细胞的杀伤活性，目的是提供一种人免疫活性细胞DC-CIK细胞制剂及其有效制备方法。
[0008]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
一种人免疫活性细胞DC-CIK细胞制剂的有效制备方法，具体包括以下步骤:
(O从人外周血中分离单个核细胞；
(2)将单个核细胞接种到无血清培养基中，加入IFNγ, GM-CSF, IL-4，培养I天；
(3)加入IL-2、IL-15、抗CD3单抗培养2天；
(4)加入TNFα，继续培养I天促进DC细胞的成熟；
(5)加入IL-2和IL-15继续增养8天，即得DC-CIK细胞；
(6)离心收集(I?5)X 19细胞，用0.9%生理盐水洗涤2次，离心后弃上清，将细胞移至10ml输液瓶中，并添加5ml 20%人血清白蛋白和10ml 0.9%的生理盐水，制作成细胞悬液，即一种人免疫活性细胞DC-CIK细胞制剂。
[0009]进一步的，所述步骤(I)中的单个核细胞是采用人淋巴细胞分离液密度梯度离心的方法制备。
[0010]进一步的，所述步骤(2)中的单个核细胞的细胞浓度调整为2xl06/ml。
[0011]进一步的，所述步骤(2)中的无血清培养基由AM-V、LonzaX-VIV015和RPMI 1640培养基以1:1:1的比例配制而成。
[0012]进一步的，所述步骤(2)中的IFNy的浓度为500?1000U/ml、GM-CSF的浓度为800U/ml、IL-4 的浓度为 500 ?1000U/ml。
[0013]进一步的，所述步骤(3)中的IL-2的浓度为100?500U/ml、IL_15的浓度为10?20ng/ml、抗CD3单抗的浓度为10?50ng/ml。
[0014]进一步的，所述步骤(4)中的TNFa的浓度为500?1000U/ml。
[0015]进一步的，所述步骤(5)中的IL-2的浓度为500?1000U/ml、IL-15的浓度为10?20ng/ml。
[0016]本发明的优点在于:
(I)本发明是优化了的DC-CIK细胞培养方案，不仅缩短了细胞培养时间，将培养时间从15天缩短到12天，且有效地提高了 DC-CIK细胞的增殖速度和对癌细胞的杀伤活性，采用本发明的培养方案培养12天所得细胞增殖数量与采用常规培养方案培养15天所得细胞增殖数量相比无明显差异，且对癌细胞的杀伤活性从32.9%提高到41.3%。
[0017](2)本发明的DC-CIK细胞联合使用，充分发挥了 DC细胞与CIK细胞的优势，不仅能精确杀伤肿瘤细胞，而且能增强肿瘤患者特异性抗肿瘤免疫应答，有效清除体内残留病灶。
[0018](3)本发明的DC-CIK细胞共培养时DC细胞能促进CIK细胞的增殖，提高CIK细胞的抗癌细胞活性，同时上清液也能促进DC细胞的成熟，且将DC-CIK细胞同时培养可以避免常规培养方法的操作繁琐，操作过程中容易造成污染等缺点。
【附图说明】
[0019]此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中: 图1是DC-CIK细胞培养增殖倍数折线图，横坐标表示细胞培养天数，纵坐标表示细胞的增殖倍数，实施例1.1为本发明的培养方案，实施例1.2为对照组；
图2是DC-CIK细胞表型分析柱状图，横坐标表示的是ra3+ra56+和nkg2d，纵坐标表示这三种表型的表达水平，实施例1.1为本发明的培养方案，实施例1.2为对照组；
图3是DC-CIK细胞对癌细胞的杀伤活性柱状图，两个柱状图分别对应的实施例1.1和实施例1.2，纵坐标表示DC-CIK细胞对乳腺癌细胞系ZR-75-1的杀伤率，实施例1.1为本发明的培养方案，实施例1.2为对照组。
【具体实施方式】
[0020]以下通过具体实施，对本发明做进一步具体说明:
实施例1 DC-CIK细胞的制备
1.1通过本发明优化后的DC-CIK细胞的制备(实验组)
具体制备步骤如下:采集患者外周血，经人淋巴细胞分离液密度梯度离心分离出单个核细胞。将单个核细胞接种到无血清培养基中，调整细胞浓度为2xl06/ml，添加IFN-γ (2000U/ml)、IL-4 (500U/ml)、GM-CSF(800U/ml)在 37°C 5%C02条件下培养，I 天后加入