专利名称：用于疫苗的免疫增强配方的制作方法
技术分支本发明涉及医药领域，具体地涉及使针对疫苗抗原的免疫应答的量和质增加的免疫增强配方的开发。
本发明的技术目标是能提高和/或调节机体针对疫苗抗原的应答水平的配方的开发。
以往技术佐剂是可提高或优化对通过粘膜或系统途径接种的抗原的免疫应答的物质。佐剂或它们的配方与抗原结合产生或强化所希望得到的应答的类型，减少接种次数以及减少所需获得的抗原的量并维持保护(McElrath，M.C.1995 Seminars in Cancer Biology 6375-385)。
佐剂通过由针对纯的可溶的重组和合成抗原的生产的现代生物技术的进展而产生的需要得到发展。一般而言，这些抗原是安全的，但与原先的有机体相比具有减弱的致免疫性。佐剂或它们的配方的一个重要功能是以安全的方式提高抗原针对免疫系统的复杂性，从而增强其致免疫性(Alving，R.C.1992 AIDS Res.Hum.Retroviruses 8(8)1427-1430)。
目前，如同传递抗原和药物的新方法的发展一样，对新的佐剂和免疫刺激剂的探寻也是世界上制药领域特别是疫苗的研究中的基本路线之一。用于粘膜的佐剂的发展是疫苗领域目前的需要(来自专家组报告VI在粘膜免疫学领域的共同努力1996疫苗14644-664)。
考虑到佐剂在接受和处理抗原的两条接种路线中的生理特性，产生辅助作用的不同步骤，它可分为粘膜和系统佐剂。根据抗原的特性，粘膜途径需要与传递抗原到M细胞的特异性配体的结合或包被步骤。粘膜抗原的佐剂活性是通过帮助抗原穿越由此路线所施加的障碍的策略获得的。抗原的物理特性可有助于其吞噬作用。一旦抗原得到同化，佐剂可通过任一已知的机制影响应答抗原的吸收，降解效应，细胞因子诱导，组成成分的活化，免疫系统中不同细胞群体的募集补充，抗原到不同抗原表现细胞的传递，通过组I或组II的表达的调节和不同亚型抗体的产生的刺激(McElrath M.C.1995 Seminars in Cancer Biology 6375-385)。
一些免疫刺激剂如已知的胞壁酰二肽(MDP)、单磷酰一脂A(MPL)、lipoid amine Avridine和那些所知的霍乱(CT)和大肠杆菌(HLT)毒素，认为是经粘膜途径处理的抗原的佐剂(Walker，R.I.1994疫苗12(5)387-400)。
在用于治疗和预防的脂质体配方中已经研究了MDP和MPL，但是，毒素和它们的亚单位(特别是CT和CTE)是最普遍的粘膜佐剂。
CT作为口服佐剂的能力已由大量的研究人员证实(McGhee，J.R.等，1992疫苗10(2)75-88)。霍乱毒素并不符合经典的佐剂的定义，这是因为它刺激抵抗自身的免疫应答并且它的佐剂活性依赖于其致免疫性(Elson，C.O.1987 Fed.Proc.461778)。CT和HLT的免疫调节效应说明了它们强大的佐剂活性，包括由多种类型B细胞产生的抗原表现的增加，B细胞向同型IgA分化的增加，与T细胞的相互作用及细胞因子的产生(Lintermans，P.1995 Advanced Drug Delivery Reviews 1873-89)。
从实际的观点出发，全毒素在人体的应用由于其毒性是不可能的。更好的策略是通过分离CT的A亚单位或通过编码它的基因的突变使其去毒。CT象CTB(无有毒的亚单位)一样，可通过与M细胞的特异性相互作用增强一些共价偶联的抗原的免疫应答(Holmgren，J.等，1993疫苗111179-1184)。
抗原传递系统已达到充分高的发展水平对免疫作用产生影响。可以预计肠道或非肠道服用的固体颗粒系统会是首先批准使用的产品之一(LiWan Po等，1995 Advanced Drug Delivery Reviews 18101-109)。
通过抗原传递系统在可溶性抗原的颗粒化中提供的可能性，以及利用粘膜途径的生理学特性，这些系统已经过测试并已表现出佐剂活性。在文献中它们分为a)合成的/非活化的和b)活的(专家讨论小组报告VII疫苗传递系统1996疫苗14644-664)。
对于第一组，合成的聚合颗粒已经过研究并包括不同的结果乳酸和乙醇酸异聚微球体，以及另一种聚合物如polyphosphacenes、乙酸纤维素聚合物、亚氨基碳酸盐、乙烯基乙酸盐聚合物、类蛋白微球体、葡聚糖酐和小球体；从天然材料产生的颗粒藻酸盐、明胶剂和植物种子以及脂质体和它们的变种蛋白脂质体、病毒体和ISCOMs(Li Wan Po等，1995Advanced Drug Delivery Reviews 18101-109)。
颗粒的大小是对于抗原传递的一组重要因素之一。在粘膜免疫作用路线中已报道直径大于10μm的颗粒不被吸收(Eldridge J.H.1990 J.Control.Release 11205-214)。在大鼠的实验中观察到口服药之后，只有5μm的颗粒可深层进入到派尔斑，那些直径1μm的颗粒可进入到淋巴结和肝脏并进入血流(Jani，P.等，1990 J.Pharm.Pharmacol.42821-826)(Alpar H.O.等，1989 J.Pharm.Pharmacol 41194-196)。
这些结果在人体中的推断还没有确定，并且尽管已证实植物种子中直径大至2mm的白喉类毒素的吸收使免疫应答增强，但有时胃肠道的吸收对佐剂的活性并不是必需的(Mirchamske，H.等，1994疫苗121156-1172)。
通过口、直肠或阴道路线控制的释放系统的最适大小的确定正在研究之中(Li Wan Po等，1995 Advanced Drug Delivery Reviews 18101-109)。
影响颗粒的另一个因素是疏水-亲水平衡，它可能经修饰以获得免疫应答的调节(Jani，P.等，1990 J.Pharm Pharmacol.42821-826)。
最近，描述于1975年的蛋白cocleates疫苗的应用已获得专利(Papahadjopoulos D.等，1975 Biocem.Biophys.Acta 394483)。Cocleates是脂质体和二价阳离子(主要是钙)的复合物，它通过钙-fosfolipid相互作用，能使脂质体形成环绕自身的结构，使免疫作用通过不同路线完成(Gould Foguerite，S.WO 95/09648)。以这种结构，象细胞介导的应答一样，抗体的免疫应答得到刺激(Gould Foguerite，S.1994 AIDS Res.Hum.Retroviruses 10(Supl.2)S99-S103)。
抗原通过淋巴滤泡、M细胞(微褶)相关的表皮的特化细胞的吸收和经过是由简单肠表皮产生的免疫应答的关键步骤，这已被所有作者普遍接受。通过此过程抗原传递到M细胞的基袋，形成抗原(实际未降解)与B和T细胞及巨噬细胞的第一次接触。袋的主要功能是给有机体提供一个保护其免受外部体液因子调节剂影响的环境(Neutra，R.M.1996免疫学年鉴14275-300)。
在呼吸道，表皮从假复层的变为单层的。在支气管，单层上皮区的细胞间隙由紧密连接封闭，抗原进入的主要机制是通过M细胞。在扁桃体，最主要的上皮是复层上皮。这里，抗原吸收的机制与巨噬细胞和多至每平方毫米700个、来自骨髓的游走树状细胞形成的网络密切相关。这些细胞能够迁移至与粘液(O-MALT)相关的有机化淋巴组织或迁移到淋巴结，呈递在扁桃体表面被吞噬经处理的抗原。在一般条件下，这构成了通过呼吸道MHC组II进行抗原呈递的主要机制(Neutra，R.M.1996免疫学年鉴14275-300)。
抗原在口腔粘膜和鼻咽水平吸收的不同使我们了解到为什么佐剂通过两种路线的接种并不必然产生相同的结果。因此，佐剂通过口腔路线有效时在鼻-咽路线有效或无效都是不明显的。因为不同的粘性表面有不同的微环境，所以佐剂在不同的粘性位点可能有不同的效应。粘液和佐剂的作用模式的生理学研究进展将可能有助于更多有效的粘膜疫苗的发展，就象抗原的特性如大小、粘膜配体的存在、电荷、亲脂性和T依赖性可能也会影响免疫应答一样(专家组报告VI粘膜免疫学领域的共同努力1996疫苗14644-664)。
同时，有机体内的其它成分如月经周期中的激素波动，会影响抗原在阴道的吸收。这个事实显示了树状和表皮细胞间较强的协同作用并解释了疫苗通过阴道路线时有效性的变化(Parr，E.L.，Parr，M.B.1992疫苗研究1221-25)。
对于肠道单层上皮的情况，非活疫苗到M细胞的传递是困难的，说明未保护的大分子易于由胃肠道的分泌作用和游动性消化或拖走。有关于M细胞顶膜的可能作为受体的成分所知甚少。脂质体和微粒子可能通过疏水相互作用粘附到粘性表面，但是由于抗原很快陷入到粘性胶中并且有许多抗原未能到达粘液，因此抗原进入M细胞是低效的。结合或包被了配体的大分子或颗粒如CTB，具有有限的进入受体的因素(Neitra，R.M.1996细胞86345-348)。
在最近的小鼠实验中，包被CTB的28.8nm的coloidal金颗粒的使用表明它们能在与粘性滤泡相关的M细胞的表皮选择性地粘附并穿过，不能穿过所谓“刷状缘”的肠细胞。大一些的颗粒；约1.13μm；也包被有CTB，不能粘附在M细胞上，而约6.4nm的CTB-FITC颗粒可以粘附并进入两种类型的细胞。本实验证明了glycochalix在抗原粘附和进入M细胞中的作用。霍乱毒素的B亚单位在肠细胞和M细胞上都有受体。用配体结合到颗粒可导致对M细胞的特异性粘附，但仅在由glycochalice限定的大小范围内。1μm或更大的颗粒，需要特异性导向M细胞成分的配体。这些成分的鉴定仍在研究之中(Frei，A.等，1996实验医学杂志1841045-1059)。
一组病原细菌能超越非-活系统的困难由缺乏受体的M细胞有效吸收。这些细菌利用此机制感染粘性组织并在由免疫系统扣留之前系统性地传播自己。粘附到M细胞表面的细菌病原体开始在表皮水平发生信号传导事件以提高它们的进入。所知最清楚的是减毒菌株S.Typhty21a，与M细胞细胞膜上的多糖类受体发生凝集素型相互作用。用于口服免疫的减毒活菌株V.Choelea和脊髓灰质炎病毒也是安全和有效的。这些微生物的遗传控制菌株首次作为异种抗原的载体用于人体(Mekalanos，J.J.1992 Adv.Exper.Med.Biol.New York Plenum Press43-50)。
这些活载体的生物学引入了新的挑战。V.cholerae疫苗菌株没有编码毒素的基因，仍可引起腹泻，这也许是因为表皮细胞释放细胞因子作为对细菌粘附的应答(Mekalanos.J.J.1992 Adv.Exper.Med.Biol.NewYork Plenum Press43-50)。使用遗传控制的菌株S.Typhi和S.Typhimurium的主要挑战在于充分减毒的获得提供了安全性，但它们仍粘附于M细胞并在粘液中繁殖，保持了它们的免疫性。减毒菌株Shigella也由M细胞内化，但它们失去了从细胞到细胞的传播能力。这个现象是减毒作用的基础，但仍有局部细胞因子和趋化因子的释放可导致表皮屏障正常功能的破裂(Sansonetti，P.J.1991 Rev.Infect.Dis.13285-292)。
本研究中也发现了病毒。脊髓灰质炎病毒类型1和Sabin的减毒菌株通过运输穿过M细胞以穿越表皮屏障的事实，使它们成为人体内传递外界抗原的口服疫苗的重要候选者。牛痘和其它痘病毒由粘液表面吸收，但它们与M细胞的相互作用仍然未知(专家组报告VI粘膜免疫学领域的共同努力1996疫苗14644-664)。
许多天然来源的碳水化合物复合物刺激细胞的免疫系统和网状内皮系统(Davis，S.E.1975 Am.Chem.Soc.Sympos.Series 15，Jeanes A.HodgeJ.编辑，Am.Chem.Soc.Washington D.C.)。这些复合物中有植物和真菌的聚合物如葡聚糖、右旋糖酐和蘑菇多糖，所有这些都是葡萄糖的聚合物，以及甘露聚糖，其中发现有葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖。还发现有果聚糖和木聚糖(Tizard，I.R.等，1989 Mol.Biother 1290-296)。许多这些多聚糖在巨噬细胞(有葡聚糖和甘露聚糖的受体)上的活性包括吞噬作用的诱导和细胞因子、白细胞三烯及前列腺素的分泌。蘑菇多糖，一种在蘑菇中普遍存在的葡聚糖，在绵羊eythrocytes中刺激细胞和抗体应答，而果聚糖对B细胞是mytogenic并且是巨噬细胞的活化剂(Simon，P.M.1994 Exp.Opin.Invest.Drugs 3(3)223-239)。
乙酰甘露聚糖(acemannan)是由甘露糖组成的甘露聚糖，在每10个残基中的大约有8个带有O乙酰化。它作为主要成分从历史上一直使用的药用植物loe barbadensis Miller的叶的粘性物质或胶体中提取。体外的不同实验显示出甘露聚糖可活化单核细胞和巨噬细胞诱导γ干扰素、肿瘤坏死因子-C，单核细胞和粒细胞的集落刺激因子、IL-1β和IL-6的产生(Peng，S.Y.等，1991 Mol.Biother.379-87)。乙酰甘露聚糖可增强细胞毒T淋巴细胞(CTL)的产生(Womble，D.等，1988 Int.J.Immuno-pharmacol.10967-974)、自然杀伤(NK)细胞的细胞毒活性(Marshall G.D.等，1993免疫学杂志(part II)150Abstr 1831)，并略可增强体外人alloresponse。
细胞毒活性的增强和γ干扰素的分泌有利于乙酰甘露聚糖的抗病毒和抗肿瘤应用。它的抗逆转录活性已在动物的猫白血病中得到证实(Sheets，M.A.等，1991 Mol.Biother.341-45)。艾滋病和癌症病人的临床分析正在进行之中。
涉及乙酰甘露聚糖作为疫苗佐剂的使用已申请了专利(McAnalley，B.H.EP0619114 A2，Nordgrem，R.M.WO 93/14195)，但在这两个专利中乙酰甘露聚糖的鼻-咽使用都未得到保护。在两个专利中抗原通过系统途径接种(皮下的和肌内的)。涉及粘膜途径时，第一个专利显示出乙酰甘露聚糖配方在口服使用中效果不佳。第二个专利将用法扩大到眼药水。乙酰甘露聚糖口服配方中获得的结果(在第一个专利中显示)与通过系统接种路线获得的结果相比似乎更不好。如前所述，佐剂在不同的粘性位点由于抗原吸收的生理学和每条路线中不同的环境可能会有不同的效应，这可能会影响免疫增强剂的活性(专家组报告VI粘膜免疫学领域的共同努力1996疫苗14644-664)。
除了粘膜途径中的不同，当同样的佐剂用于系统性的或粘性时也会得到不同的结果。系统佐剂最普遍使用的是氢氧化铝。这个佐剂当小鼠通过口服和鼻腔路线接种抗原时并不比PBS更为有效，这是因为它是用于系统途径的传统佐剂-如破伤风类毒素-(Alpar H.O.等，1992 Int.J.ofPharm.88335-344)。所以，系统佐剂也必然是粘膜佐剂是不明显的。
发明详述本发明中我们首次报道经鼻咽给药的疫苗配方，有乙型肝炎病毒抗原(HbsAg)作为其主要成分，并有占足够比例的乙酰甘露聚糖。
此配方由于经粘膜处理而具备的特性是新的配方，这些特性是产生相似强度的系统免疫和相同的抗原剂量下与传统的用氢氧化铝作为佐剂的疫苗配方相比更高的质量。并且，在粘膜产生较强的应答，这是通过HbsAg的系统接种所不能获得的。
我们还证明了系统使用HBsAg和乙酰甘露聚糖的配方，免疫应答与氢氧化铝作为佐剂的传统疫苗配方相比在量和质上都显著增强。
这是首次报道使用HBsAg与非特异性免疫活化剂多糖相结合通过鼻咽途径作为抗原传递系统。此系统中成比例增加的应答的获得是由于其表面的抗原决定基与用其它佐剂获得的比例有关。此发现使混合疫苗的配方使用HbsAg通过粘膜作为抗原传递系统。它也支持了可溶性抗原-颗粒化抗原结合的此策略的用途及其与具有这些特性的多糖一起通过粘膜接种路线的应用。这里，可归纳出颗粒抗原传递系统的液体配方与乙酰甘露聚糖一起通过鼻咽途径接种可更优选地增强涉及可溶性抗原的免疫应答直至超越了与其它佐剂通过系统途径所获得的血清学应答水平。小鼠Balb/C中应答质量的增强提高了IgG2亚类抗体的水平已得到证明。此方面构成涉及氢氧化铝的质上的优势，能在需要诱导Th1应答时设计抗肿瘤和抗微生物的疫苗。最近发现由Th2细胞产生的细胞因子与粘膜免疫相关以及粘膜淋巴结中的T细胞更易于产生Th2型细胞因子(Meeusen，E.N.T.1996免疫学现状17(9)421-424)，这确定了本发现的价值。
本发明中抗原-乙酰甘露聚糖混合配方的免疫调节剂活性也得到描述。我们首次报道了涉及其它常用佐剂，对于颗粒的和可溶性抗原通过鼻咽和系统途径的Th1应答的特异性增强剂活性。对于后者，体液应答与用氢氧化铝获得的强度相似，但在质上是不同的，因此报道了免疫调节剂的效应。这些结果支持了在针对由细胞内病原和癌症引起的疾病的免疫预防和免疫治疗的疫苗配方中引入该成分。
目前乙酰甘露聚糖和其它免疫刺激剂多耱的作用机制还不完全清楚。一个已提出的机制涉及巨噬细胞和树状细胞，它们有针对一般在病原体表面存在的抗原的特异性受体以区分哪些是危险的哪些不是。根据此机制，在系统接种的位点有强大的monocytemia。根据复层上皮组织的吸收机制，在鼻咽水平和在更特异性的瓦尔代尔环的抗原吸收，能通过发现于此区域的巨噬细胞和树状细胞的活化和将更多数量的免疫感受态细胞吸引至此区域而得到增强。
芦荟植物胶片干重的重要比例由草酸钙晶体构成(Carpenter，H.R.P.N.5118673)。这些晶体由于主要存在于常见病肾结石而已成为最近的研究对象(Lieske，J.C.et.al.1994美国国家科学院院报19；91(15)6987-91)。自从1993年，已经描述了一些特定的大分子可能由晶体吸收(Stapleton，A.M.et.al.1993 Kidney Int.44(4)817-24)。更近一些时候，又发现了其它蛋白肾钙质、Tamm-Horsfall蛋白、尿桥蛋白和Renal Lytostatin蛋白(Berland，Y.等，1993 Nephrologie 14(4)183-7)。
我们小组所做的实验证明草酸钙晶体对HbsAg的吸收就象DNA与盐的共沉淀一样，可由于盐的特性和发生于富含多糖的介质如乙酰甘露聚糖的晶体凝集作用的抑制过程获得更小的颗粒。
对于系统接种的HbsAg，芦荟胶成分的结合也可产生比使用分开的成分更好的结果。
抗原的颗粒化，通过胶体盐如与颗粒抗原的偶联或它们的包含或与抗原偶联的传递系统，构成了本发明中抗原加工的第一步，第二步是活化免疫系统的多糖的添加。
乙酰甘露聚糖的粘稠度使其成为增加抗原颗粒停留在接种部位时间的活化载体。其它活动如细胞因子的诱导、M细胞吸收抗原的机制的活化、来自免疫系统的不同群体细胞的募集和抗原呈递活性的增强，也并未丢失。
本发明所提供的配方，根据免疫物的大小，是接种物能覆盖鼻咽区上至声门的剂量。根据其申请该剂量可分为两部分或者接种一次。保证优化的免疫应答和同时足够的粘稠度使抗原滞留于粘液的多糖浓度范围是1mg/mL到12mg/mL。对抗原的需要是其颗粒化特性，这是因为已证实这个鼻配方与相同的可溶性抗原并不同样有效，或者没有粘液中特异性发现的配体效应。所以，特定类型抗原产生的正结果并不能保证另一类型抗原的好结果，这是因为抗原颗粒化或具有表皮细胞的配体活性构成了抗原的强烈需要的特性，是通过所提供的颗粒化的方法完成的。
作为本发明目标的配方使获得高水平的血清抗体和涉及免疫球蛋白同型和亚类的更完全的应答，比接种可溶性抗原或使用其它佐剂所获得的应答在量和质上都大。
通过粘膜处理这些配方在血清上获得的免疫应答与用传统佐剂通过系统接种得到的应答是相似的，但在粘膜水平更高。
涉及毒素类型和减毒微生物的佐剂的粘液的低反应原性，以及低消耗的独立的对于佐剂的T应答，及其对于Th1应答的调节剂活性，使得产生更高质量的应答。为获得抗原更强的致免疫性，接种次数以及每次接种的抗原量都可减少。
性能实施例实施例1乙酰甘露聚糖多糖从Aloe Barbadensis Miller叶的全水性提取物中获得。叶子从2到3年树龄的植物上采集并贮存于4℃的暗室中2至3天。然后去掉叶子的末端和边缘。叶子分割为较小的部分并不时加入最小量的无菌水使研磨过程易于进行。粘浆(或于叶子中发现的胶体)也用来获得乙酰甘露聚糖。
叶子或胶体研磨之后，于10,000rpm离心，去掉所有主要来自于叶的表皮和纤维组织的不溶性剩余物。冻干的上清命名为总提取物(Te)。Te经重悬以便于以后的慢速搅拌中的80％乙醇沉淀。沉淀温度是4℃。24小时后溶液在1000rpm离心20分钟并去掉上清。沉淀在无菌的蒸馏水中重悬并冻干。此产物称为乙醇沉淀物。
为获得高纯度的乙酰甘露聚糖，我们选择了在Sepharose CL-4B中进行分子排阻层析。磷酸盐缓冲液(PBS)或0.2M的NaCl用于该流程，同样也用于重悬样品。
图1显示了在Sepharose CL-4B中进行凝胶过滤之前在过滤凝胶柱TSK G6000PW中的高效液相层析的层析谱。在此层析谱中，分子量＝2000kDa的葡聚糖蓝(DB)的洗脱体积相应的点已标出，在末端是与总洗脱体积(TEV)相应的点。比DB分子量更高的第一个峰(M)对于Antrone比色法而言是正的(Trevelyan W.E.y Harrison J.S.1952生物化学杂志231824)。
通过红外分光镜分析两个峰显示出在层析的第一个峰(M)出现乙酰甘露聚糖的特征带。这些最大的，将近1250和1750cm-1，意味着适合于此多糖天然状态的乙酰化作用的存在。这些带并未在柱的相应于总洗脱体积(TEV)的峰中发现。实施例2为评价来自Aloe barbadensis Miller叶中的提取物对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的免疫增强剂活性，实行了在雄性6到8周龄Balb/c小鼠中进行腹膜内路线的免疫计划。以抗原吸收在氢氧化铝中的Heberbiovac-HB疫苗(在古巴，CIGB生产)作为参考对结果进行了比较。所使用的免疫计划在每一种情况中详细说明(图2a和2b)。
对HBsAg免疫应答的检测通过酶联免疫吸附总的抗HBsAg，建立了疫苗的质量对照。抗体滴度用国际单位每升表示。结果的统计学分析通过斯氏检验完成P＜0.05认为是有差异显著。
该计划中两组之间有显著差异。通过此实施例证明了一至两次腹膜内接种后可能显著增强涉及氢氧化铝的对HBsAg的免疫应答。实施例3为评价提取物中两种成分增强免疫应答的可能性，选择了乙酰甘露聚糖和草酸钙。氢氧化铝和Te用做对照。实验组的测试量和结果在图3的表中显示。
该致免疫性测试通过HBsAg吸附至草酸钙的实验来进行，并业已证明这是可能的。草酸钙的吸附(在芦荟的Te中以溶胶的形式存在)能在增强免疫应答的过程中与乙酰甘露聚糖产生协同效应。
血液提取在28天后通过眼眶后穿刺施行。结果的评估通过酶联免疫吸附抗总的HBsAg进行已在前面提及。
第六组包含乙酰甘露聚糖和草酸钙的结合，与其它组相比具有明显更高的抗体应答。
草酸钙和乙酰甘露聚糖之间的协同效应业已证明，它们可能经重组并超越了总提取物的免疫增强剂的活性。在此情况下显示出在草酸钙溶胶中HBsAg的颗粒化有利于此抗原向免疫系统的呈递。实施例4为确定乙酰甘露聚糖通过粘膜途径的免疫增强剂活性，致免疫性测试在7到10周龄Balb/c小鼠中用乙型肝炎病毒表面抗原模型(HBsAg)进行。接种50μl体积是通过鼻咽途径在经麻醉的小鼠中实施。提取是在计划开始28天后通过眼眶后穿刺进行。滴度测定是由抗-总的HBsAg的酶联免疫吸附进行。统计学分析通过斯氏检验完成P＜0.05认为是有差异显著。
测试了不同剂量水平的乙酰甘露聚糖，用PBS中的HBsAg作为对照。抗原只用一个水平5μg/一剂。结果在图4的表中显示。
加入乙酰甘露聚糖的组中的强烈的免疫增强剂活性得到证实。所有组都显著高于在PBS中的HBsAg对照。过度的增强产生了抑制效应(第5组)。这是由于最终粘稠度的增加。实施例5为比较乙酰甘露聚糖与其它参考的粘膜佐剂对HBsAg的免疫增强剂活性，实施了一个免疫计划以比较其与HBsAg和霍乱毒素(CT)的配方(图5a-d)。分析了一些抗原剂量并用氧化铝中HBsAg的系统接种作为对照。计划在分别接种0、14、28和56天的6-8周龄Balb/c雌性小鼠中进行。提取在26、42和70天进行。血清的评估由传统的酶联免疫吸附以检测特异性鼠的IgG抗体完成。血清在第二次、第三次和第四次接种的14天后进行分析。
此分析的另一个目的是比较本研究中各组的体液免疫应答的动力学。
第二次接种后的统计学分析并未证明氧化铝对照组(G4)和具有相同量抗原和乙酰甘露聚糖的鼻组(G1)间有明显差异。用CT作为佐剂通过鼻咽途径进行免疫的小鼠的组(G5)产生比用较低量抗原的组更高的抗体应答，并与用等量疫苗的组(G2)无明显差异(图5a)。
三次免疫之后，在用2μg进行鼻内和系统免疫的小鼠的组中(G1和G4)没有统计学上的显著差异。同样地，在用CT作为佐剂进行免疫的小鼠的组(G5)与分析中用等量配方、都用10μg浓度的HBsAg的组(G2)间也没有显著差异(图5b)。
考虑到从第二次接种到第三次接种滴度的强烈增加，我们进行了工作以证明是否这种增加与第三次接种一个月后进行的第四次接种后不同组的分析有相同的斜率。结果显示在图5c中。
用乙酰甘露聚糖作为佐剂在第四次接种后可能获得比用CT在血清中更高的应答，正如G2和G5的比较所证明的那样。
应答的动力学表现出一致性的增强，第三次和第三次接种后的应答超过了由CT产生的应答。通过鼻内接种每剂量2μg的抗原(G1)所产生的抗体水平显著高于由经氧化铝处理的等量抗原通过系统途径(G4)所获得的抗体水平。这是第一个证据说明可能以多糖为佐剂，通过鼻咽接种非活化的颗粒抗原获得在量和质上都超过用氧化铝的系统接种所产生的应答。并且，强烈的粘膜应答只可由鼻咽途径诱导的事实，使HBsAg在人体有效并潜在无毒的接种成为真正的可能。这是蛋白-脂质本质的颗粒抗原的特殊情况。为获得同样强度和更高质量的系统应答，其它抗原也可通过此路线使用。由此结果可归纳出由其它酵母衍生的颗粒化的一般与HBsAg大小相似的抗原也可用于鼻内路线产生好的结果。阴道中IgA的定量(第70天)如果考虑到性是乙型肝炎和其它疾病的传播途径之一，获得粘膜应答是非常重要的。为比较阴道的抗-HBsAg IgA应答，自第一次接种70天后阴道洗液由100 PBS处理并且抗-IgA抗体应答通过传统的酶联免疫吸附进行分析。结果由涉及阴道洗液的较高滴度作为正对照而定量，所以考虑使用相对单位(RU)(图5d)。
在小鼠的阴道粘膜中用氧化铝作为佐剂通过系统途径进行免疫(G4)未检测到抗-HBsAg IgA的应答。该结果支持了粘膜免疫的重要性以及特别是佐剂的效力能在第2组和第3组中产生更强的应答，即使应答在统计学上并不显著。用2μg抗原和多糖获得的抗体水平与用10μg抗原和CT获得的抗体水平在统计学上并无不同。实施例6为证明抗原传递到粘膜的可能性，用HBsAg通过化学偶联将可溶性抗原结合到由破伤风毒素通用Th抗原决定基(830-843)和人类免疫缺陷病毒gpl20 V3环的B肽构成的多抗原肽(MAP)Th-B。鼻内接种如前所述进行同时血液提取也在计划开始42天后通过眼眶后穿刺完成。滴度的测定通过B肽特异性抗IgG的酶联免疫吸附进行。滴度的测定涉及正对照所以考虑使用相对单位(RU)(图6)。
B组中没有血清转化现象。A组中有100％的血清转化，两个高应答者小鼠的存在影响其它两个发生血清转化但滴度较低的小鼠的图示可见性。
尽管在B组中更具代表性的MAP(40μg)可能与20μg HBsAg-MAP结合物的效应相同，但在B组中无血清反应。考虑用两倍于负对照的光密度的平均值作为血清转化标准(小鼠通过鼻咽途径用20μg HBsAg免疫)。该结果证明颗粒化比Th抗原决定基的存在在抗原的应答中起更重要的作用。
如接种路线的生理学所知，颗粒化是重要的，但其它已知的粘膜佐剂如CT会破坏此需要。所以我们可在文献中找到CT对于非颗粒化抗原的免疫增强活性的大量实例，它们之中是简单的肽。该效应不与多糖发生但有助于颗粒化。实施例7Opc蛋白的重组多肽是脑膜炎奈氏球菌的外膜蛋白之一，混合于脂质体中。它在小鼠中的应答通过鼻咽途径经与可溶性多肽产生的应答的比较进行评价。
脂质体中的免疫增强活性首次得到证实。两组10只Balb/c小鼠经免疫。A组用20μg脂质体胶囊蛋白免疫，B组用20μg同样的制剂加入终浓度6mg/mL的乙酰甘露聚糖进行免疫。体液应答在系统水平和肺清洗物中进行评价。
IgG水平通过酶联免疫吸附测量并用指定每一血清的任意单位的对数表示。B组显示出血清IgG的更高水平，差异在统计学上是显著的(图7a)。该实验显示出乙酰甘露聚糖对脂质体配方增强免疫应答的能力。
第二个实验是设计用来比较多糖在脂质体中的Opc蛋白(A)和在10mg/mL octyl-葡糖苷中复性的Opc蛋白(B)中的免疫增强效应。该去污剂的使用增强了4种特异性单克隆抗体对天然Opc蛋白的识别。这些抗体中的两个识别形态的抗原决定基而另两个抗体识别线状的抗原决定基。根据单克隆抗体的识别标准，octyl-葡糖苷复性的Opc蛋白表现出接近天然蛋白的形态。
两组10只Balb/c小鼠进行鼻内免疫。血清和肺清洗物中的抗体水平经定量并用指定每一样品的任意单位的对数表示(图7b)。
如在粘膜清洗物中一样，在血清中观察到脂质体与多糖的结合导致更高的免疫球蛋白滴度和更低的应答弥散。乙酰甘露聚糖当通过脂质体(颗粒抗原的传递系统)呈递给免疫系统时可显著增强对抗原的应答。实施例8为定量分析应答，IgG1、2a y 2b的水平用特异性抗IgG1、2a y 2b的结合物由传统的酶联免疫吸附定量。实验中用乙酰甘露聚糖作为佐剂通过IN路线(IN/芦荟)获得的应答与在多糖和草酸钙(IP/芦荟)中的通过腹膜内路线进行接种的抗原产生的应答进行比较，并以用氧化铝佐剂(IP/Alum)获得的应答作为对照(图8a)。
IgG2a抗体水平的增加与研究中的免疫刺激组相关，使得在需获得强烈细胞应答的预防和治疗疫苗的领域可应用该类型配方。
如以上所陈述的，可能通过IgG2a和IgG2b水平的增加获得对表面抗原的免疫应答水平的增强。
在获得受保护的免疫应答起决定作用的因素中包括那些不仅关于其强度也关于其质量，即作为免疫的结果所产生的应答的类型的因素。去年免疫学中最经常论述的题目之一是助手T淋巴细胞应答(Th1/Th2)的类型。许多作者已证明对细胞内病原体和病毒的有效应答是Th1型，它与细胞毒反应以及对于其它亚组而言IgG2亚组的增加有关。
为分析物理上不同的抗原是否存在相同的特性，用结合了人类免疫缺陷病毒(HIV)V3环区的多抗原决定基多肽(TAB9)实施了免疫计划。抗TAB9的免疫球蛋白通过传统的酶联免疫吸附定量以决定IgG亚组。10μg蛋白用不同的佐剂通过腹膜内路线接种(图8b)。
根据Th1/Th2平衡的置换所显示的结果证明了针对Th1的应答类型。用去乙酰甘露聚糖(de乙酰甘露聚糖)/草酸盐结合的IgG2b的水平高于用Quil A.产生的水平。该结果对于配方即如对于多糖是一部分新的知识，并使其不仅用于增强应答还用来调节对于Th1的应答，该应答是大量病原体和癌症的免疫需要。
附图描述图1.高效液相层析.AD葡聚糖蓝(2000kDa)，M样品，VET总洗脱体积.层析仪Bio CROM版本2.3(1994).检测仪Refractionindex(Knauer).胶TSK G6000PW(分离范围500-50000kDa).维7,5×600mm.流速0,5ml/分钟.缓冲液PBS.所用样品体积100μl.图2a.二次接种计划(0，14天)y提取a los 28天。图2b.一次接种计划并在28天提取。图3.腹膜内一次接种计划并在28天提取。图4.0，14计划并在28天提取。图5a.第二次接种后血清的评价。图5b.第三次接种后血清的评价。图5c.第四次接种后血清的评价。图5d.阴道洗液的评价(70天)图6.用0，14，28天免疫计划并在42天提取。A20μg HBsAg结合到AMAP+多糖(6mg/mL)，B40μg MAP+多糖(6mg/mL)。图7a.三次接种计划0，28，56天并在63天提取。图7b.三次接种计划0，28，56天并在63天提取。图8a.三次接种计划0，14，28天并在42天提取。每一变体中的血清经分组用于分析。样品的工作稀释度为1∶4000。图8b.三次接种计划0，14，28天并在42天提取。滴度的几何平均值在用多决定基的TAB9制剂与不同佐剂进行免疫后显示。
权利要求
1.用于鼻咽使用的疫苗配方，其特征在于它的基本成分之一是乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原。
2.用于粘膜使用的疫苗配方，其特征在于它的基本成分是a)其剂量在上至500μg蛋白的范围内变化的HBV表面抗原和b)剂量在0.01和10mg之间的乙酰甘露聚糖多糖免疫刺激剂，并且也包含防腐物质和稳定剂。
3.用于系统使用的疫苗配方，其特征在于它的基本成分是a)其剂量在5至500μg蛋白的范围内变化的HBV表面抗原和b)剂量在0.01和10mg之间的乙酰甘露聚糖多糖免疫刺激剂，并且也包含防腐溶液和稳定剂。
4.用于系统或粘膜使用的疫苗配方，其特征在于它的基本成分是a)剂量在上至500μg蛋白的范围内变化的HBV表面抗原，b)与HBV表面抗原偶联的抗原，c)剂量在0.01和10mg之间的乙酰甘露聚糖多糖免疫刺激剂，并且也包括防腐物质和稳定剂。
5.根据权利要求4所述的疫苗配方，其中偶联的抗原是具有任何性质的同源或异源抗原。
6.用于粘膜使用的疫苗配方，其特征在于抗原是剂量在上至500μg蛋白的范围内变化的脑膜炎奈氏球菌5C的外膜蛋白以及剂量在0.1和20mg之间的乙酰甘露聚糖多糖免疫刺激剂为特征。
7.用于系统使用的疫苗配方，其特征在于它的基本成分由a)剂量在上至500μg蛋白的范围内变化的可溶性多决定基多肽和b)剂量在0.01和10mg之间的乙酰甘露聚糖多糖免疫刺激剂构成，并且也包含防腐溶液和稳定剂。
8.用于系统或粘膜使用的疫苗配方，其特征在于它的主要成分由a)吸收或共沉淀抗原的颗粒抗原传递系统，b)目的疫苗的抗原，c)剂量在0.01和10mg之间的乙酰甘露聚糖多糖免疫刺激剂构成，并且也包含防腐剂和稳定剂。
9.根据权利要求8所述的配方，其特征在于它的目的疫苗的抗原可吸附、捕获、共价连接或静电吸附到该颗粒抗原的传递系统上。
10.根据权利要求8所述的配方，其特征在于进行颗粒化的抗原可以是病毒、细菌或单或多细胞寄生虫。
11.根据权利要求8所述的配方，其特征在于所述抗原是天然、重组或合成的，优选地具有蛋白、脂类、脂多糖或多糖性质。
12.一种配方，其特征在于免疫增强剂是具有免疫增强活性的Aloebarbadensis Miller植物的部分或总提取物。
13.根据权利要求1-12所述的配方，用于人或动物。
14.根据权利要求1-12所述的配方，作为预防疫苗用于免疫调节目的。
15.根据前述权利要求所述的配方，作为治疗疫苗用于免疫调节目的。
全文摘要
本发明涉及医药领域,具体地涉及含有疫苗抗原的新佐剂配方的用途。本发明所追求的技术目标精确地是能够增强和/或调节机体对血清和粘膜内层中疫苗抗原的免疫应答的配方的开发。为此目的,开发了包含乙型肝炎病毒表面抗原和足够比例的乙酸甘露聚糖为主要成分的配方。作为此结果的延伸,开发了其中a)使用HBsAg作为同源或异源抗原载体b)颗粒化抗原传递系统和c)以特定比例与乙酰甘露聚糖结合的可溶性抗原的配方。本发明的配方可应用于医药工业作为人和兽用疫苗。
文档编号A61K39/39GK1252002SQ98804145
公开日2000年5月3日 申请日期1998年3月5日 优先权日1997年3月6日
发明者J·C·阿圭勒卢比多, V·L·穆兹奥冈捷莱兹, M·D·J·里欧安古罗, G·E·圭兰尼托, E·潘彤阿里亚斯, G·威里兹利奥斯, D·皮查尔多狄亚兹, A·荷莱拉布赫, E·依哥莱西亚斯派莱兹, L·J·克鲁兹里康多, T·卡门内特伯提拉, C·米沙帕迪罗, M·赫恰瓦尔里亚盖伊, M·迪亚兹玛蒂尼兹, J·J·玛德拉左皮诺尔 申请人:遗传工程与生物技术中心