专利名称：人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种检测试剂盒，具体涉及人类偏肺病毒的 间接免疫荧光检测试剂盒.
背景技术：
人类偏肺病毒(Human Metapneumovirus, hMPV)为荷兰学者于2001年首 次在儿童呼吸道感染标本中分离得到的一种新的呼吸道病原体。该病毒可导致 人的上下呼吸道感染，其临床特征类似于RSV (呼吸道合胞病毒)，主要症状包 括咳嗽、咽痛、呼吸困难、缺氧、喘息等。有报道hMPV是老人、儿童、免疫缺 陷者严重呼吸道感染疾病的常见病原体。
人类偏肺病毒已发现了七年，亚洲、北美洲、欧洲、南美洲、非洲、大洋 洲均有其感染的流行病学报告，呈现全球流行趋势。在我国重庆和北京也有关 于hMPV感染的报道。血清学研究表明hMPV已经在人群流行50年以上，大多数 人在5岁时均已感染过hMPV。其感染的临床特征类似于RSV，症状主要包括咳嗽、 咽痛、发热、呼吸困难、缺氧、喘息等。4 ~ 10. 8 %的呼吸道感染住院患儿同hMPV 有关。hMPV还是引起老人和免疫缺陷患者严重呼吸道感染疾病的常见病原体， 并可同其他一些病原体合并感染，如RSV， SARS-CoV (严重急性呼吸综合征冠状 病毒)。由此可见，hMPV是一种常见的呼吸道病原体，建立快速准确的检测手段 对于其早期诊断治疗具有重要意义。 发明内容本发明的目的是提供一种人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，它能 用于早期感染人类偏肺病毒的检测，操作简便、快速准确，而且重复性好、通 用性好、经济实用。
本发明所述的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，包括分别包装的
试剂A:鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体浓度为1%的BSA (牛血清白蛋白) 的体积百分比为1: 50 ~ 20000的溶液lml;试剂A的作用在于与人类偏肺病毒 的抗原结合。
试剂B:含吐温-20的磷酸緩冲液(PBST) 100ml;试剂B为洗液，作用在 于洗去未结合的抗体。
试剂C: FITC标记羊抗鼠IgG抗体试剂B的体积百分比为1: 10 ~ 1000 的溶液lml;试剂C的作用在于形成抗原一特异性抗体一荧光抗体的复合物；
试剂D:浓度为0.01% Evens blue (伊文思蓝)染液lml。试剂D的作用 是将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比， 减少了非特异性荧光，便于分析和观察。
所述的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，其所述的含吐温-20的磷 酸緩冲液，为O. 8gNaCl; 0. 02g KC1; 0. 144g Na2HP04; 0. 024g KH2P04; 0.2ml Tween-20 (吐温-20)溶于80ml蒸馏水，调整pH到6-8，最后加蒸馏水定容 到100 ml。
本试剂盒的特异性实验检观J Light Diagnostics Respiratory panel 1 DFA 免疫荧光试剂盒(购自美国W公司)中七种常见呼吸道病毒腺病毒，A型流感 病毒，B型流感病毒，副流感病毒1型，副流感病毒2型，副流感病毒3型，呼吸 道合胞病抗原玻片。特异性实验显示检测腺病毒,A型流感病毒，B型流感病毒，副流感病毒l 型，副流感病毒2型，副流感病毒3型，呼吸道合胞病毒抗原玻片，未见阳性细 胞，无交叉反应。提示该试剂盒特异性很高。
本试剂盒的灵敏度实验在二十四孔板中培养Vero-E6细胞(非洲绿猴肾 细胞)，用DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养基)培养基将病毒液按十倍梯度稀释， 设10^10'倍稀释七个梯度，设未接种病毒的细胞为阴性对照，病毒原液接种 细胞为阳性对照。待稀释105倍病毒接种的细胞孔出现细胞病变后，刮下细胞， 制作抗原玻片，进行免疫荧光检测。同时吸取各孔上清用TCID5。(半数致死法) 法进行病毒滴度测定。
灵敏度实验显示分别检测经梯度稀释接种到细胞中的病毒抗原，可见101 到l(T倍稀释孔中阳性细胞逐渐减少，105倍稀释孔中未见阳性细胞。重复检测 五次，结果相同。测定104倍稀释孔病毒滴度为10"TCID50/ml。提示该试剂盒 的灵敏度很高。
实验速度应用本试剂盒进行人类偏肺病毒的检测，非常迅速。其他的一 些病毒检测经典方法，如病毒分离培养，需要1 ~ 2周时间，核酸扩增法需要4 -6小时，而本试剂盒只需要大约2小时。
本发明的有益效果它能用于早期人类偏肺病毒感染的检测，其灵敏度高、 特异性好、速度快，而且重复性好、经济实用，能为早期"^断和治疗提供可靠 的依据。
图l是人类偏肺病毒感染检测用玻片示意图。 图2是人类偏肺病毒感染阴性结果示意图。图3是人类偏肺病毒感染阳性结果示意图(放大200倍)。 图4是人类偏肺病毒感染阳性结果示意图(放大400倍)。
具体实施例方式
本发明所述的人类偏肺病毒的间接免疫焚光检测试剂盒，包括分别包装的 试剂A:鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体浓度为1%的BSA (牛血清白蛋白)
的体积百分比为1: 50 ~ 20000的溶液lml;其中的鼠抗人偏肺病毒单克隆抗体
购自美国CHEMICON/仝司。
试剂B:含吐温-2Q的磷酸緩冲液(PBST) 100 ml;试剂B为洗液；
试剂C: FITC标记羊抗鼠IgG抗体试剂B的体积百分比为1: 10 ~ 1000
的溶液lml;其中的FITC (异>^氰酸荧光素)标记羊抗鼠IgG (免疫球蛋白G)
抗体，购自美国CHEMICON公司；
试剂D:浓度为0. 01% Evens blue H尹文思蓝)染液lml。 所述的含吐温-2Q的磷酸緩冲液为0. 8gNaCl; 0. 02gKCl; 0.144gNa風;
0. 024g KH2P04; 0. 2ml Tween-20 (吐温-20 )溶于80ml蒸馏水，调整pH到6 ~
8，最后加蒸馏水定容到100 ml 。
实施例一临床标本的检测，所用的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试
剂盒，包括分别包装的
试剂A:鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体浓度为1%的BSA (牛血清白蛋白)
的体积百分比为1: 50的溶液lml;其中的鼠抗人偏肺病毒单克隆抗体购自美国
CHEMICON公司；
试剂B:含吐温-20的磷酸緩沖液(PBST) 100 ml;该含吐温-20的磷酸緩 冲液为0. 8g NaCl; 0. 02g KC1; 0.144g Na2HP04; 0. 024g KH2PO" 0. 2ml Tween-20(吐温-20)溶于80ml蒸馏水，调整pH到6,最后加蒸馏水定容到100 ml。
试剂C: FITC (异硫氰荧光素)标记羊抗鼠IgG (免疫球蛋白G)抗体试 剂B的体积百分比为1: 10的溶液lml;
试剂D:浓度为0. 01% Evens blue H尹文思蓝)染液lml。
参见图1、图2 、图3和图4 ，使用以上试剂盒进行检测的步骤如下
(1) 取病人鼻咽分泌物，存标本转移液中，置于水上，迅速转移至实验室； 充分吹打临床标本，1000rpm,4。C离心IO分钟，弃去上清，PBS (石克酸緩冲液) 重悬；
(2) 滴加待检测的细胞悬液至玻片孔中。室温自然干燥后，将玻片置于4 C丙酮固定10分钟。取出自然干燥；
(3) 每孔滴加4微升试剂A覆盖抗原玻片孔，置湿盒，37"C30分钟；试剂 B洗涤3次，每次5min'，
(4) 千燥后滴加试剂C，置湿盒内37"C30分钟； (5 )试剂B洗涤3次，每次10min;
(6) 干燥后试剂D染色5分钟；
(7) 蒸馏水洗净，自然干燥，甘油封片后置荧光显微镜下观察；
(8) 设置未感染hMPV的Vero-E6细胞为阴性对照，在荧光显微镜x100 视野下至少可见100个细胞为有效玻片。细胞完整，形态结构清晰，胞浆内有 明亮的绿色荧光颗粒者为阳性细胞。检验临床标本时以hMPV感染的Vero-E6细 胞作为阳性对照，每份标本中可见至少两个阳性细胞，阴性对照无特异性荧光， 阳性对照阳性着判为阳性。
实施例二临床标本的检测，所用的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，包括分别包装的
试剂A:鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体浓度为1°/。的BSA的体积百分比为1: 2000的溶液lml;
试剂B:含吐温-20的磷酸緩冲液(PBST) 100 ml;该含吐温-20的磷酸緩 冲液为O. 8gNaCl; 0.02gKCl; 0. 144g Na2HP04; 0. 024g KH2P04; 0. 2ml Tween-20 (吐温-20)溶于80ml蒸馏水，调整pH到7，最后加蒸馏水定容到100 ml。 试剂C: FITC标记羊抗鼠IgG抗体试剂B的体积百分比为1: 500的溶液
lml;
试剂D:浓度为0. 01% Evens blue (伊文思蓝)染液lml。 参见图1 、图2 、图3和图4 ，使用以上试剂盒进^ff检测的步骤如下
(1) 取病人鼻咽分泌物，存标本转移液中，置于水上，迅速转移至实验室；
(2) 充分吹打临床标本，1000rpm,4X:离心IO分钟，弃去上清，PBS重悬；
(3) 滴加待检测的细胞悬液至玻片孔中。室温自然干燥后，将玻片置于4 'C丙酮固定10分钟。取出自然干燥；
(4) 每孔滴加4微升试剂A覆盖抗原玻片孔，置湿盒，371C30分钟； (5 )试剂B洗涤3次，每次5min; (6)干燥后滴加试剂C，置湿盒内37匸30分钟；
(7 )试剂B洗涤3次，每次10min;
(8) 干燥后试剂D染色5分^h
(9) 蒸馏水洗净，自然干燥，甘油封片后置荧光显孩t镜下观察；
(10) 设置未感染hMPV的Vero-E6细胞为阴性对照，x 100视野下至少可 见100个细胞为有效玻片。细胞完整，形态结构清晰，胞浆内有明亮的绿色荧光颗粒者为阳性细胞。检验临床标本时以hMPV感染的Vero-E6细胞作为阳性对 照，每份标本中可见至少两个阳性细胞，阴性对照无特异性荧光，阳性对照阳 性着判为阳性。
实施例三临床标本的检测，所用的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试 剂盒，包括分别包装的
试剂A:鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体浓度为"/。的BSA (牛血清白蛋白) 的体积百分比为1: 20000的溶液lml;
试剂B:含吐温-20的磷酸緩冲液(PBST) 100 ml;该含吐温-20的磷酸緩 冲液为0. 8g NaCl; 0. 02g KC1; 0. 144g Na2HP04; 0. 024g KH2P04; 0. 2ml Tween-20 (吐温-20)溶于80ml蒸馏水，调整pH到8,最后加蒸馏水定容到100 ml,
试剂C: FITC (异硫氰荧光素)标记羊抗鼠IgG (免疫球蛋白G)抗体试 剂B的体积百分比为1: 1000的溶液1ml;
试剂D:浓度为0.01% Evens blue (伊文思蓝)染液lml。
参见图1、图2 、图3和图4 ，使用以上试剂盒进行检测的步骤如下
(1) 取病人鼻咽分泌物，存标本转移液中，置于冰上，迅速转移至实验室；
(2) 充分吹打临床标本，1000rpm，4r离心IO分钟，弃去上清，PBS重悬；
(3) 滴加待检测的细胞悬液至玻片孔中。室温自然干燥后，将玻片置于4 'C丙酮固定10分钟。取出自然干燥；
(4 )每孔滴加4微升试剂A覆盖抗原玻片孔，置湿盒，37"C30分钟；
(5 )试剂B洗涤3次，每次5min;
(6)千燥后滴加试剂C，置湿盒内371C30分钟；
(7 )试剂B洗涤3次，每次10min;(8) 干燥后试剂D染色5分钟；
(9) 蒸馏水洗净，自然干燥，甘油封片后置荧光显微镜下观察；
(10) 设置未感染hMPV的Vero-E6细胞为阴性对照，x IOO视野下至少可 见100个细胞为有效玻片。细胞完整，形态结构清晰，胞浆内有明亮的绿色荧 光颗粒者为阳性细胞。检验临床标本时以hMPV感染的Vero-E6细胞作为阳性对 照，每份标本中可见至少两个阳性细胞，阴性对照无特异性荧光，阳性对照阳 性着判为阳性。
实施例四培养病毒标本的检测，所用的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检 测试剂盒，包括分别包装的
试剂A:鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体浓度为1%的BSA (牛血清白蛋白) 的体积百分比为1: 50的溶液lml;
试剂B:含吐温-20的磷酸緩冲液(PBST) 100 ml;该含吐温-20的磷酸緩 冲液为O. 8gNaCl; 0. 02gKCl; 0. 144g Na2HP04; 0. 024g KH2P04; 0. 2ml Tween-20 (吐温-20)溶于80ml蒸馏水，调整pH到6，最后加蒸馏水定容到100 ml。
试剂C: FITC (异硫氰荧光素)标记羊抗鼠IgG (免疫球蛋白G)抗体试 剂B的体积百分比为1: 10的溶液1ml;
试剂D:浓度为0.01% Evens blue (伊文思蓝)染液lml。
参见图l、图2、图3和图4，使用以上试剂盒进行检测的步骤如下 (1)病毒接种培养Vero-E6细胞，待其长成单层平铺孔底约70 ~ 80 % ， 弃去培养液，加入hMPV病毒液，置5。/。C02孵箱中371C孵育1小时。弃去病毒 液，加入病毒维持液，i丈入5。/。C02孵箱中37。C培养。约5-7天后，待感染细 胞出现明显CPE后，刮下细胞。离心弃去病毒维持液，以PBS重悬；(2) 滴加待检测的细胞悬液至玻片孔中。室温自然干燥后，将玻片置于4 。C丙酮固定10分钟。取出自然干燥；
(3) 每孔滴加4微升试剂A覆盖抗原玻片孔，置湿盒，37'C30分钟； (4 )试剂B洗涤3次，每次5min;
(5)干燥后滴加试剂C，置湿盒内37。C30分钟； (6 )试剂B洗涤3次，每次10min;
(7) 干燥后试剂D染色5分钟；
(8) 蒸馏水洗净，自然干燥，甘油封片后置荧光显孩i镜下观察；
(9 )设置未感染hMPV的Vero-E6细胞为阴性对照，x 100视野下至少可见 IOO个细胞为有效玻片。细胞完整，形态结构清晰，胞浆内有明亮的绿色荧光颗 粒者为阳性细胞。检验临床标本时以hMPV感染的Vero-E6细胞作为阳性对照， 每份标本中可见至少两个阳性细胞，阴性对照无特异性荧光，阳性对照阳性着 判为阳性。
实施例五培养病毒标本的检测，所用的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检 测试剂盒，包括分别包装的
试剂A:鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体浓度为1%的BSA (牛血清白蛋白) 的体积百分比为1: 2000的溶液lml;
试剂B:含吐温-20的磷酸緩冲液(PBST) 100 ml;该含吐温-20的磷酸緩 冲液为0. 8g NaCl; 0. 02g KC1; 0. 144g Na2HP04; 0. 024g KH2P04; 0. 2ml Tween-20 (吐温-20)溶于80ml蒸馏水，调整pH到7，最后加蒸馏水定容到100 ml。
试剂C: FITC (异硫氰荧光素)标记羊抗鼠IgG (免疫球蛋白G)抗体试 剂B的体积百分比为1: 500的溶液lml;试剂D:浓度为0.01% Evens blue H尹文思蓝)染液lml。
参见图1、图2 、图3和图4 ,使用以上试剂盒进行检测的步骤如下
(1) 病毒接种培养Vero-E6细胞，待其长成单层平铺孔底约70 ~ 80 % ， 弃去培养液，加入hMPV病毒液，置5%C02孵箱中37n孵育1小时。弃去病毒 液，加入病毒维持液，放入5。/。C02孵箱中371C培养。约5~7天后，待感染细 胞出现明显CPE后，刮下细胞。离心弃去病毒维持液，以PBS重悬；
(2) 滴加待检测的细胞悬液至玻片孔中。室温自然干燥后，将玻片置于4 。C丙酮固定10分钟。取出自然千燥；
(3) 每孔滴加4微升试剂A覆盖抗原玻片孔，置湿盒，37'C30分钟； (4 )试剂B洗涤3次，每次5min;
(5)干燥后滴加试剂C,置湿盒内37t:30分钟； (6 )试剂B洗涤3次，每次10min;
(7) 干燥后试剂D染色5分钟；
(8) 蒸馏水洗净，自然干燥，甘油封片后置荧光显农i镜下观察；
(9 ) i殳置未感染hMPV的Vero-E6细胞为阴性对照，x 100 ;f见野下至少可见 IOO个细胞为有效玻片。细胞完整，形态结构清晰，胞浆内有明亮的绿色荧光颗 粒者为阳性细胞。检验临床标本时以hMPV感染的Vero-E6细胞作为阳性对照， 每份标本中可见至少两个阳性细胞，阴性对照无特异性荧光，阳性对照阳性着 判为阳性。
实施例六培养病毒标本的检测，所用的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检 测试剂盒，包括分别包装的试剂A:鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体浓度为1%的BSA (牛血清白蛋白) 的体积百分比为1:20000的溶液lml;
试剂B:含吐温-20的磷酸緩冲液(PBST) 100 ml;该含吐温-20的磷酸緩 冲液为0. 8g NaCl; 0. 02g KC1; 0. 144g Na2HP04; 0. 024g KH2P04; 0. 2ml Tween-20 (吐温-20)溶于80ml蒸馏水，调整pH到8，最后加蒸馏水定容到100 ml。
试剂C: FITC (异硫氰荧光素)标记羊抗鼠IgG (免疫球蛋白G)抗体试 剂B的体积百分比为1: 1000的溶液lml;
试剂D:浓度为0.01% Evens blue U尹文思蓝)染液lml。
参见图1、图2 、图3和图4 ，使用以上试剂盒进行检测的步骤如下
(1) 病毒接种培养Vero-E6细胞，待其长成单层平铺孔底约70~80%， 弃去培养液，加入hMPV病毒液，置5。/。C02孵箱中371C孵育1小时。弃去病毒 液，加入病毒维持液，》文入5。/。C02孵箱中37。C培养。约5 7天后，待感染细 胞出现明显CPE后，刮下细胞。离心弃去病毒维持液，以PBS重悬；
(2) 滴加待检测的细胞悬液至玻片孔中。室温自然干燥后，将玻片置于4 。C丙酮固定10分钟。取出自然干燥；
(3 )每孔滴加4微升试剂A覆盖抗原玻片孔，置湿盒，37'C 30分钟；
(4 )试剂B洗、涤3次，每次5min;
(5)干燥后滴加试剂C，置湿盒内37'C30分钟；
(6 )试剂B洗'涤3次，每次10min;
(7) 干燥后试剂D染色5分钟；
(8) 蒸馏水洗净，自然干燥，甘油封片后置荧光显孩i:镜下观察；设置未感染。
(9 ) hMPV的Vero-E6细胞为阴性对照，x 100 ^见野下至少可见100个细胞 为有效玻片。细胞完整，形态结构清晰，胞浆内有明亮的绿色荧光颗粒者为阳 性细胞。检验临床标本时以hMPV感染的Vero-E6细胞作为阳性对照，每份标本 中可见至少两个阳性细胞，阴性对照无特异性荧光，阳性对照阳性着判为阳性。
权利要求
1、人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，包括试剂A鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体浓度为1％的BSA(牛血清白蛋白)的体积百分比为150～20000的溶液1ml；试剂B含吐温-20的磷酸缓冲液(PBST)100ml；试剂CFITC标记羊抗鼠IgG抗体试剂B的体积百分比为1∶10～1000的溶液1ml；试剂D浓度为0. 01％Evensblue(伊文思蓝)染液1ml。
2、 根据权利要求1所述的人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，其特 征是所述的含吐温-20的磷酸緩沖液，为0. 8g NaCl; 0. 02g KC1; 0. 144g Na風; 0. 024g KH2P04; 0. 2ml Tween-20 (吐温-20 )溶于80ml蒸馏水，调整pH到6 ~ 8，最后加蒸馏水定容到100 ml。
全文摘要
本发明涉及人类偏肺病毒的间接免疫荧光检测试剂盒，包括试剂A鼠抗人类偏肺病毒单克隆抗体∶浓度为1％的BSA(牛血清白蛋白)的体积百分比为1∶50～20000的溶液1ml；试剂B含吐温-20的磷酸缓冲液(PBST)100ml；试剂CFITC标记羊抗鼠IgG抗体∶试剂B的体积百分比为1∶10～1000的溶液1ml；试剂D浓度为0.01％Evens blue(伊文思蓝)染液1ml。本发明的有益效果它能用于早期人类偏肺病毒感染的检测，其灵敏度高、特异性好、速度快，而且重复性好、经济实用，能为早期诊断和治疗提供可靠的依据。
文档编号G01N33/577GK101446592SQ200810237020
公开日2009年6月3日 申请日期2008年12月31日 优先权日2008年12月31日
发明者妍 任, 耀 赵, 赵晓东 申请人:重庆医科大学附属儿童医院