一种禽肺病毒病灭活疫苗的生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种禽肺病毒病灭活疫苗的生产方法，包括如下步骤禽肺病毒繁殖、禽肺病毒灭活和灭活禽肺病毒乳化步骤；以Vero细胞进行病毒繁殖，方法简单可操作并且成本低，病毒收获量和含量最高；病毒灭活彻底且不影响病毒的免疫性；乳化工艺即有水相，也有油相，水油混合的工艺不但节省时间和成本、便于操作、生产工序简化，并且制备的疫苗的性状指标均合格，并经过上鸡试验验证，其安全性、效力性均比国外产品更稳定有效，产生抗体更快、抗体滴度更高、抗体有效期更长。
CGMCC No.9001
20140324
【专利说明】_种禽肺病毒病灭活疫苗的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种禽肺病毒（APV)病灭活疫苗的生产方法，属于兽用生物制品技术 领域。
【背景技术】
[0002] 禽肺病毒（Avianpneumovims，APV)在上世纪70年代于南非首先分离到，此病在非 洲、北美、南美、中东、远东都有发生。禽肺病毒可以感染多种禽类，可导致感染动物鼻气管 炎、肿头征、产蛋下降等疾病，给禽类养殖造成严重的危害。近些年来，鸡群对禽肺病毒的感 染愈来愈多，此病很容易引起继发感染疫病，给禽业养殖户带来很多烦恼。
[0003] 美国于1989年分离到禽肺病毒，针对该病毒，应对的疫苗只有国外的活疫苗。抗 原的灭活是关系到疫苗安全和有效的关键步骤之一，如果病毒灭活不彻底，可能存在潜在 的疫苗安全隐患，而过量灭活又会影响病毒的免疫原性，影响产品的免疫效果。目前禽类的 灭活疫苗在生产中许多还是采用鸡胚、鸭胚等等材料的某一部分来繁殖，造价比较高，并且 疫苗效果不是特别好，而目前我国没有一家生产针对此病的疫苗。
[0004] 因此，对于禽肺病毒灭火疫苗，必须在在生产工艺上做改进，不但可以有效的增强 免疫效果，并且不存在潜在的安全隐患。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题针对现有技术存在的不足，而提供一种禽肺病毒病灭 活疫苗的生产方法，工艺简单、节约时间和成本，制备的疫苗安全性、效力性均比国外产品 更稳定有效，产生抗体更快、抗体滴度更高、抗体有效期更长。
[0006] 本发明是通过下述技术方案实现的：
[0007] 本发明首先提供一种禽肺病毒SHS/B病毒株，于2014年3月24日保藏于北京市 朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研宄所中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9001。
[0008] 一种禽肺病毒病灭活疫苗的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0009] (1)禽肺病毒繁殖：按常规方法制备Vero单层细胞，培养液为MEM，将禽肺病毒 SHS/B病毒株接种于Vero细胞上，接种量为培养液体积的0. 5-1. 5%;将接种病毒的细胞放 置于37°C、CO2培养箱中旋转培养，转速为7-13转/小时；每日观察2-4次，培养至60-90% 以上病毒发生病变时收获病毒液；
[0010] (2)禽肺病毒灭活：向步骤1获得的病毒液中加入甲醛溶液，至甲醛溶液为总抗原 量体积的〇. 1-0. 05%，于37°C下、在150r/min速度摇床中灭活，灭活时间为10-24h ;
[0011] (3)灭活禽肺病毒乳化：将步骤（2)的灭活禽肺病毒抗原与吐温-80按95:5体积 的比例混匀后制备成水相，将白油、司本-80和硬脂酸铝按95:5:1的体积比例混匀后制备 成油相；取油相1-3份于乳化罐中于2500-4000r/min条件下搅拌3-5min，再向乳化罐中加 入1份水相，于2500-4000r/min条件下乳化20-50min后得禽肺病毒病疫苗，分装密封保 存。
[0012] 优选的，步骤1中所述的病毒接种量为培养液重量的I %，转速为9-11转/小时， 培养至70-80%以上病毒发生病变时收获病毒液。
[0013] 优选的，步骤2中所述的浓度为0. 1%，灭活时间为16h。
[0014] 优选的，步骤3中所述的水相和油相的重量比为1 :2。
[0015] 优选的，步骤3中所述的搅拌和乳化转速为3500r/min，乳化时间为30-40min。
[0016] 本发明还提供一种禽肺病毒病灭活疫苗，是按照上述方法制备而成的。
[0017] 本发明疫苗制备方法，以Vero细胞进行病毒繁殖，方法简单可操作并且成本低， 病毒收获量和含量最高；病毒灭活彻底且不影响病毒的免疫性；乳化工艺节省时间和成 本、便于操作、生产工序简化，检产品的性状指标均合格，并经过上鸡试验验证，其安全性、 效力性均比国外产品更稳定有效，产生抗体更快、抗体滴度更高、抗体有效期更长。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1 :本发明禽肺病毒病灭活疫苗的生产方法的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体实施例对禽肺病毒病灭活疫苗的生产方法进行详细的描述：
[0020] 实施例1 :
[0021] 禽肺病毒SHS/B病毒株来源于山东省某养鸡场，由青岛易邦生物工程有限公司分 离鉴定，已于2014年3月24日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微 生物研宄所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9001， 研宄禽肺病毒繁殖的最佳条件：
[0022] (1)按常规方法制备Vero单层细胞，培养液为MEM，将禽肺病毒SHS/B病毒株接种 于Vero细胞上，接种量为培养液体积的0. 5%、1 %、1. 5% ;将接种病毒的细胞放置于37°C、 CO2培养箱中旋转培养，转速为10转/小时；每日观察2-4次，培养至80%以上病毒发生病 变时收获病毒液，并测定病毒含量，结果如表1所示：
[0023] 表1 :不同接种量对病毒含量的影响
[0024]
【权利要求】
1. 一种禽肺病毒SHS/B病毒株，于2014年3月24日保藏于北京市朝阳区北辰西路1 号院3号的中国科学院微生物研宄所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏编号为 CGMCC No. 9001。
2. -种禽肺病毒病灭活疫苗，其特征在于，包括有经灭活的禽肺病毒抗原、佐剂和油 相。
3. 根据权利要求2所述的禽肺病毒病灭活疫苗，其特征在于，所述的佐剂为吐温-80， 灭活禽肺病毒抗原与吐温-80的体积比为95:5,二者混匀后制备成水相。
4. 根据权利要求2所述的禽肺病毒病灭活疫苗，其特征在于，所述的油相包括白油、司 本-80和硬脂酸铝，三者的体积比例为95:5:1，三者混匀后制备成油相。
5. 根据权利要求3或权利要求4所述禽肺病毒病灭活疫苗，其特征在于，所述的水相与 油相的体积比为1:1-3。
6. 权利要求2-5任一项所述的禽肺病毒病灭活疫苗的生产方法，其特征在于，包括如 下步骤： (1) 禽肺病毒繁殖：按常规方法制备Vero单层细胞，培养液为MEM，将禽肺病毒SHS/B 病毒株接种于Vero细胞上，接种量为培养液体积量的0. 5-1. 5% ;将接种病毒的细胞放置 于37°C的C02培养箱中旋转培养，转速为7-13转/小时；每日观察2-4次，培养至60-90% 以上病毒发生病变时收获病毒液； (2) 禽肺病毒灭活：向步骤1获得的病毒液中加入甲醛溶液，至甲醛溶液为总抗原量体 积的0. 1-0. 05%，于37°C下、在150r/min速度摇床中灭活，灭活时间为10-24h ; (3) 灭活禽肺病毒乳化：将步骤（2)的灭活禽肺病毒抗原与吐温-80按95:5的体积比 例混匀后制备成水相，将白油、司本-80和硬脂酸铝按95:5:1的体积比例混匀后制备成油 相；取油相1-3份于乳化罐中于2500-4000r/min条件下搅拌3-5min，再向乳化罐中加入1 份水相，于2500-4000r/min条件下乳化20-50min后得禽肺病毒病疫苗，分装密封保存。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1中所述的病毒接种量为培养液重量 的1%，转速为9-11转/小时，培养至70-80%以上病毒发生病变时收获病毒液。
8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2中所述的浓度为0. 1 %，灭活时间 为 16h〇
9. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3中所述的水相和油相的重量比为 1:2〇
10. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3中所述的搅拌和乳化转速为 3500r/min，乳化时间为 30-40min。
【文档编号】A61P31/14GK104491856SQ201410742349
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月7日 优先权日:2014年12月7日
【发明者】李陆梅, 宫晓, 刘新文, 程增青, 徐保娟, 朱艳梅, 范根成, 邹敏, 郭伟伟, 楚电峰, 杜元钊 申请人:青岛易邦生物工程有限公司