一种荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂及其制备方法，属于生物药物制备领域。本发明的特异性前哨淋巴结显像剂是由Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Cy5.5-NHS)偶联的利妥昔单抗经过分离纯化后获得，缩写为Cy5.5-SLN-F。该显像剂使用方便、性能稳定，保存时间长，可达24个月，且标记率高达95％以上；可操作性强，可用于红外显像的前哨淋巴结的无创探测，次级淋巴结摄取低、注射点滞留低，显像及活检时间不受限，从注射后30min-24h都能很好显影，显影率达100％，具有更好的安全性，同时成本低，具有较好的临床应用前景。
【专利说明】一种荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药领域，具体地，涉及一种荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]手术是治疗乳腺癌的主要手段，由于腋窝淋巴结状态是影响乳腺癌病人生存的重要的独立性预后因子，临床上常用腋窝淋巴结清扫作为腋窝淋巴结状态诊断和治疗的一种手段，而单纯乳腺切除加腋窝淋巴结清扫(axillary lymph node dissect1n, ALND)是最常用的手术方式。随着乳腺癌的筛查和早期诊断，新发现的乳腺癌患者中50%?70%术后病理腋淋巴结阴性，对该部分患者施行ALND属于过度治疗；因此对所有乳腺癌患者均进行ALND的合理性受到质疑，迫切期待能够替代ALND的准确、微创的腋窝分期技术一乳腺癌前哨淋巴结活检(sentinel lymph node b1psy，SLNB)。SLN是乳腺癌淋巴转移的第一个淋巴结，可获得95%的诊断意义，并发症少。
[0003]SLNB由于能够提供较为准确的分期、减少传统手术并发症而成为研宄的热点之一，也是有望成为乳腺癌治疗的规范化手术式之一。在众多研宄中，选取的放射性示踪剂几乎都是依靠淋巴结吞噬作用进行探测的放射性胶体("mTc-硫胶体或99mTc-人血清白蛋白等)，其颗粒大小不均，次级淋巴系统有显影，每次注入示踪剂颗粒总数不易控制，且显像及活检时间要求高，否则均可导致非SLN显影，导致SLNB失败。2013年3月美国药监局(FDA)首次批准用于淋巴结定位的新药一Lymphoseek。它能够与淋巴网状内皮细胞表面甘露糖受体(mannose receptor,⑶206)特异性结合，精确检测原发肿瘤(乳腺癌、黑色素瘤)向淋巴转移情况。面对国外公司专利、技术保护的前提下，亟需发展新型特异性的淋巴结定位显像剂，以应对临床需求。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种使用方便、性能稳定、可操作性强且无核素辐射的荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂。
[0005]本发明的另一目的在于提供上述制备荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂的制备方法。
[0006]本发明提供的荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂，是由荧光物质偶联的利妥昔单抗经过分离纯化后获得。
[0007]具体地，本发明使用的荧光物质为Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Cy5.5-NHS)或Cy7-NHSo本发明实施例中使用Cy5.5-NHS。
[0008]本发明提供了制备荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂的方法，含有以下步骤:
[0009](I)纯化利妥昔单抗，并调配其浓度适合与荧光物质偶联；
[0010](2)在PBS缓冲溶液中使荧光物质与步骤(I)获得的利妥昔单抗充分偶联；
[0011](3)分离纯化偶联物。
[0012]本发明的上述方法中，步骤(I)纯化的方法为:通过凝胶色谱柱对利妥昔进行纯化。
[0013]本发明的方法中，步骤(I)采用PBS缓冲溶液调配纯化后的美罗华单抗浓度为5 ?lOmg/mL。
[0014]进一步地，所述PBS缓冲溶液浓度为0.01?0.1M，pH为6.0?8.0。优选地，pH
为 7.4。
[0015]其中步骤⑵的荧光物质为Cy5.5-NHS,其DMF溶液浓度为I X 10_2?I X 10 _3mol/mL。
[0016]其中，步骤(2)荧光物质与利妥昔单抗充分偶联的方法为:按照Cy5.5-NHS与美罗华单抗的体积比1:10?1:100将二者混合，并加入体积为Cy5.5-NHS体积10-100倍的0.1MpH = 6.0-8.0的PBS缓冲溶液，以lmol/L的Na2HPO4溶液调节反应体系的pH为8.0-9.5，充分混匀于4°C条件下避光反应12-24h。
[0017]优选地，步骤(2)荧光物质与利妥昔单抗充分偶联的方法为:按照Cy5.5-NHS与利妥昔单抗的体积比1:10将二者混合，并加入体积为Cy5.5-NHS体积100倍的0.1M pH =
7.4的PBS缓冲溶液，以lmol/L的Na2HPO4溶液调节反应体系的pH为8.5，充分混匀于4°C条件下避光反应12h。
[0018]本发明的方法中，步骤(3)采用ro-ιο柱分离纯化偶联物。
[0019]本发明还提供了上述特异性前哨淋巴结显像剂在制备乳腺癌检测试剂盒中的应用。
[0020]本发明提供的特异性前哨淋巴结显像剂具有以下优点:该显像剂使用方便、性能稳定，保存时间长，可达24个月，且标记率高达95%以上；可操作性强，可用于红外显像的前哨淋巴结的无创探测，次级淋巴结摄取低、注射点滞留低，显像及活检时间不受限，从注射后30min-24h都能很好显影，显影率达接近100 %，无任何放射性辐射，具有更好的安全性，同时成本低，具有较好的临床应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为Cy5.5_SLN_F前哨淋巴结显像剂的偶联示意图。
[0022]图2为Cy5.5_SLN_F单抗在裸鼠的前哨淋巴结荧光显像图，由左及右共6个图片，分别是皮下注射Cy5.5-SLN-F 30min、6h、ld、2d、5d、9d后的小鼠前哨淋巴结荧光显像图。
【具体实施方式】
[0023]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0024]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。
[0025]实施例1荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂的制备(I)
[0026]I)⑶20靶向单抗的纯化(以利妥昔单抗为例):取1.0mL 10mg/ml的具有⑶20抗原靶向的单抗，加入预先处理的ro-10柱中，而后向其中加入0.0lM pH 7.4的PBS溶液，收集其中ImL的单抗。并通过生物学方法进行蛋白定量，并向其中加入0.0lM pH 7.4的PBS溶液，稀释到5mg/mL待用；
[0027]2)以 0.0lM pH 7.4 的 PBS 溶液为缓冲液，取浓度为 I X l(T2mol/mL 的 Cy5.5-NHS的DMF溶液10 μ L与上述0.1mL利妥昔单抗溶液混合，向其中加入ImL 0.1M PBS溶液(pH=7.4)，以lmol/L的Na2HPCM溶液调节反应体系的pH为8.0，充分混匀，于4°C条件下避光反应i2h。通过ro-1o柱分离纯化。获得可进行红外显像的特异性前哨淋巴结药物Cy5.5-SLN-Fο
[0028]实施例2荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂的制备(2)
[0029]I) CD20靶向单抗的纯化(以利妥昔单抗为例):取1.0mL 50mg/ml的具有CD20抗原靶向的单抗，加入预先处理的ro-10柱中，而后向其中加入0.0lM pH 7.4的PBS溶液，收集其中利妥昔单抗。并通过生物学方法进行蛋白定量，并向其中加入0.1M pH 7.4的PBS溶液，稀释到10mg/mL待用；
[0030]2)以 0.1M pH 7.4 的 PBS 溶液为缓冲液，取浓度为 I X l(T2mol/mL Cy5.5-NHS 的DMF溶液10 μ L与上述1.0mL利妥昔单抗溶液混合，向其中加入ImL 0.1M PBS溶液(pH=7.4)，以lmol/L的Na2HPCM溶液调节反应体系的pH为9.5，充分混匀，于4°C条件下避光反应24h。通过ro-1o柱分离纯化。获得可进行红外显像的特异性前哨淋巴结药物Cy5.5-SLN-Fο
[0031]实施例3荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂的制备(3)
[0032]I) CD20靶向单抗的纯化(以利妥昔单抗为例):取1.0mL 20mg/ml的具有CD20抗原靶向的单抗，加入预先处理的ro-10柱中，而后向其中加入0.0lM pH 7.4的PBS溶液，收集其中0.5-1.5ml的单抗。并通过生物学方法进行蛋白定量，并向其中加入PBS溶液，稀释到7mg/mL待用；
[0033]2)以 0.05M pH 7.4 的 PBS 溶液为缓冲液，取浓度为 I X l(T3mol/mL 的 Cy5.5-NNHS的DMF溶液10 μ L与1.0mL上述利妥昔单抗溶液混合，向其中加入ImL 0.1M PBS溶液(pH=7.4)，以lmol/L的Na2HPO4溶液调节反应体系的pH为8.5，充分混匀，于4°C条件下避光反应ish。通过ro-1o柱分离纯化。获得可进行红外显像的特异性前哨淋巴结药物Cy5.5-SLN-Fο
[0034]实施例4荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂的应用效果
[0035]取30g小鼠一只，在其左后脚掌皮下注射20 μ L的Cy5.5_SLN_F(实施例1制备得到的)。分别与注射后301^11，611，1(1，2(1，5(1，9(1以精诺真小动物光学成像系统进行荧光显像，并与正常状态下的光学图象融合，观察小鼠后肢腋下前哨淋巴结摄取变化及全身分布情况，其荧光显像结果见图1。由图1可知，皮下注射Cy5.5-SLN-F后，30min时可显示清晰的SLN所在的位置，并且能够清晰观察到小鼠的大体像，在30min直至9天之后，依然能够见到前哨淋巴结清晰图像。在整个显像过程中，始终未见次级淋巴结显影。裸鼠以2%(体积分数)的异氟烷与氧气混合进行麻醉，荧光显像过程中以0.5%?1.5% (体积分数)的异氟烷进行维持。采集过程中使用C级别(12.5cm)视野，每次采集时间为lmin。采用Spectrum Living Imaging 4.2软件进行图像处理。处理过程中，选取的感兴趣区域(reg1n of interest, ROI)采用光子放射效率(Radiant efficiency)为单位，具体单位为[p/sec/cn^/srVtyW/cm2]，具体数据为:30min时，其荧光吸收为3000 ;6h时荧光吸收为8000 ；2d时荧光吸收为6000 ；5d时荧光吸收为5000 ；9d时荧光吸收为4000。
[0036]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种荧光偶联的特异性前哨淋巴结显像剂，其特征在于，由荧光物质偶联的利妥昔单抗经过分离纯化后获得。
2.如权利要求1所述的特异性前哨淋巴结显像剂，其特征在于，所述的荧光物质为Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯或Cy7-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
3.制备权利要求1所述的特异性前哨淋巴结显像剂的方法，其特征在于，含有以下步骤: (1)纯化利妥昔单抗，并调配其浓度适合与荧光物质偶联； (2)在PBS缓冲溶液中使荧光物质与步骤(1)获得的利妥昔单抗充分偶联； (3)分离纯化偶联物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)纯化的方法为:通过凝胶色谱柱对利妥昔单抗进行纯化。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)采用PBS缓冲溶液调配纯化后的利妥昔单抗浓度为5?10mg/mL。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)的PBS缓冲溶液浓度为0.01M?0.1M，pH 6.0-8.0。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)的荧光物质为Cy5.5-NHS，其DMF溶液浓度为 1 X 1(Γ2?1 X 10 -3mol/mL。
8.如权利要求3-7任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)荧光物质与利妥昔单抗充分偶联的方法:按照Cy5.5-NHS与利妥昔单抗的体积比1:10?1:100将二者混合，并加入体积为 Cy5.5-NHS 体积 10-100 倍的 pH 为 6.0-8.0 的 0.01M ?0.1M PBS 缓冲溶液，以 Na2HP04溶液调节反应体系的pH为8.0-9.5，充分混匀于4°C条件下避光反应12-24h。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)荧光物质与利妥昔单抗充分偶联的方法为:按照Cy5.5-NHS与利妥昔单抗的体积比1:10将二者混合，并加入体积为Cy5.5-NHS体积100倍的0.1M pH = 7.4的PBS缓冲溶液，以lmol/L的似2即04溶液调节反应体系的pH为8.5，充分混匀于4°C条件下避光反应12h。
10.权利要求1-2任一所述的特异性前哨淋巴结显像剂或权利要求3-11任一所述的方法制得的特异性前哨淋巴结显像剂在制备乳腺癌检测试剂盒中的应用。
【文档编号】A61K49/00GK104491881SQ201410742313
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】杨志, 朱华, 刘菲 申请人:北京肿瘤医院