专利名称：前哨淋巴结快速诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及前哨淋巴结快速诊断试剂盒，用于前哨淋巴结的快速诊断方法，属于 医药领域。
背景技术：
前哨淋巴结(SLN)是指原发肿瘤区域引流的第一站淋巴结，是预测该肿瘤区域淋 巴结转移状况的重要指标。SLN的存在，说明原发肿瘤区域淋巴结的转移是按可以预测的顺 序经淋巴管首先转移至前哨淋巴结，再进一步转移至远端淋巴结。SLN作为有效的屏障可以 暂时阻止肿瘤细胞在淋巴道的进一步扩散。如果SLN无肿瘤转移，理论上原发肿瘤引流区 域中其他淋巴结就不会发生肿瘤的转移。乳腺癌SLNB的开展，使临床医生有可能选择性地 切除那些最有可能发生肿瘤转移的淋巴结，并根据前哨淋巴结的病理检查结果，决定进一 步的治疗方案，使SLN阴性的患者免行乳腺癌腋淋巴结清扫术(ALND)。前哨淋巴结清扫术 (SLNB)最终能否解决ALND的问题，还要看SLN是否能准确地反映腋窝淋巴结的状态。如 果SLN能够准确预测腋窝淋巴结的状态(95% 100%)，那么SLNB就可以被广泛的应用。 SLNB作为判断局部淋巴结状态的诊断方法，在为临床接受而成为一种有效方法之前，必须 明确其敏感性、特异性、阳性及阳性预测值、总准确性以及假阴性率等问题。其中假阴性率 是最重要的一个因素，因为假阴性率可以导致治疗上的错误决定。免疫组化(IHC)是针对乳腺癌细胞中常见的突变蛋白，以其单克隆抗体与突变蛋 白结合达到检测目的。但该项技术很难在临床病理工作中推广应用快速病理切片较厚、染 色效果不佳，尚不能做到与常规石蜡病理完全相符合；常规的IHC染色需要很长的时间，不 能满足手术需要。淋巴结微转移的临床意义目前尚无定论。冰冻HE染色及CK-IHC的快速病理切片较厚、染色效果不佳，尚不能做到与常规石 蜡病理完全相符合；常规的IHC染色需要很长的时间，不能满足手术需要。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了前哨淋巴结快速诊断试剂盒，通过免疫磁性分 离技术术中诊断前哨淋巴结转移，能够快速、准确地判断出SLN阳性细胞。本发明的技术方案为
免疫磁性分离技术术中诊断运用针对乳腺癌恶性肿瘤细胞特异性较强的大鼠抗人 moc-31单抗标记乳腺癌前哨淋巴结中的恶性肿瘤细胞，而后用免疫磁珠分选系统富集前哨 淋巴结单细胞悬液中的m0C-31+细胞，所富集得到的细胞悬液进行流式细胞仪分析，运用 ⑶44v6、her-2以及mucin-1三种乳腺癌转移密切相关的肿瘤标志物联合标记免疫磁性分 离所得到的细胞产品，以分析产物三种乳腺癌淋巴结转移相关肿瘤标志物的表达水平，进 而确定该前哨淋巴结的转移情况。前哨淋巴结快速诊断试剂盒由四种抗体组成1.大鼠抗人moc-31抗体、2.大鼠抗 人CD44v6-FITC抗体、3.大鼠抗人her-2-percp抗体、4.大鼠抗人Mucinl-PE抗体；制备检测方法如下 (l)SLN单细胞悬液的制备
1)所有操作均于超净台中进行，将SLN置于干净无菌的培养皿中，缓慢加入5-10ml 0. 9%生理盐水，湿润前哨淋巴结2分钟；
2)用镊子与培养皿中小心剥离淋巴结表面的脂肪及结缔组织；
3)用无菌手术刀片将前哨淋巴结精确地分为四等份；
4)将其中两部分分别进行冰冻HE染色及CK-IHC染色；
5)剩余的两部分行免疫磁珠分离；
6)将步骤5)中的两部分置于1mm筛网上，下面置一无菌培养皿，用眼科剪小心将该两 部分充分剪碎，置l_2mm小块组织；
7)用研棒不停地研磨，并不时加入0.9%生理盐水l_2ml，直至筛网上未见明显组织；
8)收集培养皿中的单细胞悬液，并以0.9%生理盐水反复冲洗下层培养皿及筛网数次， 以尽可能收集较多的细胞；
9)将所收集的单细胞悬液过0.22// m的滤器除菌；
10)将滤过的单细胞悬液1500rpm、5min，离心一次；
11)弃上清，重悬于PH7.4的2 ml PBS磷酸盐缓冲液中，并平均分配于两个15ml离心 管中，细胞计数器计数；
12)将SLN单细胞悬液的浓度调整为107个/ml，备用。(2)免疫磁珠的预洗
1)根据靶细胞平均百分比确定靶细胞的数量；
2)按照每个靶细胞约4-8个磁珠的比例，加入适量的磁珠；
3)将所需的磁珠分别置于2个干净无菌的2ml聚丙烯(EP)管中，将磁珠重悬于1ml 的TRIS-EDTA缓冲液中，混勻；
4)将两个EP管分别置于磁性分离架(MPC-S)上分离lmin，可见磁珠贴壁；
5)用移液器小心吸取上层清液，注意此过程必须于磁场中进行，且不能触及壁上的 磁珠，以免影响磁珠的总量导致分离不充分；
6)将EP管中的磁珠重悬于1mlTRIS-EDTA缓冲液中，并按上述步骤冲洗两遍；
7)将免疫磁珠重悬于lmlTRIS-EDTA缓冲液中，备用。(3)moc_31抗体的标记
1)根据106个靶细胞Ing的量计算所需的moc-31抗体的量；
2)将所需量的moc-31抗体小心加入SLN的单细胞悬液中，4°C共育lOmin；
3)共育后，将上述步骤2)中的两管单细胞悬液置于离心机上，800rpm，离心3分钟， 吸弃上清，重悬下层沉淀于lml TRIS-EDTA缓冲液中；
4)重洗一遍，以除去残留的moc-31，所得沉淀重悬于lmlTRIS-EDTA缓冲液中。(4)细胞分离
1)将所得SLN单细胞悬液加入预洗过的磁珠中，并用移液器充分混合；
2)将上述混合的SLN单细胞悬液避光、4°C共育15分钟，此过程亦可置于冰盒上进 行，以减少非特异性结合的比例；
3)将上述两个EP管置于磁性分离架上细胞分离，磁珠与已标记大鼠抗人moc-31抗
4体充分结合，在磁场中贴壁，每次两分钟；
4)在磁场中用移液器小心吸弃上清，并重悬磁珠于lmlTRIS-EDTA缓冲液中；
5)按上述步骤，细胞分离三次，使细胞分离最大化。(5)细胞洗脱
1)重配洗脱液在每管冻干的Dnase I中加入300" 1 Collection Releasing Buffer II，缓慢轻柔摇晃，溶解，混勻，分装洗脱液于适当容积，-20°C可保存9个月。使用 前解冻，解冻后于冰上使用；
2)将磁珠重悬于含FCS的buffer3中预处理3min，将4// 1分离缓冲液(Dnase I) 加入到各管样品中，于冰盒上孵育lOmin。以100// 1-200// 1的移液器充分吹勻5_10次，使 细胞洗脱最大化；
3)将EP管置于磁性分离架上2min，将已洗脱的细胞上清液置于已预处理的EP管 中，将剩下的磁珠重悬于200// lbuffer3中；
4)重复上述洗脱步骤两次，收集免疫磁珠分离富集的单细胞悬液，备用。(6)流式细胞分析
1)将免疫磁珠分离所富集的细胞产品重悬于200// 1 TRIS-EDTA缓冲液中，并置于 流式管中，每个SLN样品各分实验管和对照管至少一管；
2)于实验管中同时加入鼠抗人⑶44V6-FITC单抗、鼠抗人her-2-percp单抗、大 鼠抗人Mucin 1-PE单抗各20" 1 ；
3)于对照管中加入三种相应的同型对照抗体各20//1 ；
4)实验管于对照管均置于4°C共育10-20min，注意避光；
5)1200rpm/min离心5分钟，弃上层清液；
6)将所得的细胞产品重洗一次，洗去残余抗体；
7)将细胞重悬于500// 1 4%多聚甲醛或pH7. 40的PBS中，上流式仪检测。本发明的有益效果为
传统HE染色方法操作简单、方便，用时少，但是其对前哨淋巴结的微转移敏感性较低， 尤其是其对前哨淋巴结微转移诊断的假阴性率较低已无法满足现代乳腺外科学的要求。细 胞角蛋白免疫组化是近几年的研究热点，其由于增加了对比度，是前哨淋巴结微转移更容 易检测出来。但是其操作复杂，耗时较长，并且对人员的技术水平有较高的要求，限制了其 在临床上的广泛应用。应用特异性单抗免疫磁珠分离法术中诊断前哨淋巴结的转移情况， 其操作较为方便，用时较少，整个过程能在60-70分钟内完成。并且其与传统的术中冰冻HE 染色和CK-IHC相比，在前哨淋巴结转移诊断的敏感性和假阴性率方面有明显的优势。三种 方法应用价值的比较如表1所示
表1 三种前哨淋巴结术中诊断方法应用价值的比较
冰冻HE染色CK-IHC磁珠分离法时间30-40min1-2天60-70min费用780500250左右灵敏度68. 0%76. 0%96. 0%特异度100%100. 0%100%假阴性率32. 0%24. 0%4.0% 。
图1为本发明实施例前哨淋巴结的处理方式示意图。
具体实施例方式以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用 于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。原料来源
月中瘤标志物:moc-31, CD44, her-2, Mucin—1
大鼠抗人moc-31抗体DAK0公司
大鼠抗人CD44v6-FITC抗体santa cruz公司
磁珠型号 Dynal beads M450, Invitrogen 公司
大鼠抗人her-2-percp抗体(使用常规抗体制备，标记方法)
大鼠抗人Mucinl-PE抗体(使用常规抗体制备，标记方法)
前哨淋巴结快速诊断试剂盒由四种抗体组成1.大鼠抗人moc-31抗体、2.大鼠抗人 CD44v6-FITC抗体、3.大鼠抗人her-2-percp抗体、4.大鼠抗人Mucinl-PE抗体。制备及检测方法
1、SLN单细胞悬液的制备
1)所有操作均于超净台中进行，将SLN置于干净无菌的培养皿中，缓慢加入5-10ml 0. 9%生理盐水，湿润前哨淋巴结2分钟；
2)用镊子与培养皿中小心剥离淋巴结表面的脂肪及结缔组织；
3)用无菌手术刀片将前哨淋巴结精确地分为四等份，并按顺时针方向依次标记为A、B、 C、D四部分，如图1所示，其中A、D部分行免疫磁珠分离。B、C两部分行冰冻切片HE染色 及CK-IHC染色；
4)将对角线的B、C两部分分别进行冰冻HE染色及CK-IHC染色；
5)剩余A、D两部分行免疫磁珠分离；
6)将A、D两部分置于1mm筛网上，下面置一无菌培养皿，用眼科剪小心将该两部分充 分剪碎，置l_2mm小块组织；
7)用研棒不停地研磨，并不时加入0.9%生理盐水l_2ml，直至筛网上未见明显组织；
8)收集培养皿中的单细胞悬液，并以0.9%生理盐水反复冲洗下层培养皿及筛网数次， 以尽可能收集较多的细胞；
9)将所收集的单细胞悬液过0.22 m的滤器除菌；
10)将滤过的单细胞悬液1500rpm、5min，离心一次；
11)弃上清，重悬于PH7.4的2 ml PBS磷酸盐缓冲液中，并平均分配于两个15ml离心 管中，细胞计数器计数；
12)将SLN单细胞悬液的浓度调整为107个/ml，备用；
2、免疫磁珠的预洗
1)根据靶细胞平均百分比确定靶细胞的数量；
2)按照每个靶细胞约4-8个磁珠的比例，加入适量的磁珠；
3)将所需的磁珠分别置于2个干净无菌的2ml聚丙烯(EP)管中，将磁珠重悬于1ml的TRIS-EDTA缓冲液中，混勻；
4)将两个EP管分别置于MPC-S磁性分离架上分离lmin，可见磁珠贴壁；
5)用移液器小心吸取上层清液，注意此过程必须于磁场中进行，且不能触及壁上的磁 珠，以免影响磁珠的总量导致分离不充分；
6)将EP管中的磁珠重悬于lmlTRIS-EDTA缓冲液中，并按上述步骤冲洗两遍；
7)将免疫磁珠重悬于lmlTRIS-EDTA缓冲液中，备用。3、moc_31抗体的标记
1)根据106个靶细胞Ing的量计算所需的moc-31抗体的量；
2)将所需量的moc-31抗体小心加入SLN的单细胞悬液中，4°C共育lOmin；
3)共育后，将上述步骤2)中的两管单细胞悬液置于离心机上，800rpm，离心3分钟， 吸弃上清，重悬下层沉淀于lml TRIS-EDTA缓冲液中；
4)重洗一遍，以除去残留的moc-31，所得沉淀重悬于lmlTRIS-EDTA缓冲液中。4、细胞分离
1)将所得SLN单细胞悬液加入预洗过的磁珠中，并用移液器充分混合；
2)将上述混合的SLN单细胞悬液避光、4°C共育15分钟，此过程亦可置于冰盒上进行， 以减少非特异性结合的比例；
3)将上述两个EP管置于MPC-S磁性分离架上细胞分离，磁珠与已标记大鼠抗人 moc-31抗体充分结合，在磁场中贴壁，每次两分钟；
4)在磁场中用移液器小心吸弃上清，并重悬磁珠于lml TRIS-EDTA缓冲液中；
5)按上述步骤，细胞分离三次，使细胞分离最大化。5、细胞洗脱
1)重配洗脱液在每管冻干的DnaseI中加入300" 1 Collection Releasing Buffer II，缓慢轻柔摇晃，溶解，混勻，分装洗脱液于适当容积，-20°C可保存9个月。使用 前解冻，解冻后于冰上使用；Buffer II 的配方RPMI-1640+1% FBS+lmM cacl2+4mM mgcl2 ；
2)将磁珠重悬于含FCS(Fetal calf serum)的Buffer3中预处理3min，将4" 1 分离缓冲液(Dnase I)加入到各管样品中，于冰盒上孵育lOmin。以100// 1-200// 1的移 液器充分吹勻5-10次，使细胞洗脱最大化；Buffer 3配方PBS+0. 1%BSA ；
3)将EP管置于MPC-S磁性分离架上2min，将已洗脱的细胞上清液置于已预处理的 EP管中，将剩下的磁珠重悬于200 lbuffer3中；
4)重复上述洗脱步骤两次，收集免疫磁珠分离富集的单细胞悬液，备用。6、流式细胞分析
1)将免疫磁珠分离所富集的细胞产品重悬于200// 1 TRIS-EDTA缓冲液中，并置于 流式管中，每个SLN样品各分实验管和对照管至少一管；
2)于实验管中同时加入鼠抗人⑶44V6-FITC单抗、鼠抗人her-2-percp单抗、大 鼠抗人Mucin 1-PE单抗各20" 1 ；
3)于对照管中加入三种相应的同型对照抗体各20//1 ；
4)实验管于对照管均置于4°C共育10-20min，注意避光；
5)1200rpm/min离心5分钟，弃上层清液；
6)将所得的细胞产品重洗一次，洗去残余抗体；7) 将细胞重悬于500// 1 4%多聚甲醛或pH7. 40的PBS中，上流式仪检测。
最后应说明的是以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
权利要求
前哨淋巴结快速诊断试剂盒，其特征在于由大鼠抗人moc 31抗体、大鼠抗人CD44v6 FITC抗体、大鼠抗人her 2 percp抗体和大鼠抗人Mucin1 PE抗体四种抗体制备而成，其制备检测方法如下(1)前哨淋巴结单细胞悬液的制备将前哨淋巴结组织用生理盐水湿润，剥离淋巴结表面的脂肪及结缔组织，将前哨淋巴结分为四份，将其中两部分分别进行冰冻HE染色及CK IHC染色，剩余的两部分行免疫磁珠分离，并充分剪碎，研磨，冲洗，收集细胞，将所收集的单细胞悬液通过滤器除菌，离心，弃上清；(2)免疫磁珠的预洗按照每个靶细胞约4 8个磁珠的比例，加入适量的磁珠，置于无菌的聚丙烯管中，将磁珠重悬于TRIS EDTA 缓冲液中，混匀，将聚丙烯管分别置于磁性分离架上分离，吸取上层清液，将聚丙烯管中的磁珠重悬于缓冲液中冲洗；(3)moc 31抗体的标记将所需量的moc 31抗体加入前哨淋巴结的单细胞悬液中，共育，然后离心，弃上清，重悬下层沉淀于 TRIS EDTA 缓冲液中；(4)细胞分离将所得前哨淋巴结单细胞悬液加入预洗过的磁珠中，并混合，避光、共育，置于磁性分离架上进行细胞分离，弃上清，并重悬磁珠于TRIS EDTA 缓冲液中；(5)细胞洗脱在每管冻干的Dnase I中加入CollectionReleasing Buffer II，溶解，混匀，分装洗脱液，低温保存，将磁珠重悬于含0.1% FCS(Fetal Calf Serum)的buffer 3(Buffer 3 配方PBS+0.1%BSA)中预处理，分离缓冲液加入到各管中，充分吹匀，使细胞洗脱最大化，磁性分离，将已洗脱的细胞上清液置于已预处理的聚丙烯管中，将剩下的磁珠重悬于buffer3中；(6)流式细胞分析将免疫磁珠分离所富集的细胞产品重悬于缓冲液中，并置于流式管中，加入鼠抗人CD44V6 FITC单抗、鼠抗人her 2 percp单抗、大鼠抗人Mucin 1 PE单抗，离心，弃上层清液，将所得的细胞重洗，洗去残余抗体，将细胞重悬于多聚甲醛或PBS中，上流式仪检测定量 。
全文摘要
本发明公开了前哨淋巴结快速诊断试剂盒，由大鼠抗人moc-31抗体、大鼠抗人CD44v6-FITC抗体、大鼠抗人her-2-percp抗体和大鼠抗人Mucin1-PE抗体四种抗体制备而成，其制备检测方法包括前哨淋巴结单细胞悬液的制备、免疫磁珠的预洗、moc-31抗体的标记、细胞分离、细胞洗脱和流式细胞分析，本发明的优点在于操作较为方便，用时较少，整个过程能在60-70分钟内完成。并且其与传统的术中冰冻HE染色和CK-IHC相比，在前哨淋巴结转移诊断的敏感性和假阴性率方面有明显的优势。
文档编号G01N33/532GK101975860SQ20101051272
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月20日 优先权日2010年10月20日
发明者严俊, 卢斌峰, 鞠景芳 申请人:江阴诺格生物科技有限公司