一种h3n2犬流感病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体的制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞工程技术领域，更具体地，涉及一种H3N2犬流感病毒的单克隆抗 体杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体的制备与应用。
【背景技术】
[0002] 犬流感（Canine influenza，CI)是由正粘病毒科A型流感病毒（IAV)属犬流感病 毒（CIV)引起的一种犬属动物接触性呼吸道传染病。该病首次于2004年在美国爆发，随后 在欧亚大陆等地区相继报道。CI主要分为H3N2和H3N8两种亚型，欧美以H3N8亚型为主， 大部分亚洲国家以H3N2亚型为主。近十多年来，IAV不断突破种间束缚，在人和动物中交 叉感染，引起了人们对流感的普遍关注。
[0003] 犬是与人类接触最为亲密的动物之一，可能在流感传染过程中扮演着重要角色。 因此，需要加强对CI的研宄；申请号为201410535918.6的中国专利公开了针对H3N2亚型 犬流感病毒HA2蛋白的单克隆抗体，它是以犬流感病毒分离株JS/10制备杂交瘤细胞后获 得，现有技术对于H3N2犬流感病毒的研宄较少，不利于临床研宄与发展。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术所存在的上述缺陷，提供一种H3N2 亚型犬流感病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
[0005] 本发明的第二个目的是提供一种H3N2亚型犬流感病毒的单克隆抗体。
[0006] 本发明的第三个目的是提供含有上述单克隆抗体的试剂盒。
[0007] 本发明的第四个目的是提供上述单克隆抗体的应用。
[0008] 本发明的第五个目的是提供基于上述单克隆抗体的免疫检测方法。
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
[0010] 一种H3N2亚型犬流感病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株H3N2-CIV-HA-2C5,所述细 胞株于2015年5月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201555,保 藏地址为湖北省武汉市武汉大学。
[0011] 上述杂交瘤细胞株的制备方法：取血清效价符合融合要求的BALB/c小鼠脾细胞 与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50% PEG-1000进行融合；用HAT培养基筛选融合细胞， 用纯化后的H3N2CIV包被酶标板，采用间接ELISA方法筛选目的融合细胞；经过多次有限稀 释，最后获得稳定分泌犬流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0012] 由上述杂交瘤细胞株分泌得到单克隆抗体；所述单克隆抗体为IgG2a亚型，轻链 为Kappa链。
[0013] 所述单克隆抗体的制备方法：应用保藏编号为CCTCC C201555的杂交瘤细胞株， 以I X IO6/只的量注入经FICA处理的8~10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察小鼠 腹部膨大时抽取腹水。采用琼脂糖亲和介质（Protein A)纯化腹水获得。
[0014] 血凝素（HA)是流感病毒的主要抗原蛋白，参与病毒结合细胞受体以及病毒与靶 细胞膜融合。流感病毒只有当HA裂解为HAl和HA2时才能发挥病毒感染作用，因此，制备 针对HA抗原位点的具有中和活性的单克隆抗体被作为评价流感病毒保护性的标准，本发 明所述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体为抗H3N2CIV HA的抗体。
[0015] 另外，本发明还提供含有上述单克隆抗体的试剂盒；所述试剂盒可用于检测流感 病毒。
[0016] 上述单克隆抗体在制备预防或控制流感病毒的药物或免疫制剂中的应用。
[0017] 上述单克隆抗体在制备预防或控制流感病毒的药物或免疫制剂组合物中的应用。
[0018] 上述单克隆抗体在检测流感病毒中的应用。
[0019] 本发明还提供基于上述单克隆抗体的免疫检测方法
[0020] 优选地，上述流感病毒为犬流感病毒。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0022] 本发明提供了一种H3N2亚型犬流感病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述杂 交瘤细胞株于2015年5月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201555 ;其分泌的单克隆抗体与H3N2亚型犬流感病毒血凝素特异性结合，亲和力高，纯 化后效价为 1 :320, 000,它与 CDV、CPV、CPIV、CAV- II、CRV 及 H7N9、H10N8、H9N2 亚型流感 病毒均不发生反应。通过注射本发明所述单克隆抗体用于预防和控制流感病毒的感染，与 传统的疫苗接种手段相比，特异性更强，风险更低，安全性更高。具有实际的应用价值。
【附图说明】
[0023] 图1为H3N2CIV浓缩纯化结果图。
[0024] 图2为杂交瘤细胞第7d生长状态图。
[0025] 图3为小鼠腹水与兔血清纯化效果图；M :蛋白质分子量标准；A :纯化后的兔血清 效果图；B :纯化后小鼠腹水。
[0026] 图4为单克隆抗体亚型鉴定结果；a :2C5分泌的McAb亚型检测结果；b :试纸条标 准显色条带说明。
[0027] 图5为单克隆抗体间接免疫荧光鉴定结果；a :H3N2CIV感染的MDCK细胞；b :阴性 对照。
[0028] 图6为单克隆抗体WB试验鉴定结果；a :真核表达的H3N2CIV NP、HA、PB1、PB2、PA 鉴定结果；b :真核表达的H3N2CIV NS2、M2、M1、NA鉴定结果；M :蛋白质分子量标准；C :未转 染质粒的正常293T细胞对照组。
[0029] 图7为阴性鸡胚尿囊液正态分布图。
[0030] 图8为双抗夹心ELISA敏感性试验。
[0031] 图9为双抗夹心ELISA特异性试验。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本 发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单 修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术 人员所熟知的常规手段。
[0033] 实施例1杂交瘤细胞株的制备
[0034] 一、H3N2亚型犬流感病毒的抗原制备
[0035] 本发明所用的毒株 A/canine/Guangdong/1/2006 (H3N2)(简称 CGDl)，其 Genbank 的登陆号为⑶433345. 1、⑶433346. 1、⑶433347. 1、⑶433348. 1、⑶433349. 1、⑶433350. 1、 GU433351. 1、GU433352. 1，毒株及其序列参照网址：http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ nuccore/ ? term = A% 2Fcanine% 2FGuangdong% 2F1% 2F 2006% 28H3N2% 29〇
[0036] 1、病毒扩大培养：将稀释后的CGDl毒株鸡胚尿囊液接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔， 接种量为〇. 15mL/胚，37°C孵育。每12h观察一次，弃24h内死亡鸡胚，将24h后的死胚置 于4°C冰箱保存。96h后将所有鸡胚于4°C冷却过夜，无菌收集鸡胚尿囊液，10, OOOr/min，离 心10min，去沉淀留上清。参照国标方法（GB/T 14926. 53-2001)，取少量尿囊液上清测定血 凝单位（HAU)，其余尿囊液上清于4°C暂存备用。
[0037] 2、病毒的灭活：在H3N2CIV尿囊液上清中加入体积分数约0. 1 %的甲醛溶液，充分 混匀，4°C灭活3d，每隔Id充分振荡1次。测定灭活病毒液的HAU，尿囊液置4°C保存。
[0038] 3、病毒的纯化：a.将灭活的病毒液转入超离心管（超离心管内不能有气泡，应完 全装满，以免离心过程中爆管），35, OOOr/min离心Ih ;b.及时弃上清，抽干离心管底部残留 上清。用已高压的2mL PBS重悬病毒沉淀，将重悬液转移至新EP管中备用；c.把不同浓度 的蔗糖加入密度梯度离心管（总体积12mL)中，先加15%蔗糖溶液2mL，再顺序加入30%、 45 %蔗糖溶液各4mL，每次加蔗糖溶液时应将针头完全置于管底，用较高浓度蔗糖溶液将较 低浓度鹿糖溶液抬升。把步骤b的重悬病毒液ImL加至鹿糖溶液最上层，35, OOOr/min下离 心2h ;d.在光线明亮处，小心吸取各浓度蔗糖层面交界处纯化产物，分别置于不同超离心 管中，加满PBS，35, OOOr/min下离心2h，去蔗糖；e.弃上清，加入PBS重悬沉淀，各管重悬液 吸出后分别转移至新高压EP管中，通过HA试验确定病毒粒子的分布。用分光光度计测定 纯化病毒（H3N2CIV)蛋白浓度后，-20°C保存备用。
[0039] 实验结果：共收集到鸡胚尿囊液约600mL，HAU为28,0. 1 %甲醛灭活后HAU下降一 个单位，为27。H3N2CIV主要存在于30%与45%蔗糖层面交界处，有许多小颗粒物分布，呈 白色条带。去蔗糖后，可见浓缩纯化的H3N2CIV呈黄白色斑块，如图1。试验共获得4mL病 毒悬液，HAU为1 :3, 200,分光光度计测得蛋白浓度为I. 65mg/mL ;在其它各浓度蔗糖层面也 发现流感病毒存在，但HAU均相对较低。
[0040] 4、小鼠免疫程序
[0041] 将纯化好的H3N2CIV免疫3只雌性8周龄BALB/c小鼠，共免四次（如表1)。首次 免疫使用FCA与纯化的H3N2CIV以1 :1超声乳化，取0. 3mL腹腔注射。在第14d和第28d 分别进行加强免疫时，以FICA与纯化的H3N2