具有高β-环化活力的环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及具有高β-环化活力的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程 和酶工程领域。
【背景技术】
[0002] 环糊精是由D-吡喃葡萄糖通过α -1，4-糖苷键连接而成的环状化合物，其中以6、 7和8个葡萄糖单元所构成的α-、β_和γ-环糊精最为常见。由于其呈中空圆筒状结构， 具有外部亲水、内部疏水的特性，环糊精能与许多疏水客体分子形成包合物，从而改变客体 分子的理化性质，因此，在食品、医药等工业领域中有着广泛的应用。
[0003] 环糊精的工业化生产均采用酶法工艺，即在环糊精葡萄糖基转移酶（CGT酶）催化 作用下通过环化反应转化淀粉所合成。由于野生CGT酶作用淀粉生产环糊精的环化活力较 低、特异性较差，使得环糊精的工业生产成本较高。
[0004] 本发明中所使用的来源于环状芽孢杆菌（Bacillus circulans) STBOl的β-CGT 酶总的环化活力约为302U/mg，进一步提高该酶的环化活力，将更加有利于环糊精的工业化 生产。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种环化活力提高的环糊精葡萄糖 基转移酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的环糊精葡萄糖基转移 酶的第89位的酪氨酸分别突变为甘氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺，所得单突变体依次命名为 Y89G、Y89D、Y89N。
[0006] 所述突变体还可以在单突变体的基础上，将第577位天冬氨酸突变为精氨酸，得 到双突变体，所得双突变体依次命名为Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/D577R。
[0007] 编码所述野生CGT酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，来源于环状芽孢杆菌 (Bacillus circulans)STBOl〇
[0008] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种获得所述突变体Y89G、Y89D、Y89N、 Y89G/D577R、Y89D/D577R 和 Y89N/D577R 的方法。根据 B. circulans STB01CGT 酶的基因序 列，分别设计并合成引入Gly89、Asp89、Asn89密码子单突变的引物和引入Asp577/Gly89、 Asp577/Asp89、Asp577/Asn89密码子双突变的引物，对基因进行定点突变，测定DNA序列， 分别鉴别出编码 Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、Y89D/D577R 和 Y89N/D577R 突变体的基因， 并在枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)WB 600中进行表达。
[0009] 所述方法还进一步包括突变体的表达与纯化：挑取携带编码突变体的质粒的表 达宿主B.subtilis WB 600的单克隆于LB培养基中，在37°C、200r/min下培养8~12h， 以4% (v/v)接种量接种到TB培养基中，在37°C、200r/min下发酵48h。将发酵液于4°C、 1000 Orpm离心20min以除去菌体，收集上清液采用疏水Phenyl HP柱和强阴离子交换Q-HP 柱相结合的方法，分别纯化得到突变体Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/ D577R酶制品。
[0010] 本发明的有益效果：构建了 6个有意义的突变体Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、 Y89D/D577R和Y89N/D577R，均实现了重组CGT酶β -环化活力的提高，比野生型CGT酶更 适用于环糊精的工业化生产。
【附图说明】
[0011] 图1野生型CGT酶及其突变体在pH 6. 5、50°C下作用于5% (湿基，w/v)麦芽糊 精生产环糊精情况；A，野生CGT酶；B，突变体Y89G ;C，突变体Y89D ;D，突变体Y89N ;E，突变 体 Y89G/D577R ;F，突变体 Y89D/D577R ;G，突变体 Y89N/D577R ; ，α -环糊精；#，β -环糊 精；▲，γ-环糊精。
【具体实施方式】
[0012] 实施例1突变位点的确定
[0013] 钙离子结合位点广泛存在于α -淀粉酶家族中，作为α -淀粉酶家族（家族13)的 一员，CGT酶也具有相似的妈离子结合位点。来源于环状芽孢杆菌（Bacillus circulans) STBOl的CGT酶第577位氨基酸残基天冬氨酸（Asp)位于钙离子结合位点CaIII处，将 Asp577突变为精氨酸（Arg)后，与野生型β-CGT酶相比，突变体D577R的β-环化活力提 高了 30. 7%，但是产物特异性没有发生改变。为了进一步提高来源于Β. circulars STBOl 的β-CGT酶的β-环化活力，我们考虑设计双突变以期得到酶活力高、β-环糊精特异性 高的突变体。而氨基酸残基89是定位于亚位点-3附近的主要残基之一，我们构建并得到 了双突变体重组酶Y89G/D577R、Y89D/D577R和Y89N/D577R，同时也构建了单突变体Y89G、 Y89D和Υ89Ν作为对照。
[0014] 实施例 2 突变体 Y89G、Y89D、Υ89Ν、Y89G/D577R、Y89D/D577R 和 Y89N/D577R 的制 备
[0015] (1)定点突变
[0016] 根据SEQ ID NO. 1所示的野生CGT酶基因序列，分别设计并合成引入Gly89、 Asp89、Asn89密码子单突变的引物；根据SEQ ID NO. 15所示的突变体D577R基因序列，分 别设计并合成了引入Asp577/Gly89、Asp577/Asp89、Asp577/Asn89密码子双突变的引物。 单突变体是将第89位的Tyr分别突变为Gly、Asp和Asn，双突变体是在将第577位Asp突 变为Arg的基础上，将第89位的Tyr分别突变为Gly、Asp和Asn。所得6种突变体依次命 名为：Y89G、Y89D、Y89N、Y89G/D577R、Y89D/D577R 和 Y89N/D577R
[0017] 利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体cgt/pST为模板进行定点突 变，所用引物分别是：
[0018] 引入Tyr89Gly突变的引物：
[0019] 正向引物：5' -CATCATCAATGGCTCCGGCGTAAA-3'，下划线为突变碱基，
[0020] 反向引物：5' -TTTACGCCGGAGCCATTGATGATG-3'，下划线为突变碱基；
[0021] 引入Tyr89Asp突变的引物：
[0022] 正向引物：5' -CATCATCAATGATTCCGGCGTAAA-3'，下划线为突变碱基，
[0023] 反向引物：5' -TTTACGCCGGAATCATTGATGATG-3'，下划线为突变碱基；
[0024] 引入Tyr89Asn突变的引物：
[0025] 正向引物：5' -CATCATCAATAATTCCGGCGTAAA-3'，下划线为突变碱基，
[0026] 反向引物：5' -TTTACGCCGGAATTATTGATGATG-3'，下划线为突变碱基；
[0027] 以含突变体D577R基因的表达载体cgt/pST_D577R为模板进行定点突变，所用引 物分别是：
[0028] 引入Tyr89Gly突变的引物：
[0029] 正向引物：5' -CATCATCAATGGCTCCGGCGTAAA-3'，下划线为突变碱基，
[0030] 反向引物：5' -TTTACGCCGGAGCCATTGATGATG-3'，下划线为突变碱基；
[0031] 引入Tyr89Asp突变的引物：
[0032] 正向引物：5' -CATCATCAATGATTCCGGCGTAAA-3'，下划线为突变碱基，
[0033] 反向引物：5' -TTTACGCCGGAATCATTGATGATG-3'，下划线为突变碱基；
[0034] 引入Tyr89Asn突变的引物：
[0035] 正向引物：5' -CATCATCAATAATTCCGGCGTAAA-3'，下划线为突变碱基，
[0036] 反向引物：5' -TTTACGCCGGAATTATTGATGATG-3'，下划线为突变碱基。
[0037] PCR 反应体系均为：5 XPrimeSTARBuffer (Mg2+Plus) 10 μ L，dNTPs (各 2. 5mM) 4 μ L， 正向引物（10 μ Μ) 1 μ L，反向引物（10 μ Μ) 1 μ L，模板 DNA 1 μ L，PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2· 5U/ μ L) 0· 5 μ L，加入双蒸水 32. 5 μ L0
[0038] PCR反应扩增条件均为：PCR扩增条件均为：98 °C预变性4min ;随后98 °C 10s， 55°C 15s，72°C 8min 进行 35 个循环；最后 72°C保温 lOmin。
[0039] 将PCR产物经过Dp