一种具有双靶区同时递药效果的复合磷脂热敏脂质体及其制备方法和应用与流程

本发明属于药学领域，涉及靶向制剂及其制备方法和应用，具体为一种具有双靶区同时递药效果的复合磷脂热敏脂质体及其制备方法和应用。

背景技术：

中药成分一般具有多效性，在于“多靶点协同起效”，这些靶点往往位于不同靶区，并且不同靶区之间对药量的要求往往不同，因此需要多靶区同时递药，并且在不同靶区之间能够实现递药比例的调节。

脂质体和包合物都属于制剂新技术的范畴，能够提高递药的效果。近年来，环糊精主动靶向修饰技术发展很快，通过在环糊精表面连接如叶酸等配体，可以实现将载药环糊精包合物主动靶向递药入胞(主要是肿瘤细胞)。但是，由于仅通过物理作用包合，载药环糊精包合物给药后在血液循环中很容易泄漏药物，并且环糊精还有一定的肾靶向性，因此严重限制了靶向效果。

包合物脂质体，即先将药物载入环糊精中制成包合物，再载入脂质体中制成包合物脂质体。与包合物相比，包合物脂质体的靶向性和稳定性更好；与脂质体相比，包合物脂质体中的载药包合物位于内水相，药物更加稳定，并且环糊精本身也是良好的冻干保护剂。因此，包合物脂质体是一种更加高效的载体，并且能够应用脂质双分子层和内水相“双重载药”，但是并不能实现多靶区同时递药。

因此，亟需开发新的靶向制剂，以改善多靶区同时递药的效果，同时改善载体的载药效果和稳定性。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种复合磷脂热敏脂质体，所述复合磷脂热敏脂质体包括内水相和脂质双分子层，以及脂质体内水相中的主动靶向的载药叶酸修饰环糊精包合物，和脂质双分子层中的游离药物。

根据本发明，所述磷脂热敏脂质体可以为磷脂类如二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、氢化大豆磷脂、隐形材料dspe-peg2000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)、单链磷脂mspc或胆固醇中的一种或多种。

根据本发明，所述载药叶酸修饰环糊精包合物可以为将亲脂性药物或其混合物载入叶酸修饰环糊精构成载药叶酸修饰环糊精包合物。

优选地，所述亲脂性药物优选为油水分配系数大于10的亲脂性药物，例如为莪术油、莪术醇、吉马酮、β-榄香烯、莪术二酮、姜黄素、去甲氧基姜黄素中的一种或多种。

根据本发明，所述游离药物可以为未经环糊精包合的药物，例如上述亲脂性药物。

作为本发明的一个实例，将莪术油、莪术醇、吉马酮、β-榄香烯或莪术二酮载入叶酸修饰环糊精包合物后将包封莪术油、莪术醇、吉马酮、β-榄香烯或莪术二酮的叶酸修饰环糊精包合物和游离药物分别载入磷脂热敏脂质体的内水相和脂质双分子层。

根据本发明，所述复合磷脂热敏脂质体可以根据给药需求调节载药叶酸修饰环糊精包合物和游离药物的比例，优选地，所述游离药物与载药叶酸修饰环糊精包合物的摩尔比为0.1～5:1。

本发明还提供如上所述复合磷脂热敏脂质体的制备方法，包括如下步骤：

1)将叶酸溶于二甲基亚砜中，加入催化剂反应，再加入浓度为0.1～0.5g/ml的氨基-β-环糊精吡啶溶液，继续搅拌，反应得固体。将上述固体溶解于水中，静置、过滤、浓缩、沉淀，沉淀经洗涤后干燥，即得叶酸修饰环糊精；

2)取亲脂性药物与步骤1)所得叶酸修饰环糊精制备载药叶酸修饰环糊精包合物；

3)采用膜材将步骤2)所得载药叶酸修饰环糊精包合物及游离药物载入脂质体。

优选地，步骤1)中，所述氨基-β-环糊精与叶酸的摩尔比可以为(1-5):1。所述催化剂可以为n-羟基琥珀酰亚胺和n,n-二环已基碳二亚胺中的一种或多种，其与氨基-β-环糊精的摩尔比为2.4:(1-5)，例如使用摩尔比为1.2:1.2:(1-5)的n-羟基琥珀酰亚胺、n,n-二环已基碳二亚胺与氨基-β-环糊精。

根据本发明，所述氨基-β-环糊精、叶酸与催化剂的反应优选在惰性气体中不高于50℃的温度下反应1-48小时，例如将叶酸与催化剂在氮气下室温反应3小时，加入氨基-β-环糊精后搅拌48小时，控温至45℃继续反应2小时。

所述沉淀可以为将浓缩后的浓缩液加入叶酸修饰环糊精的不良溶剂如丙酮中，例如逐滴加入丙酮中。

根据本发明，步骤2)中，

所述亲脂性药物与叶酸修饰环糊精的摩尔比为0.2～5:1。

优选通过饱和水溶液法或研磨法制备载药叶酸修饰环糊精包合物。

根据本发明，步骤3)中，

所述磷脂热敏脂质体具有如上所述的定义，例如使用重量比为8:1～3:0.5～2:0.2～1的二棕榈酰磷脂酰胆碱：氢化大豆磷脂：隐形材料dspe-peg2000(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇)：单链磷脂mspc作为膜材，如使用摩尔比为67.6:18.4:4:10的二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、氢化大豆磷脂(hspc)、隐形材料dspe-peg2000和单链磷脂mspc。

所述载药叶酸修饰环糊精包合物与游离药物的摩尔比可以为1:0.1～5。

本发明还提供如上所述复合磷脂热敏脂质体的用途，其用于制备抗肿瘤药物，例如用于制备具有双靶区同时递药效果的抗肿瘤药物。

有益效果

与现有技术相比，本发明所制备的同时包封有游离药物与叶酸修饰载药环糊精包合物的复合磷脂热敏脂质体可以实现同时作用于肿瘤细胞与肿瘤间质，抗肿瘤效果得到增强。同时，现有技术中脂溶性药物只能包封于脂质体的脂质双分子层中，而本发明提供的复合磷脂热敏脂质体中可以同时以游离药物形式包封于脂质双分子层和以环糊精包合物形式包封于内水相，因此载体的载药效果和稳定性也有显著提升。本发明所述复合磷脂热敏脂质体给药后，在靶部位释放出游离药物和主动靶向环糊精包合物。游离药物主要作用于肿瘤间质，主动靶向环糊精包合物通过叶酸受体介导进入肿瘤细胞，实现肿瘤间质和肿瘤细胞双靶区同时递药。并且可以灵活调节两者的比例以获得最佳治疗效果。

附图说明

图1为实施例6包封莪术醇复合磷脂热敏脂质体在不同温度下的释放度比较(n＝3)。

图2为实施例7包封莪术油复合磷脂热敏脂质体的体外抗肿瘤效果(n＝5)。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的化合物及其制备方法和应用做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

实施例1具有双靶区同时递药效果的复合磷脂热敏脂质体的制备

1)取叶酸1份，溶于二甲基亚砜中，加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)1.2份和n,n-二环已基碳二亚胺(dcc)1.2份，在氮气保护下避光磁力搅拌反应3h，加入溶解在8ml吡啶中的氨基-β-环糊精1份，继续搅拌48h，45℃继续搅拌2h。减压蒸去大部分溶剂，得到的固体溶解于300ml蒸馏水中，4℃静置12小时，过滤，滤液减压蒸至15ml后，逐滴加到300ml丙酮中，搅拌2h后取沉淀，丙酮洗涤后真空干燥过夜，即得叶酸修饰环糊精。

2)取莪术醇按1:1摩尔比与叶酸修饰环糊精采用饱和水溶液法制备载药主动靶向包合物。将叶酸修饰环糊精溶解于水中制成饱和溶液，将莪术醇溶解在无水乙醇中，逐滴加入叶酸修饰环糊精饱和水溶液中，50℃搅拌挥去乙醇，静置至室温，过0.45μm滤膜，滤液冷冻干燥，即得载有莪术醇的叶酸修饰环糊精包合物。

3)取二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)：氢化大豆磷脂(hspc)：隐形材料dspe-peg2000：单链磷脂mspc(摩尔比为67.6:18.4:4:10)作为膜材，将莪术醇和上述脂质一起溶解在无水乙醇中，将载有莪术醇的叶酸修饰环糊精包合物溶解在水相中，在磁力搅拌情况下将乙醇相注入水相，60℃搅拌1h挥去乙醇，超声减小粒径，即得同时包封莪术醇叶酸修饰环糊精包合物和游离莪术醇的复合磷脂热敏脂质体。其中游离莪术醇与叶酸修饰环糊精包合物中的莪术醇比例为1:1。

实施例2具有双靶区同时递药效果的复合磷脂热敏脂质体的制备

参考实施例1的制备步骤，与实施例1不同的是，叶酸与氨基β-环糊精合成时的比例是1:2；载入的药物为莪术油；莪术油与叶酸修饰环糊精制备包合物时的比例为5:1；脂质体中游离莪术油与叶酸修饰环糊精包合物中的莪术油的比例为1:2。

实施例3具有双靶区同时递药效果的复合磷脂热敏脂质体的制备

参考实施例1的制备步骤，与实施例1不同的是，叶酸与氨基β-环糊精合成时的比例是0.2:1；载入的药物为β-榄香烯；β-榄香烯与叶酸修饰环糊精制备包合物时的比例为2:1；脂质体中游离β-榄香烯与叶酸修饰环糊精包合物中的β-榄香烯的比例为1:5。

实施例4具有双靶区同时递药效果的复合磷脂热敏脂质体的制备

参考实施例1的制备步骤，与实施例1不同的是，叶酸与氨基β-环糊精合成时的比例是1:5；载入的药物为吉马酮；吉马酮与叶酸修饰环糊精制备包合物时的比例为1:5；脂质体中游离吉马酮与叶酸修饰环糊精包合物中的吉马酮的比例为2:1。

实施例5具有双靶区同时递药效果的复合磷脂热敏脂质体的制备

参考实施例1的制备步骤，与实施例1不同的是，叶酸与氨基β-环糊精合成时的比例是1:1；载入的药物为莪术二酮；莪术二酮与叶酸修饰环糊精制备包合物时的比例为0.5:1；脂质体中游离莪术二酮与叶酸修饰环糊精包合物中的莪术二酮的比例为1:3。

实施例6包封莪术醇复合磷脂热敏脂质体的温敏释放度研究

将实施例1制备得到的包封莪术醇叶酸修饰环糊精包合物和游离莪术醇的复合磷脂热敏脂质体进行温敏释放度研究。释放介质为ph7.4等渗磷酸盐缓冲液(处方中含137mmol/lnacl、3mmol/lkcl、8mmol/lnahpo4、1mmol/lkh2po4)。将包封莪术醇复合磷脂热敏脂质体加入100ml释放介质中，于不同温度恒温磁力搅拌，于不同时间点取样用截留分子量为100k的超滤管超滤，取超滤液采用hplc测定其中莪术醇浓度，计算释放度，如图1所示，可见莪术醇叶酸修饰环糊精包合物能够迅速通过超滤膜，而复合磷脂热敏脂质体在42℃条件下快速完全释放，在体温37℃下释放比较缓慢，说明复合磷脂热敏脂质体具有较好的温敏释放性能。

实施例7包封莪术油复合磷脂热敏脂质体的细胞毒性研究

将实施例2制备得到的包封莪术油复合磷脂热敏脂质体进行细胞毒性研究。采用叶酸受体高表达的人宫颈癌细胞hela细胞作为试验对象，加入不同浓度的莪术油和包封莪术油复合磷脂热敏脂质体，42℃加热1h，然后孵育24h，采用mtt法测定肿瘤细胞活力，计算抑制率，结果如图2所示，可见包封莪术油复合磷脂热敏脂质体的体外抗肿瘤细胞远高于游离莪术油。

实施例8包封β-榄香烯复合磷脂热敏脂质体的抗肿瘤作用研究

将本发明实施例2制备得到的包封β-榄香烯复合磷脂热敏脂质体与β-榄香烯进行抗肿瘤作用研究。采用叶酸受体高表达的人宫颈癌细胞hela细胞，裸鼠腋下接种，待肿瘤大小超过150mm³后开始给药，每天静脉给药一次，剂量为100mg/kg，连续给药5d，给药后肿瘤部位42℃加热1h，给药后第7d处死动物，取肿瘤部位称重，并计算抑制率，结果β-榄香烯和包封β-榄香烯复合磷脂热敏脂质体的抑制率分别为34.66％和67.96％，可见采用包封β-榄香烯复合磷脂热敏脂质体的抗肿瘤效果提升了近一倍。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。