用于动物饲料的耐热植酸酶的制作方法

专利名称：用于动物饲料的耐热植酸酶的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及分子生物学领域，更具体地说涉及制备和使用耐热植酸酶的方法。
背景技术：
植酸酶(肌醇-六磷酸磷酸水解酶(myo-inositol hexakisphosphatephosphohydrolase)EC3.1.3.8)是将植酸盐(phytate)(肌醇六磷酸盐)水解为肌醇和无机磷酸盐的酶。已知该酶是有价值的食品添加剂。在21世纪来临之际，植酸酶作为动物饲料添加剂的年销售额估计为1亿美元，且仍在增长。
家禽和猪饲料目前主要以谷类、豆类和油料种子产品为基础。大约有三分之二的磷(P)以植酸盐，即植酸的盐(肌醇六磷酸盐，InsP6)形式存在于这些饲料中(Jongbloed et al.，1993)。在植物体内，肌醇六磷酸盐中的磷在混合形式的肌醇六磷酸钙-镁-钾盐中以螯合物形式存在，其溶解性非常低(Pallauf and Rimbach，1997)。这种形式的磷对于单胃动物如人类、猪和家禽来说很难消化/利用。
对于肌醇六磷酸复合物中结合的肌醇六磷酸磷和矿物质以及微量元素的利用来说，需要植酸酶来水解植酸中以酯型结合的磷酸基团(Rimbach et al.，1994)。植酸酶是一类特殊的磷酸酶，它能够将植酸水解成一系列肌醇的低级磷酸酯和磷酸盐。已知存在有两种类型的植酸酶3-植酸酶和6-植酸酶，提示了易受攻击的磷酸盐酯键。虽然单胃动物缺少足够的植酸酶来有效地利用植酸形式的磷酸，许多真菌、细菌和酵母生成可用于添加到动物食物的植酸酶。
有足够的资料说明了补充植酸酶对磷可消化性和动物表现的益处(Mroz et al，1994；Kornegay et al.，1996；Rao et al.，1999；Ravindramet al.，1999)。但是，经常仅利用以生产商的销售策略形式提供的和酶相关的肤浅信息，在特定的(ad hoc)基础上进行了大多数研究。酶制剂的效率不但取决于类型、包涵率(inclusion rate)和所具有的活性水平，还取决于酶在通过胃肠道时所经受的不同条件下，以及在用于预处理食物和饲料制剂的条件下保持活性的能力。
虽然多种植酸酶可以用作补充剂，许多酶都具有一定的缺点。例如，目前使用的许多植酸酶都在饲料成丸过程中由于热处理而丧失活性。另外，在补充有低水平磷酸钙的饮食中，目前使用的许多植酸酶都是不够的。并且，许多情况下，微生物表达酶的生产成本高。
因此，需要特性得到改善的植酸酶来用于动物饲料和食品加工，以及生产该植酸酶的经济方法。生产更经济的植酸酶的一个方法是通过重组DNA技术产生能够表达植酸酶的转基因植物或植物器官，并将植酸酶添加到动物饲料或人饮食中，直接使用。可替换的方案是，提取植酸酶，如果需要的话，根据所需用途加以纯化。
发明概述相应地，本发明提供了制备和使用编码耐热植酸酶的核酸分子(多聚核苷酸)的方法，所述耐热植酸酶在约60℃30分钟后仍保留至少40％活性、且具有高度的比活(specific activity)，即37℃、酸性pH如pH4.5条件下至少约200U/mg的耐热植酸酶。
在一个实施方案中，本发明提供了制备耐热植酸酶的方法。该方法包括在植物宿主细胞中表达表达盒(expression cassette)的方法，该表达盒包含和编码耐热植酸酶的核酸分子可操纵性相连接的启动子，其中耐热植酸酶约60℃下30分钟后仍保留至少40％活性、且pH4.5、37℃条件下比活超过200U/mg。在一个优选的实施方案中，该方法进一步包括分离耐热植酸酶。植物宿主细胞可以是单子叶植物细胞，如玉米或小麦细胞，或者双子叶植物细胞，如大豆细胞。
在一个优选的实施方案中，用来制备重组耐热植酸酶的植物细胞产生糖基化形式的重组耐热植酸酶。
本发明还提供了编码耐热植酸酶的多聚核苷酸序列，其中多聚核苷酸序列优化在植物细胞也就是玉米细胞中表达。
优选的是，编码耐热植酸酶的多聚核苷酸(第一个多聚核苷酸)可操纵性地和至少一个调控序列，如启动子、增强子、内含子、终止序列或其任意组合相连接，或可选择性地和编码信号序列的第二个多聚核苷酸相连接，其中信号序列将第一个多聚核苷酸编码的酶导向特定的细胞部位，如细胞外部位位置。启动子可以是组成型启动子，如泛素启动子，或者诱导性(条件)启动子。启动子可以是组织特异性的。在一个优选的实施方案中，启动子是胚乳特异性启动子，如玉米γ-玉米醇溶蛋白(zein)谷蛋白-2启动子，优选玉米27-KD的γ-玉米醇溶蛋白谷蛋白-2启动子，或玉米ADP-葡萄糖焦磷酸酶启动子。启动子可以是胚芽(embryo)特异性的启动子，如玉米球蛋白1或玉米油质蛋白18KD启动子。示例性的启动子包括但不限于SEQ ID NO8和SEQ ID NO9。
优选的是本发明的耐热植酸酶约60℃下30分钟仍保留至少40％活性，较优选的是约65℃下30分钟仍保留至少40％活性，更优选的是约70℃下30分钟仍保留至少35％活性；37℃、酸性pH如小于pH5.0，较优选小于pH4.0且大于pH1.5条件下，比活至少约400U/mg，较优选约600U/mg，更优选约800U/mg。SEQ ID NO1中提供了本发明的示例性耐热植酸酶。
本发明还提供了包含本发明表达盒或多聚核苷酸的载体，以及包含本发明多聚核苷酸、表达盒或载体的植物细胞和转化植物细胞。本发明的载体还编码多个多肽，包括多个耐热植酸酶；还编码包含本发明耐热植酸酶的融合多肽，植物细胞可以包含一个或多个本发明的载体。本发明的转化植物细胞可用于制备本发明的重组耐热植酸酶。相应地，本发明提供了从本发明的转化植物细胞分离的耐热植酸酶，以及合成制备的酶。
通过本发明方法制备的融合多肽优选包含信号序列。该信号序列，可操纵性地和植酸酶基因相连接，将植酸酶靶向到细胞的造粉体、内质网、质外体或淀粉颗粒。示例性的信号序列包括但不局限于蜡质基因的N末端序列、γ-玉米醇溶蛋白的N末端序列，淀粉结合结构域，如蜡质基因淀粉结合结构域。在一个优选的实施方案中，本发明方法中制备和采用的融合多肽包含SEKDEL信号序列，该信号序列和耐热植酸酶的C末端可操纵性地相连接。
本发明提供的耐热植酸酶在pH大于2.0、小于4.0的条件下半衰期超过25分钟。
本发明进一步提供的是耐热植酸酶、植酸酶制剂或酶混合制剂的配制方法。重组耐热植酸酶或其制剂以补充剂的形式添加到食物或动物饲料中，或在食物或动物饲料加工过程之前、加工过程中或加工之后加到食物及饲料的组分中。优选的是，本发明的重组耐热植酸酶在制粒机中的热(如蒸汽)条件之前和/或过程中添加到饲料组分的混合物中。因此，本发明包括制备和使用耐热植酸酶的方法。
另外，由于本发明的植酸酶能够耐受饲料配制过程中商用制粒机中的热条件，本发明提供了制备动物饲料，如包含耐热植酸酶的硬颗粒饲料颗粒的方法。为了制备饲料，可以将配制好的植酸酶和饲料组分相混合，在制粒机中形成混合物蒸汽条件，使其保留至少50％热处理前的酶活性，然后饲料压榨通过颗粒着色(pellet dye)。除了和维生素、矿物质、其他饲料酶、农业副产品(如麦麸或玉米麸片)或其组合一起使用之外，植酸酶自身也可以用作动物饲料补充剂。该酶还可以添加到糊状食物中，如没有粒化的食物。
由于目前能够购买到的植酸酶不是耐热的，它们经常在粒化之后应用，通常通过将酶溶液喷洒到粒化的饲料上。与喷洒方法相关的一些问题是只有一小部分颗粒和酶相接触，酶只存在于已包被颗粒的表面，饲料厂需要引进并操纵复合喷洒机器。相比之下，本发明的耐热植酸酶，比活比其他商业来源的植酸酶高出约8倍，可以在粒化之前加入，从而生产出酶分布得到改善的饲料。而且，和喷洒植酸酶的饲料相比，包含本发明中耐热植酸酶的饲料具有更长的半衰期，这是因为喷洒方法引入了贮存过程中支持真菌和细菌生长的湿度。另外，本发明中耐热植酸酶的比活更高，使得饲料生产商能够在饲料中使用水平显著降低的磷酸盐。例如，目前建议补充有能够购买到的植酸酶的食物推荐使用基础水平为0.45％的无机磷酸盐。本发明的耐热植酸酶可以补充较低水平的磷酸盐，如家禽食物中约0.225％。
本发明因此提供了制备动物饲料的方法，该方法包括提供包含一个或多个饲料组分和包含本发明中耐热植酸酶的制备物的混合物，在适当的温度和湿度条件下对混合物进行处理，使混合物中存在的植酸水解。还提供了通过这种方法制备的动物饲料。
进一步提供了制备作饲料制剂组合物的耐热植酸酶的方法，该方法包括将包含本发明中耐热植酸酶的液体溶液和粗粉，如大豆粗粉相合并，产生混合物；将混合物冻干，产生冻干组合物。在另一个实施方案中，该方法进一步包括将冻干组合物和其他饲料组分相合并，产生进一步的组合物。本发明还提供了根据这些方法制备的冻干组合物。
本发明进一步提供了一种方法，其中对包含动物饲料组分和含有本发明中耐热植酸酶的制剂的混合物进行热处理，优选在超过50℃的温度下进行热处理，产生热处理的动物饲料混合物。也提供了通过该方法制备的热处理动物饲料。植酸酶制剂可以是液体制剂或固体制剂，优选包含少于约1％的无机磷酸盐。优选的植酸酶制剂是转基因植物材料。转基因植物材料优选玉米粒、碾碎的玉米粒、玉米粉或从玉米中制备的酶提取物。
在一个实施方案中，包含本发明中耐热植酸酶的液体溶液和大豆粗粉相合并，产生混合物，然后将混合物冻干。优选包含少于0.45％无机磷酸盐的混合物可以包含至少一种维生素、矿物质、耐热植酸酶之外的酶、有机酸、原生物(probiotic)产物、必需的油(essential oil)或谷物(grain)加工辅产品(co-product)。可以对热处理的饲料进行进一步加工，如通过制粒机压榨热处理的饲料，产生粒化的动物饲料，也包括在本发明的范围之内。
还提供了包含按照本发明方法制备的耐热植酸酶的动物饲料组合物。尤其是，本发明提供了包含根据本发明方法制备的耐热植酸酶的动物饲料组合物，pH4.5、37℃条件下植酸酶的比活超过400U/mg，优选pH4.5、37℃条件下超过600U/mg，更优选pH4.5、37℃条件下超过800U/mg。在一个优选的实施方案中，动物饲料组合物包含耐热植酸酶，在pH大于2.0、小于4.0条件下该植酸酶半衰期超过25分钟。
还提供了包含按照本发明方法制备的耐热植酸酶的酶饲料添加剂或食物添加剂。在优选的实施方案中，饲料和食物添加剂包含耐热植酸酶，pH4.5、37℃条件下该酶的比活超过400U/mg，优选pH4.5、37℃条件下超过600U/mg，更优选pH4.5、37℃条件下超过800U/mg。在另一个优选的实施方案中，动物饲料和食物添加剂组合物包含耐热植酸酶，在pH大于2.0、小于4.0条件下该植酸酶半衰期超过25分钟。
还提供了减小/降低饲料转化率、改善动物体重增加的方法，该方法包括用包含耐热植酸酶的饲料饲养动物。在一个优选的实施方案中，该方法包括用包含低于0.45％的无机磷酸盐和能够增加饲料转化率或改善动物体重增加的有效量热稳定性植酸酶。在另一个实施方案中，优选的是热稳定性植酸酶在动物消化道中具有约30分钟的半衰期。
进一步提供了将动物对磷，如无机磷的饮食需求降至最低的方法。该方法包括用有效量的、包含本发明耐热植酸酶的饲料饲养动物，以增加对动物饲料中磷的生物利用度，优选对动物饲料中无机磷的生物利用度。还提供了增加对动物饲料中磷的利用的方法，该方法包括用有效量的、包含本发明耐热植酸酶的饲料饲养动物，以增加对动物饲料中磷的生物利用度。在这些方法的另一个实施方案中，植酸酶在动物消化道中具有约30分钟的半衰期。
另外，本发明提供了降低动物排泄物中磷酸盐水平的方法，该方法包括用有效量的、包含本发明耐热植酸酶的饲料饲养动物，以降低动物排泄物中的磷酸水平。在一个优选的实施方案中，本发明提供了降低动物排泄物中磷酸水平的方法，该方法包括用包含少于0.45％的无机磷和有效量本发明耐热植酸酶的饲料饲养动物，以降低动物排泄物中的磷酸水平。在这些方法的实施方案中，植酸酶在动物消化道中具有约30分钟的半衰期。
本发明还提供了提高动物饲料或人类食品营养价值的方法。该方法包括在制备动物饲料或人类食品的过程中加入本发明的耐热植酸酶。还提供了制备人类食品的方法，该方法包括提供食品组分和包含本发明耐热植酸酶的制剂所形成的混合物；在适当的温度和湿度条件下处理混合物，促进混合物中植酸的水解。根据该方法制备的处理人类食品也属于本发明的范围。和相应的未处理人类食品中的植酸含量相比，处理人类食品的植酸含量较低。
本发明还提供了改善谷物加工的方法，该方法包括在谷物加工过程中加入本发明的耐热植酸酶。该方法可用于改善所有谷物的加工，优选用于改善玉米、小麦、大豆、卡诺拉(canola)或甘蔗。
本发明进一步提供了提高加工的谷物产品营养价值的方法或加工谷物的方法，包括在谷物加工过程中往谷物产品中加入有效量的本发明耐热植酸酶，以提高饲料的营养价值。在一个优选的实施方案中，谷物是玉米，谷物加工方法是湿碾法，加工产品是玉米麸质(gluten)饲料、玉米麸质和玉米淀粉。在另一个优选的实施方案中，谷物是玉米、小麦、大豆、卡诺拉或甘蔗。在其他的优选方案中，谷物是油料种子，如大豆或油菜籽，加工的谷物产品是油料种子粗粉。
本发明进一步提供了制备包含耐热植酸酶的食物配方组合物的方法，该方法包括将包含本发明耐热植酸酶的液体溶液和粗粉相合并，产生混合物；将混合物冻干，产生冻干组合物。本发明还提供了通过这种方法制备的冻干组合物。在一个优选的实施方案中，本发明进一步提供了将冻干组合物和其他食物组分相合并，产生进一步的混合物。在一个优选的实施方案中，包含耐热植酸酶的组合物包含pH4.5、37℃条件下比活超过800U/mg的耐热植酸酶。在另一个优选的实施方案中，在pH大于2.0、小于4.0条件下耐热植酸酶半衰期超过25分钟。
另一方面，本发明提供了制备表达本发明耐热植酸酶的转化植物细胞、植物部位或植物的方法。该方法还包括通过这些方法产生的转基因植物细胞、植物部位或植物。在优选的实施方案中，该方法包括将表达盒导入植物细胞中，从而获得从转化的植物细胞产生的转基因植物，其中的表达盒包含和编码耐热植酸酶的核酸分子可操纵性相连接的启动子。其中耐热植酸酶优选约60℃下30分钟后保留至少40％活性、且pH4.5、37℃条件下比活超过200U/mg。较优选的是，pH4.5、37℃条件下耐热植酸酶的比活超过400U/mg。更为优选的是，pH4.5、37℃条件下耐热植酸酶的比活超过600U/mg。更进一步优选的是，pH4.5、37℃条件下耐热植酸酶的比活超过800U/mg。
转化的植物细胞、植物部位或植物可以是双子叶植物细胞或单子叶植物细胞，优选谷物细胞，更优选玉米或小麦细胞，或大豆细胞。
在优选的实施方案中，使用此方法制备包括SEQ ID NO1中耐热植酸酶的转基因植物细胞、植物部位或植物。其中产生的转基因植物细胞、植物部位或植物也包括在本发明的范围之内。
在本发明方法的另一个优选的实施方案中，耐热植酸酶在植物种子中表达。这种植物的种子也包括在本发明的范围之内。
包含本发明表达盒的转化植物细胞、植物部位和植物也包括在本发明的范围之内。如前所述，表达盒包含和编码耐热植酸酶的核酸分子可操纵性相连接的启动子。启动子可以是胚芽特异性启动子，如玉米球蛋白-1启动子或玉米油质蛋白18KD启动子，优选胚乳特异性启动子，如玉米ADP-葡萄糖磷酸酶启动子或玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子。
本发明还包括包含编码具有本发明耐热植酸酶之融合多肽的核酸分子的转化植物细胞、植物部位或植物。在一个优选的实施方案中，植物包含具有和耐热植酸梅可操纵性相连接的γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列的融合多肽。在另一个优选的实施方案中，植物包含具有和耐热植酸酶的C末端可操纵性相连接的SEKDEL的融合多肽。在另一个优选的实施方案中，植物包含具有和耐热植酸酶可操纵性相连接的N末端蜡质基因造粉体靶向肽的融合多肽。在另一个优选的实施方案中，植物包含具有和耐热植酸酶可操纵性相连接的蜡质基因淀粉包被结构域的融合多肽。
本发明还包括本发明植物的产品，该产品包含耐热植酸酶。产品优选为种子、谷粒或果实。产品可以是一个植物，尤其是杂交植物和近交植物。产品还可以是包含本发明耐热植酸酶的谷粒加工产品，如前文所述的玉米谷粒加工产品和油料种子谷粒加工产品，或者油料种子加工产品。
属于本发明范围的动物包括多胃动物，如牛，以及单胃动物，如猪、家禽(如鸡、火鸡、鹅、鸭、野鸡、松鸡、鹌鹑和鸵鸟)、马、绵羊、山羊、犬和猫，以及鱼和甲壳类动物。本发明中制备和/或采用的优选饲料或动物饲料包括家禽饲料和猪饲料。
饲料或食物中植酸酶的水平优选约50U/kg至5000U/kg，更优选为100U/kg至1200U/kg，或300U/kg至1200U/kg。
本发明还提供了通过本发明方法产生的转化植物。优选的是，转化植物是玉米、小麦或大豆植物。
附图简述

图1所示为在玉米种子中蓄积的、编码功能性植酸酶的密码子优化的玉米植酸酶基因(Nov9X)的表达。上图各柱表示从Nov9X转基因隔离(segregating)植物的6个谷粒中提取的总磷酸盐。下图总植酸酶活性(在计算活性之前减去磷酸盐背景)。1单位＝6个谷粒的总提取物释放的μmol磷酸盐/min。264A8C#14为阴性对照(缺少Nov9X转基因)；305A13包含质粒pNOV4057；305B11包含质粒pNOV4061。
图2表明玉米中产生的重组Nov9X植酸酶活性是热稳定的。单位的定义如图1所述。A.提取的总植酸酶活性。B.考马斯亮蓝染色的、提取物的SDS-PAGE凝胶。
图3比较了从干燥的谷粒获得的面粉提取物中的植酸酶水平。所有的植物都含有pNOV4057或pNOV4061。上图反应物中的磷酸盐浓度。下图植酸酶单位表示为释放的μmol磷酸盐/mg蛋白质/min。Nov9X拷贝#top4305A24A，2个拷贝；305B11A、20A、27A都＞3个拷贝。
图4所示为玉米中产生的植酸酶(Nov9X)的蓄积。该图比较了玉米面粉悬液和粉提取物中的植酸酶活性。266B-2E是阴性对照。上图中示出了所有样品中的磷酸盐浓度。纠正了阴性对照266-2E中存在的内源性磷酸盐后计算植酸酶单位。示出了各对照和处理的两个重复。从处理组的磷酸盐浓度中减去阴性对照的磷酸盐浓度，确定由于植酸酶的活性所释放的磷酸盐(下图)。
图5所示为Nov9X的胚乳特异性表达。该图所示为T2胚乳和胚提取物中的植酸酶(Nov9X)活性。提取两个重复样品(定为1和2)。
图6显示玉米表达的Nov9X植酸酶在加热胚乳提取物的过程中是稳定的，高度富集在加热上清液的可溶性级分中。A.未加热和加热样品的植酸酶活性。B.未加热和加热样品的植酸酶比活。
图7所示为包含2个事件的几个株系中的植酸酶活性(FTU/g)。各数据点表示将10个谷粒磨碎所获得的1g面粉中提取的植酸酶活性。对于每个株系来说，重复磨碎10个谷粒样品(样品1和2)。近交ID取代了之前版本中使用的传粉者、维持者和不育者。
图8A、8B和8C所示为从三个21天鸡饲养试验中获得的饲料转化率(FCRs)，说明了补充玉米植酸酶的益处。FCRs表示为LS均值。可利用磷阳性对照，0.400％；阴性对照，0.225％。往低磷饮食(0.225％可利用磷＝阴性对照)的样品中加入磨碎的转基因玉米，制备补充植酸酶的饮食。阴性对照饮食和补充酶的饮食之间的区别是加入了包含Nov9X植酸酶的、磨碎的转基因玉米。
图8A将完整的转基因玉米粒磨成面粉，配制植酸酶。然后将面粉直接加到饮食浆(低磷)中，充分混匀。用饮食浆饲养动物，测定第21天的增重量。三角形从包含载体pNOV4057的玉米种子获得的面粉。菱形从包含载体pNOV4061的玉米种子获得的面粉。
图8B在蒸汽处理和制粒之前将磨碎的玉米加入到低磷鸡饲料中。方形从包含pNOV4061的玉米种子获得的玉米面粉。菱形从包含pNOV4057的玉米种子获得的玉米面粉。
图8C在蒸汽处理和制粒之前将磨碎的玉米加入到低磷鸡饲料中。将包含植酸酶(质粒pNOV4057编码)的玉米种子磨成不同平均颗粒大小，从细的面粉至粗的磨碎谷粒。菱形精细研磨物(粉末)；方形中等程度研磨物，三角形粗糙研磨物。粗糙研磨物主要由＞2000微米的颗粒组成。中等程度研磨物大小主要在500～2000微米之间。精细研磨物＜500微米。
发明详述I.定义“水平改变”指转化或转染细胞或生物中的表达水平和正常或未转化细胞或生物的表达水平不同。
术语“植物特征改变”指和野生型、未转化或未转染植物宿主相对的转基因植物中的任意表型或基因型发生改变。
“反义抑制”指反义RNA转录物的产生能够抑制蛋白质从内源基因或转基因的表达。
“嵌合的”用来指DNA序列，如载体或基因由多个不同来源的DNA序列组成，这些DNA序列通过重组DNA技术融合在一起形成一个非天然存在的DNA序列。术语“嵌合基因”指包含1)DNA序列，包括自然界中并不在一起的调控序列和编码序列，或2)编码非天然连接的部分蛋白质或3)非天然连接的部分启动子的任意基因。相应地，嵌合基因可以包含具有不同来源的调控序列和编码序列，或包含具有相同来源的调控序列和编码序列，但是其排列方式和自然界中的不同。
“整合入染色体”指外源基因或DNA构建体通过共价键向宿主DNA的整合。在基因不是“整合入染色体”的情况下，可以“瞬时表达”。基因的瞬时表达指未整合到宿主染色体中、而作为自主复制质粒或表达盒，例如，或作为另一个生物系统如病毒的一部分独立行使功能的基因的表达。
“克隆载体”典型地包含一个或一些限制性内切酶识别位点以及适于用作鉴定和选择转化有克隆载体的细胞的标记基因，外源DNA序列能够以可确定的方式插入这些限制性内切酶位点中，而不丧失载体的必需生物功能。标记基因典型地包括赋予抗生素抗性，如四环素、潮霉素或氨苄霉素抗性的基因或选择转化细胞的其他手段。
“编码序列”指编码特定氨基酸序列、而不包括非编码序列的DNA或RNA序列。它可以组成“未打断的编码序列”，即cDNA中不含内含子，或包括边界上有适当剪接位点的一个或多个内含子。“内含子”是原始转录物中包含的RNA序列，通过对细胞中的RNA进行切割和重新连接将之去除，产生能够翻译成蛋白质的成熟mRNA。
“组成性表达”指使用组成性或调控性启动子的表达。“条件”和“调控表达”指受调控性启动子控制的表达。
“组成性启动子”指能够在植物的整个或几乎整个发育阶段中在全部或几乎全部植物组织中控制基因表达的启动子。每个转录激活元件都不表现出绝对的组织特异性，而是可以介导多数植物部分的转录激活，其水平不低于转录最为活跃的植物部分所达到水平的1％。
术语“接触”指将核酸片段导入细胞的任意已知或所述方法。
“表达”指植物中内源性基因或转基因的转录和/或翻译。例如，在使用反义构建体的情况下，表达仅指反义DNA的转录。表达还指反义(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定蓄积。
这里所用的“表达盒”指能够指导特定核苷酸序列在适当宿主细胞中表达的DNA序列，包含目的核苷酸序列可操纵性相连接的启动子，其中目的核苷酸序列可操纵性地和终止信号相连接。它还典型地包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意思是其组分中至少一个组分和其他组分的至少一个是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但是以能够异源表达的重组形式获得。表达盒中核苷酸序列的表达可以在组成性启动子或诱导性启动子的控制之下，诱导性启动子仅在宿主细胞和某些特定的外来刺激剂相接触的时候起始转录。在多细胞生物的情况下，启动子还可以对特定组织或发育阶段具有特异性。
启动子(带有或不带有增强子)的“表达模式”是表明启动子在植物的哪个部位和哪个发育阶段起始转录的表达水平模式。当一个启动子的表达模式和另一个启动子的表达模式几乎没有重叠的情况下，则说这些启动子的表达模式是互补的。可以通过测定标准转录报道mRNA的“稳态”浓度来确定启动子的表达水平。这种测定方法是间接的，这是因为报道mRNA的浓度不仅依赖于其合成速度，还依赖于mRNA的降解速度。因此稳态水平是合成速度和降解速度的总体表现。
在转录的序列相同的情况下，可以认为降解速度是固定的，因此该值可以作为合成速度的指标。当通过这种方式比较启动子时，本领域的熟练技术人员便于使用的技术是杂交S1-RNAse分析、Northern印迹分析和竞争RT-PCR。这些技术并不代表所有可以使用的技术，但是描述了分析转录活性和mRNA表达水平的常用方法。
实际上所有启动子的转录起点分析表明转录通常并非从单个碱基起始，而是从或多或少成簇的起始位点开始，每个起始位点簇负责mRNA的一些起始点。由于这种分布依据启动子的不同而不同，各个群体中报道mRNA的序列各自不同。既然各个mRNA物种或多或少易于降解，对于不同的报道mRNA来说没有单一的降解速度而言。研究表明对于不同的真核启动子序列而言，起始位点(“起始子(initiator)”)周围的序列在决定特异启动子指导的RNA表达水平方面起重要作用。起始位点还包括部分转录的序列。启动子和报道序列的直接融合会导致亚最佳水平的转录。
“5’非编码区“指位于编码区5’端(上游)的核苷酸序列。它存在于起始密码子上游的完全加工mRNA中，会影响原始转录物向mRNA的加工、mRNA的稳定性或翻译效率(Turner et al.，1995)。
术语“基因”广义上指和生物功能相关的任意核酸片段。因此，基因包括编码序列和/或其表达所需的调控序列。例如，基因指表达mRNA、特定蛋白质的核酸片段，包括调控序列。基因还包括不表达的DNA片段，例如形成其他蛋白质的识别序列。基因的获得有多种来源，包括从目的材料克隆，或从已知或预测的序列信息合成，它包括具有所需参数的序列。
“遗传稳定”和“可遗传的”指整合入染色体的遗传元件，它们稳定存在于植物中，连续数代通过子代进行稳定的遗传。
“基因组”指生物的全部遗传物质。
“胚系细胞”指能够形成配子、其遗传物质能够遗传的细胞。
这里所用的术语“异源DNA序列”、“外源DNA片段”或“异源多聚核酸”各自指来源和特定宿主细胞不同的序列，或者如果来源相同，对其原始形式进行了修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包括对于特定宿主细胞来说是内源的，但是通过使用DNA改组加以修饰的基因。该术语还包括非天然存在的、多拷贝的天然存在的DNA序列。因此，该术语指对于细胞来说为外源或异源的DNA片段，或对于细胞来说是同源的，但是在宿主细胞核酸的一个位点上元件通常不存在DNA片段。外源DNA片段表达产生外源多肽。
“诱导性启动子”指能够在一个或多个细胞类型中被一个外来刺激剂，如化学物质、光、激素、应激或病原体所启动的调控性启动子。
“起始位点”是转录序列部分的第一个核苷酸的位置，即+1位置。基因的其他所有序列及其控制区都相对于该位点加以编号。下游序列(即3’方向上的进一步蛋白质编码序列)定为正的，而上游序列(5’方向上的多数控制区)定为负的。
术语“细胞内定位序列”指编码细胞内靶向信号的核苷酸序列。“细胞内靶向信号”是与蛋白质一起接翻译、并指导蛋白质向特定的亚细胞区室定位的氨基酸序列。“内质网(ER)停运信号”指多肽的一段羧基末端延伸序列，翻译后和多肽相连接，使蛋白质进入分泌途径，停留在ER中。“ER停运序列”指编码ER靶向信号的核苷酸序列。其他的细胞内靶向序列编码在种子和/或叶子中活跃的靶向信号和液泡靶向信号。
本发明包括分离的或基本纯化的核酸或蛋白质组合物。在本发明的上下文中，“分离的”或“纯化的”核苷酸是通过人为处理脱离其天然环境的多聚核酸片段或多肽，因此不是天然产物。分离的多聚核酸片段或多肽可以是纯化形式的，也可以存在于非天然环境中，例如转基因宿主细胞。举例来说，“分离的”或“纯化的”多聚核酸片段或蛋白质或其生物活性部分当通过重组技术生产时，基本上游离于其他的细胞物质或培养基，或者，当通过化学合成时，基本上游离于化合物前体或其他化合物。优选的是，“分离的”多聚核酸(优选蛋白质编码序列)游离于获得核酸的生物基因组中天然状态下位于核酸旁侧的序列(即位于核酸5’和3’末端的序列)。举例来说，在各个实施方案中，分离的核酸分子包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的、获得核酸的生物基因组中天然状态下位于核酸旁侧的核苷酸序列。基本上游离于细胞物质的蛋白质包括具有约30％、20％、10％、5％(干重)杂质蛋白的蛋白质或多肽制剂。但重组产生本发明的蛋白质或其生物活性片段(如催化活性)时，优选的培养基包含少于30％、20％、10％、5％(干重)的化学前体或非目的蛋白化合物。公开的核苷酸序列的片段和变体及其编码的蛋白质或部分长度的蛋白质也包括在本发明的范围之内。“片段”指的是部分核苷酸序列或部分氨基酸序列，及其编码的部分多肽或蛋白质。
“标记基因”编码可选择或可筛选特征。
术语“成熟”蛋白指翻译后加工后不具有其信号肽的蛋白质。“前体”蛋白指mRNA翻译的初始产物。“信号肽”指多肽的氨基端延伸序列，翻译后和多肽相连接，形成前体肽，是多肽进入分泌途径所必需的。术语“信号序列”指编码信号肽的核苷酸序列。
术语“天然基因”指存在于未转化细胞基因组中的基因。
“天然存在”用来描述能够在自然界中发现、和人为加工的物体不同的物体。例如，存在于生物(包括病毒)中、能够从天然材料中分离的蛋白质或核苷酸序列，这些序列未经过实验室中的人为修饰，是天然存在的。
Nov9X和Nov9x互换使用。
术语“多聚核苷酸”、“核酸”、“多聚核酸”或“多聚核酸片段”指单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸及其共聚物，由包含糖、磷酸和碱基的单体(核苷酸)组成，碱基可以是嘌呤或嘧啶。如非特意限制，该术语包括包含天然核苷酸已知类似物的核酸，这些天然核酸类似物具有和参照核酸类似的结合特征，和天然存在的核苷酸代谢方式类似。如非另外指明，特定的核酸序列无疑还包括其保守修饰的变体(如简并密码子替换)和互补序列以及明确指定的序列。具体地说，一个或多个选定的(或所有)密码子的第三个位置上的碱基替换为混合碱基和/或脱氧肌苷残基而产生的序列(Batzer et al.，1991；Ohtsuka et al.，1985；Rossolini et al.，1994)。
“核酸片段”是给定核酸分子的一部分。在高等植物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)参与将DNA中包含的信息转移至蛋白质。“基因组”是生物的每个细胞中所包含的遗传物质的总体。术语“核苷酸序列”指单链或双链的DNA或RNA多聚物，可选择性地包含能够掺入到DNA或RNA多聚物中的合成的、非天然的或改变了的核苷酸碱基。术语“核酸”或“核酸序列”还可以和基因、cDNA、DNA和基因所编码的RNA互换使用(Batzeret al.，1991；Ohtsuka et al.，1985；Rossolini et al.，1994)。
将本发明编码植酸酶的开放阅读框导入宿主细胞所采用的表达盒优选包含和开放阅读框可操纵性相连接的转录起始区。这种表达盒可以具有多个限制性位点，以便插入开放阅读框和或其他DNA，如转录调控区和/或选择标记基因。
转录序列盒包括5’-3’方向的转录、转录和翻译起始区、目的DNA序列以及在植物中发挥作用的转录和翻译终止区。终止区可以是转录起始区天然具有的，可以是目的DNA序列天然具有的，或来自其他来源。对于植物细胞来说，便于使用的终止区可以从根瘤土壤杆菌的Ti质粒获得，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见Guerineau etal.，1991；Proudfoot，1991；Sanfacon et al.，1991；Mogen et al.，1990；Munroe et al.，1990；Ballas et al.，1989；Joshi et al.，1987.
术语“开放阅读框”和“ORF”指编码序列的翻译起始密码子和终止密码子之间的序列所编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”指编码序列中三个相邻核苷酸单位(“密码子”)，分别指定蛋白质合成(mRNA翻译)的起始和链终止。
“可操纵性连接”用于核酸时，指作为同一核酸分子的一部分相连接，使位置和取向适于从启动子处起始转录。可操纵性和启动子相连接的DNA位于启动子“转录起始调控之下”。编码序列以正义或反义取向可操纵性地和调控序列相连接。当用于多聚核苷酸时，“可操纵性连接”指作为同一多聚核苷酸的一部分相连接，即通过肽键相连接。
“超表达”指转基因细胞或生物中的表达水平超过正常或未转化细胞或生物中的表达水平。
已知的聚合酶链式反应“PCR”方法包括但不局限于使用成对引物、巢式引物、单特异引物、简并引物、基因特异引物、载体特异引物、部分错配引物等。还参见Innis et al.，1995；Gelfand，1995和Innisand Gelfand，1999。
“植物组织”包括分化的和未分化的植物组织，包括但不局限于根、茎、芽、叶、花粉、种子、瘤组织和各种形式的细胞和培养物，如单个细胞、原生质体、胚和愈伤组织。植物组织可以是存在于植物或器官中，组织或细胞培养物中。
“原代转化体”和“T0代”指和最初转化的组织属于同一遗传代的转基因植物(即转化后还没有经过减数分裂和受精)。
“产品组织”指有不分裂、末端分化的细胞组成的成熟且可收获的组织。它不包括由胚系、有丝分裂的、未完全分化的细胞组成的幼小且正在生长的组织。
“启动子”指通常位于编码序列上游(5’)的核苷酸序列，它通过提供RNA聚合酶和正确转录所需的其他因子的识别位点，控制编码序列的表达。“启动子”包括基本启动子，它由TATA盒和其他指明转录起始位点的序列组成，调控元件加到基本启动子上控制表达。“启动子”还指包括基本启动子和调控元件的核苷酸序列，它能够控制编码序列或功能性RNA的表达。这种类型的启动子序列由临近的和更远的上游元件组成，更远的上游元件通常称为增强子。相应地，“增强子”是能够刺激启动子活性的DNA序列，可以是启动子的固有元件，也可以是插入的、用来增强启动子水平或组织特异性的异源元件。它能够在两个方向(正常或翻转(flipped))上起作用，即使往启动子的上游或下游移动后也能够起作用。增强子和其他上游启动子元件和介导其效应的序列特异性DNA结合蛋白相结合。启动子可以整体来源于天然基因，或者由来源于自然界中存在的不同启动子的不同元件组成，甚至由合成的DNA片段组成。启动子还可以包含参与结合蛋白质因子的DNA序列，这些蛋白质因子对生理或发育条件产生应答，控制转录起始效率。
上游不活化的条件下无活性或启动子活性大大降低的启动子元件，尤其是TATA元件称为“基本或核心启动子”。在不存在适当的一个或多个转录因子的条件下，基本启动子发挥作用，允许转录。因此“基本或核心启动子”仅包括转录起始所需的所有基本元件，如TATA盒和/或起始子。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在这里可以互换使用。
“调控性启动子”指非组成性、而以时间和/或空间上调控的方式指导基因表达的启动子，包括组织特异性启动子和诱导性启动子。它包括天然和合成的序列，以及合成和天然序列的组合。不同的启动子可以指导不同组织或细胞类型、发育的不同阶段或不同环境条件刺激下的基因表达。在植物细胞中有用的各种类型的新启动子不断地得以发现，许多例子都可以在Okamuro等(1989)的汇编资料中找到。用于植物中的典型调控性启动子包括但不局限于safener诱导性启动子、来源于四环素诱导系统的启动子、来源于水杨酸诱导系统的启动子、来源于乙醇诱导系统系统的启动子、来源于糖皮质激素诱导系统的启动子、来源于病原体诱导系统的启动子和来源于蜕皮素诱导系统的启动子。
“调控序列”和“适当的调控序列”各自指位于编码序列上游(5’非编码序列)、内部或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，它们影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。调控序列包括增强子、启动子、翻译前导序列、内含子和多聚腺苷酸化信号序列。它们包括天然的和合成的序列，以及合成和天然序列的组合序列。正如前面所指出的，术语“适当的调控序列”不局限于启动子。本发明中用在植物中的一些适当调控序列包括但不局限于组成性植物启动子、植物组织特异性启动子、植物发育特异性启动子、诱导性植物启动子和病毒启动子。
术语“RNA转录物”指RNA聚合酶催化DNA序列的转录产物。当RNA转录物是DNA序列的完全互补的拷贝时，称作原始转录物；RNA转录物还可以是来源于原始转录物转录后加工的RNA序列，称作成熟RNA。“信使RNA”(mRNA)指不带有内含子、能够被细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA互补且来源于mRNA的单链或双链DNA。
“二代转化体”和“T1、T2、T3等代”指原代转化体通过一个或多个减数分裂或受精周期所产生的转基因植物。它们可以通过原代转化体或二代转化体自体受精来产生，或者通过将原代转化体或二代转化体和其他转化或未转化的植物相杂交来产生。
“特异性表达”是局限于一种或几种植物组织(空间限制)和/或一个或几个植物发育阶段(时间限制)的基因产物的表达。得到承认的是几乎没有绝对的特异性存在启动子似乎优选在某些组织中启动，而在其他组织中可以没有或仅有一点活性。这种现象称作泄漏表达。但是，本发明中的特异性表达指的是优选在一种或几种植物组织中表达。
“稳定转化”指转化后在选择培养基上选择并再生的细胞。
“3’非编码序列”指位于编码序列3’端(下游)的核苷酸序列，包括多聚腺苷酸化信号和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。多聚腺苷酸化信号的特征通常是影响多聚腺苷酸向mRNA前体的3’末端的加入。Ingelbrecht等(1989)例举了不同3’非编码序列的使用。
“组织特异性启动子”指并非在所有的生物细胞中表达的调控性启动子，如不在所有植物细胞中表达，而仅在特定器官(如叶和种子)的一个或多个细胞类型、特定组织(如胚或子叶)或特定细胞类型(如叶薄壁组织或种子储藏细胞)中表达的调控性启动子。这些还包括时间上受调控的启动子，如在早期或晚期胚形成中、果实成熟形成种子或果实的过程中、完全分化的叶中或开始衰老的时候。
“转录停止片段”指包含一个或多个调控信号如多聚腺苷酸化信号序列、能够终止转录的核苷酸序列。例子包括编码胭脂碱合酶的基因3’非调控区和核酮糖二磷酸羧化酶。
术语“转化”指核酸片段向宿主细胞基因组中转移，产生遗传稳定的遗传性。包含转化的核酸片段的宿主细胞称为“转基因”细胞，包含转基因细胞的生物称为“转基因生物”。举例来说，转化植物和植物细胞的方法包括土壤杆菌介导的转化(De Blaere et al.，1987)和基因枪技术(Klein et al.，1987；美国专利No.4,945,050)。但是，许多其他的细胞转化方法也是本领域已知的。可以通过本领域的熟练技术人员所熟知的方法从转基因细胞再生完整的植物(例如参见Frommet al.，1990)。
“转化的”、“转基因的”和“重组体”指已经导入异源核酸分子的宿主生物，如植物。可以通过本领域中普遍已知的、Sambrook等，1989中公开的方法将核酸分子稳定地整合到基因组中。例如，“转化的”“转化体”和“转基因的”植物或愈合组织已经经受转化过程，包含整合到其染色体中的外源基因。术语“未转化的”指没有经受转化过程的正常植物。
“转基因”指已经通过转化导入基因组并稳定维持的基因。举例来说，转基因包括对于待转化的特定植物基因来说为异源的或同源的基因。另外，转基因还包括插入到非天然生物中的天然基因或嵌合基因。术语“内源性基因”指存在于生物基因组的天然位置上的天然基因。“外源”基因指正常情况下在宿主生物中不存在，通过基因转移导入的基因。
“转基因植物”是具有包含异源DNA序列的一个或多个植物细胞的植物。
“瞬时表达“指通过病毒感染或通过土壤杆菌介导的转化、电穿孔或基因枪轰击之类的方法导入了的转基因在细胞中的表达，但是不选择其稳定的维持状态。
术语“瞬时转化”指导入(例如通过土壤杆菌介导的转化或基因枪轰击之类的方法)的表达盒、多聚核苷酸或转基因在细胞中的表达，但是不选择其稳定的维持状态。
术语“翻译前导序列”指基因中位于启动子和编码序列之间、能够转录成RNA并存在于完全加工的mRNA翻译起始密码子上游(5’)的部分DNA序列。翻译前导序列影响原始转录物向mRNA的加工、mRNA的稳定性和翻译效率。
“翻译停止片段”指包含一个或多个调控信号、能够终止翻译的核苷酸序列，如所有三个框架上的一个或多个终止密码子。将翻译停止片段插入到编码序列5’端起始密码子的附近或临近部位将停止翻译或导致错误的翻译。通过位点特异性重组切除翻译停止片段，会在编码序列中留下不干扰使用起始密码子进行正确翻译的位点特异序列序列。
表现出“植酸酶”活性的多肽或酶，或“植酸酶”涵盖了能够影响无机磷酸盐或磷从各种肌醇磷酸盐中释放的任意酶。这种肌醇磷酸盐(植酸酶底物)的例子包括植酸及其盐，如植酸钠盐或植酸钾盐或混合的盐。肌醇的单磷酸盐、二磷酸盐、三磷酸盐、四磷酸盐或五磷酸盐也可以用作植酸酶的底物。根据上述定义，使用任意分析方法来测定植酸酶活性，这些分析中使用上述的一种底物。
本发明的耐热植酸酶包括来源于特定耐热植酸酶的突变多肽，这些突变多肽可以通过在天然蛋白质的N末端和/或C末端删除(称作截短)或添加一个或多个氨基酸；在天然蛋白质的一个位点上删除或添加一个或多个氨基酸；在耐热植酸酶的一个或多个位点上替换一个或多个氨基酸而获得。举例来说，这种变体可以通过人为操作产生。这种操作方法通常是本领域已知的。例如，可以通过DNA中的突变来植被多肽的氨基酸序列变体。诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域所熟知的。例如参见Kunkel，1985；Kunkel et al.，1987；美国专利No.4,873,192；Walker和Gaastra，1983和其中所引用的参考文献。Dayhoff等，1978的模型中对不影响目的蛋白质生物活性的适当氨基酸替换作了指导，在此引入作为参考。优选保守替换，如将一个氨基酸替换为另一个具有相似特征的氨基酸。
因此，本发明的耐热植酸酶基因和核苷酸序列包括天然存在的序列，以及突变的序列。类似的，本发明的耐热植酸酶多肽包括天然存在的蛋白质及其突变和修饰形式。这种变体仍具有所需的活性。这里多肽序列的缺失、插入和替换并不希望发生多肽特征中的基本改变。但是，当难以提前预测替换、缺失或插入的确切效应时，本领域的熟练技术人员明白可以通过常规的筛选分析来评价这种效应。
本发明的核酸分子已经过优化，以增强在目的生物中的表达。对于植物来说，例如参见EPA035472；WO 91/16432；Perlak et al.，1991和Murray et al.，1989。通过这种方式，可以使用植物的优先密码子来合成基因或基因片段。例如参见Campbell和Gowri，1990对宿主优先密码子惯用性的讨论。人们认识到可以优化或合成全部或部分基因序列。也就是说，还可以使用合成的或部分优化的序列。突变核苷酸序列和蛋白质还包括来源于诸如DNA改组之类诱变或重组生成方法的序列和蛋白质。使用这种方法，可以对一个或多个不同的编码序列进行操作，产生具有所需特征的新的多肽。通过这种方式，从相关序列多聚核苷酸的群体产生重组多聚核苷酸文库，其中相关序列多聚核苷酸内群体包括具有基本序列相同性的序列区域，可以在体外或体内进行同源重组。这种DNA改组的方法是本领域所已知的。例如参见Stemmer，1994；Stemmer，1994；Crameri et al.，1997；Moore et al.，1997；Zhang et al.，1997；Crameri et al.，1998，以及美国专利Nos.5,605,793和5,837,458。
“变体”指基本上相似的序列。对于核苷酸序列来说，变体包括由于遗传密码子的简并性而编码和参照蛋白质的氨基酸序列相同的核苷酸序列。这些天然存在的等位变体可以使用熟知的分子生物学技术进行鉴定，例如使用聚合酶链反应(PCR)和杂交技术进行鉴定。变体核苷酸序列也包括合成的核苷酸序列，诸如通过对编码参照蛋白质的序列以及编码具有氨基酸替换的多肽的序列进行定点诱变所产生的核苷酸序列。通常，本发明的核苷酸序列变体将具有和天然核苷酸序列相比至少40％、50％、60％，优选70％，较优选80％，更优选90％，最优选99％，以及在这些分级的基础上增加一个百分单位的相同性。例如，71％、72％、73％等，直至至少90％级别。变体还可以包括和鉴定到的基因片段相对应的全长基因。
“载体”包括双链或单链、线形或环形、能够或不能够自我转移或移动、能够通过整合到细胞基因组上或存在于染色体外(带有复制起点的自主复制质粒)的方式转化原核或真核宿主的质粒、粘粒、噬菌体或土壤杆菌双元载体。
本发明的优选构建体和宿主细胞本发明优选提供表达盒，该表达盒包括能够指导编码耐热植酸酶的多聚核苷酸在体外或体内表达的核酸序列(启动子)。如这里下文所述，本发明优选的多聚核苷酸作了优化，能够在特定的生物，如植物中表达。制备和/或鉴定耐热植酸酶的方法包括诱变，如递归(recursive)诱变和/或选择或筛选在高于60℃的温度下具有活性的植酸酶。诱变和核苷酸序列突变的方法是本领域所熟知的。例如参见Kunkel，1985；Kunkel et al.，1987；美国专利No.4,873,192；Walker andGaastra，1983和其中所引用的参考文献以及Arnold et al.，1996。一旦鉴定到了编码耐热植酸酶的多聚核苷酸，就将多聚核苷酸的序列加以优化。优化核酸片段在特定生物中表达的方法是本领域中所熟知的。简要地说，获得靶生物使用最佳密码子的密码子惯用性表，选择最佳密码子置换靶多聚核苷酸中的密码子，然后化学合成优化的序列。美国专利No.5,625,136中介绍了玉米的优先密码子。
用于转化的DNA和宿主细胞用于转化细胞的载体、质粒、粘粒、YAC(酵母人造染色体)、BAC(细菌人造染色体)和DNA片段通常包含人们需要导入细胞的、编码植酸酶的DNA以及cDNA、基因或多个基因之类的其他DNA。这些DNA构建体可以进一步包括启动子、增强子、多接头之类的结构，必要时甚至包括调控基因。选择导入细胞的其中一个DNA片段或基因经常编码在产生的转化(重组)细胞中表达的蛋白质，产生一个可筛选的或可选择的特征，和/或改善转化细胞和/或从转化细胞再生的植物的一个表型。但是，情况并非总是如此，本发明还包括含有非表达性转基因的转化细胞和植物。
用来导入细胞的DNA包括来源于或自任意材料分离的DNA，随后分析其结构、大小和/或功能，化学改变，之后导入植物中。举例来说，“来源于”一种材料的DNA是鉴定为能够用在给定生物中的DNA序列，该序列能够以基本纯化的形式化学合成。举例来说，“分离自”一种材料的DNA是通过化学手段从所述材料切除或去除的有用DNA序列。这些化学手段可以是使用限制性内切酶，以便对其进行进一步操作；也可以通过基因工程方法进行扩增，用于本发明。这种DNA通常称为“重组DNA”。
因此有用的DNA包括全合成的DNA、半合成的DNA、分离自生物材料的DNA和来源于导入之RNA的DNA。通常，导入的DNA最初不存在于作为DNA接受者的基因型中，但是从给定基因型分离基因、随后将多拷贝的基因导入同一基因组来增强给定基因产物的生成属于本发明的范围。
导入的DNA包括但不局限于来源于植物基因的DNA和来源于非植物基因的DNA，如来源于细菌、酵母、真菌、动物或病毒。导入的DNA可以包括修饰的或合成的基因，部分基因或嵌合基因，包括来自相同或不同基因型的基因。术语“嵌合基因”或“嵌合DNA”指由至少两个DNA序列或片段组成的基因或DNA序列或片段，提供DNA序列或片段在天然条件下并不合并DNA，或者DNA序列或片段的定位或连接方式在未转化细胞的天然基因组中是非正常发生的。
这里用作转化的导入DNA可以是环形或线形、双链或单链的。通常，DNA以嵌合DNA，如还包括编码区的质粒DNA，其中编码区旁侧具有启动转化细胞中重组DNA表达的调控序列。例如，DNA可以自身包含或包括在细胞中活化的启动子，该启动子来源于该细胞之外的其他材料，还可以使用转化靶细胞中已经存在的启动子。
通常，导入的DNA相当小，小于30kb，使其对物理、化学或酶降解的敏感性降至最低，这是因为这种敏感性随着DNA大小的增加而增加。导入细胞的蛋白质、RNA转录物或其混合物的数目优选提前选择，限定形成1至约5～10个导入DNA的这种产物。
适当表达载体的选择将依赖于宿主细胞。典型地，一个表达载体包含(1)编码细菌复制起点的原核DNA元件，和用于在细菌宿主中扩增和选择表达载体的抗生素抗性基因；(2)控制转录起始的DNA元件，如启动子；(3)控制转录物加工的DNA元件，如内含子、转录终止/多聚腺苷酸化序列；和(4)可操纵性与控制转录起始的DNA元件相连接的目的基因。使用的表达载体可以是能够在上述宿主中自主复制的表达载体，也可以是能够整合到染色体中的表达载体，其起初在促使相连植酸酶基因转录的位置上包含一个启动子。
如果细菌之类的原核生物用做宿主，植酸酶的表达载体优选能够在微生物中自主复制的表达载体，包含启动子、核糖体结合序列、新的植酸酶基因和转录终止序列。载体还可以包含调控该启动子的基因。
Gruber等(1993)对植物表达载体和报道基因作了一般介绍。
哺乳动物表达载体可以包含复制起点、适当的启动子和增强子和必要的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’旁侧非转录序列。
举例来说，适当的载体包括细菌载体pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBluescript II(Statagene)、pTRC99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T(Pharmacia)；真核细胞载体pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40(Pharmacia)。举例来说，商品化的载体包括例如pKK223-3(Pharmacia精细化学试剂，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，Wis.，USA)。但是，也可以是其他的质粒或载体，只要这些质粒或载体能够在宿主中复制和存活。
在某些实施方案中，在单子叶植物转化中可以考虑采用有复制能力的病毒载体。举例来说，这些载体包括小麦矮小病毒(WDV)“穿梭”载体，如pW1-11和pW1-GUS(Ugaki et al.，1991)。这些载体能够在玉米细胞以及大肠杆菌中自主复制，这样将增加检测转运至转基因细胞中DNA的灵敏性。复制载体还可用来运送旁侧带有来自于Ac、Ds或Mu之类转座元件的DNA序列的基因。还可考虑使用转座元件来导入DNA片段，该DNA片段缺少选择和维持细菌中质粒载体所必需的元件，如抗生素抗性基因和DNA复制起点。还建议使用Ac、Ds或Mu之类的转座元件，这些元件能够活跃地驱动DNA的整合，从而增加稳定转化细胞出现的频率。
适当宿主的代表性例子如下细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌；和埃希杆菌属、假单胞菌属、沙雷菌属、链霉菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、芽孢杆菌属、微杆菌属和葡萄球菌属中的各个物种，但也可以选用其他属的物种；属于曲霉属、根霉菌属、木霉属、链孢霉属、毛霉菌属、青霉属等的真菌细胞；属于克鲁维酵母菌属、酵母属、裂殖酵母属、毛孢子菌属、许旺酵母菌属的酵母；诸如果蝇S2和夜蛾Sf9之类的昆虫细胞；诸如CHO、COS或黑色素瘤、C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系之类的动物细胞；植物细胞，等等。可以使用任意宿主，只要它能够表达目的基因。
从本发明可以看出，本发明中采用的载体构建方法对于本领域的技术人员是已知的(参见Sambrook et al.，1989；Gelvin et al.，1990)。
本发明的表达盒可以包含一个或多个限制性位点，使得编码耐热植酸酶的多聚核苷酸位于调控序列的调控之下。该表达盒还可以包含和多聚核苷酸可操纵性相连接的终止信号，以及多聚核苷酸正确翻译所必需的调控序列。包含本发明多聚核苷酸的表达盒可以是嵌合的，意思是其至少一个组分和其他组分中的至少一个是异源的。表达盒中多聚核苷酸的表达可以位于组成性启动子、诱导性启动子、调控性启动子、组织特异性启动子、病毒启动子或合成启动子的调控之下。
表达盒可以包括5’-3’方向的转录、转录和翻译起始区、本发明的多聚核苷酸和转录和翻译终止区，它们在体内或体外具有功能。终止区可以是转录起始区天然配套的，或者来源于其他的材料。
调控序列可以位于编码序列的上游(5’非编码序列)、内部(内含子)或下游(3’非编码序列)，影响相关编码序列的转录、RNA加工和稳定性和/或翻译。调控序列可以包括但不局限于增强子、启动子、阻遏蛋白结合位点、翻译前导序列、内含子和多聚腺苷酸化信号序列。它们可以包括天然序列和合成序列，以及合成序列和天然序列的组合序列。
用在本发明中的载体还包括用于扩增表达的适当序列。
调控序列启动子是一种核苷酸序列，它通过提供正确转录所需的RNA聚合酶和其他因子的识别位点来控制编码序列表达。启动子包括基本启动子，它仅由转录起始所需的所有基本元件组成，如TATA盒和/或起始子，由TATA盒和其他指明转录起始位点的序列组成，调控元件加到基本启动子上控制表达。启动子可以全部来自于天然基因，或者由来自自然界中不同启动子的不同元件组成，甚至由合成的DNA片段组成。启动子可以包含参与结合蛋白质因子的DNA序列，这些序列对生理或发育条件作出应答，控制转录起始效率。启动子还包括基本启动子和一个或多个调控元件，该调控元件能够控制编码序列或功能性RNA的表达。这种类型的启动子序列由临近的和更远的上游元件组成，后者通常称为增强子。
代表性的启动子包括但不局限于能够在原核细胞或真核细胞或其病毒中控制基因表达的启动子。具体的细菌启动子包括大肠杆菌的lac或trp，λ噬菌体PL启动子、lacI、lacZ、T3、T7、gpt和λPR。真核启动子包括CMV即早启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-I启动子。另外，还可以将人CMV中IE基因的增强子和启动子一起使用。
可以将能够在酵母宿主中表达的任意启动子用作启动子。其例子包括己糖激酶基因的启动子和糖酵解途径中的类似启动子，gal 1启动子、gal 10启动子、热休克蛋白启动子、MFα-1启动子和CUP 1启动子。
可以使用能够在发酵真菌中表达的启动子。例子是淀粉或纤维素强诱导性的启动子、如曲霉属葡糖淀粉酶或α-淀粉酶或者木霉属纤维素酶(纤维二糖水化酶(cellobiohydrase))的启动子，糖酵解途径中酶的启动子，如磷酸甘油酸激酶(pgk)和甘油醛-3磷酸脱氢酶(gpd)等的启动子。
植物启动子区有几个结构域是启动子完全发挥功能所必需的。其中的第一个结构域紧邻着结构基因的上游，形成包含共有序列的“核心启动子区”，正常情况下是基因即上游的70个碱基对。核心启动子区包含特征性CAAT和TATA盒及其周围序列，代表限定结构基因转录起点的转录起始序列。
核心启动子区的存在是将一个序列定义为启动子的标记如果该区域缺失，则启动子不具有功能。另外，核心启动子不足以提供完全的启动子活性。核心上游的一系列调控序列组成启动子的其余部分。调控序列决定表达水平，表达的空间效应和时间模式，对于重要的启动子亚组来说，还决定诱导条件下的表达(诸如光、温度、化合物、激素之类外界因子的调控)。
已知一系列天然存在的启动子能够在植物中起作用，已经用于驱动植物中异源(外源和内源)基因的表达例如，组成性35S花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子、成熟增强的番茄多聚半乳糖醛酸酶启动子(Bird et al.，1988)、E8启动子(Diekman & Fischer，1988)和果实特异性2A1启动子(Pear et al.，1989)和其他许多启动子。
调控表达的两个主要方法是已知的，即超表达和表达不足。通过插入一个或多个额外拷贝的选定基因可以实现超表达。但是，尚不清楚最初转化有一个或多个额外拷贝核苷酸序列的植物或其子代是表现为表达不足的效应还是超表达效应。对于表达不足来说存在有两个主要方法，本领域中通常称为“反义下调”和“正义下调”(正义下调也称“共阻遏”)。一般来说，这些方法称为“基因沉默”。这两种方法都对靶基因的表达具有抑制作用。
在适当植物组织中实现足够水平转基因的表达是产生遗传改造作物的一个重要方面。异源DNA序列在植物宿主中的表达依赖于操纵性相连接的、在植物宿主中具有功能的启动子的存在。启动子序列的选择将决定异源DNA序列在生物中表达的时间和部位。
因此，用于指导给定转基因表达的启动子的选择是关键性的。用于植物转基因表达的启动子包括诱导性的、病毒的、合成的、组成性的(Odell et al.，1985)、时间上受调控的、空间上受调控的、组织特异性的以及时间-空间上受调控的启动子。
当需要在特定组织和器官中表达时，可以使用组织特异性启动子。相比之下，当需要在刺激物的刺激下进行基因表达时，诱导性启动子是首选的调控元件。当需要在植物的所有细胞中进行持续表达时，则使用组成性启动子。转化载体的表达构建体中还何以包括核心启动子序列上游和/或下游的其他调控序列，使异源核苷酸序列在转基因植物中的表达水平不同。
已经介绍了具有不同表达特征的许多植物启动子。已经介绍的一些组成性启动子包括水稻肌动蛋白1(Wang et al.，1992；美国专利No.5,641,876)、CaMV 35S(Odell et al.，1985)、CaMV 19S(Lawton etal.，1987)、蔗糖合酶和泛素启动子。
已经介绍的组织特异性启动子包括植物凝集素(Vodkin，1983；Lindstrom et al.，1990)、玉米醇脱氢酶1(Vogel et al.，1989；Dennis etal.，1984)、玉米集光复合体(Simpson，1986；Bansal et al.，1992)、玉米热休克蛋白(Odell et al.，1985)、豌豆RuBP羧化酶小亚基(Poulsenet al.，1986；Cashmore et al.，1983)、Ti质粒甘露糖醇合酶(Langridgeet al.，1989)、Ti质粒胭脂碱合酶(Langridge et al.，1989)、矮牵牛属植物查尔酮异构酶(vanTunen et al.，1988)、蚕豆甘氨酸富含蛋白1(Keller et al.，1989)、截短的CaMV 35s(Odell et al.，1985)、土豆块茎蛋白patatin(Wenzler et al.，1989)、根细胞(Yamamoto et al.，1990)、玉米醇溶蛋白(Reina et al.，1990；Kriz et al.，1987；Wandeltet al.，1989；Langridge et al.，1983；Reina et al.，1990)、球蛋白-1(Belanger et al.，1991)、α-微管蛋白、cab(Sullivan et al.，1989)、REPCase(Hudspeth & Grula，1989)、R基因复合物相关启动子(Chandler et al.，1989)和查尔酮合酶启动子(Franken et al.，1991)。
已经介绍的诱导性启动子包括ABA诱导性和膨胀诱导性启动子、生长素结合蛋白基因启动子(Schwob et al.，1993)、UDP葡萄糖黄酮糖基转移酶基因启动子(Ralston et al.，1988)、MPI蛋白质抑制因子启动子(Cordero et al.，1994)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(Kohler et al.，1995；Quigley et al.，1989；Martinez et al.，1989)。
已经报道了植物中的几个组织特异性受调控的基因和/或启动子。它们包括编码种子贮存蛋白(如napin、cruciferin、β-conglycinin、菜豆球蛋白)、醇溶蛋白或油体蛋白(如油质蛋白)的基因，或参与脂肪酸生物合成(包括酰基载体蛋白、硬脂酰-ACP脱氢酶及脂肪酸脱氢酶(fad2-1))的基因以及其它在胚发育期间表达的基因(如Bce4，可可参见EP255378和Kridl等，1991)。对幼苗特异性表达非常有用的是豌豆球蛋白启动子(Czako等，1992)。(也参见美国专利NO.5,625,136，其内容在此引入作为参考)。其他对于成熟叶中表达的有用启动子为衰老发生时启动的启动子，如来自于拟南芥的SAG启动子(Gan等，1995)。
美国专利NO.4,943,674讨论了果实发育过程中，至少到果实开始成熟前表达的一类果实特异性启动子，其公开的内容在此引入作为参考。优先表达于棉纤维的cDNA克隆也已分离出来(John等，1992)。来自于番茄并在果实发育期间表达有差异的cDNA克隆也分离出来并得以鉴定(Mansson等，1985，Slater等，1985)。果实成熟过程中多聚半乳糖醛酸酶基因的启动子处于活化状态。多聚半乳糖醛酸酶基因在美国专利NO.4,535,060、4,769,061、4,801,590及5,107,065均作了描述，其内容在此引入作为参考。
组织特异性启动子的其他实例包括叶子创伤(如咀嚼昆虫造成的创伤)后指导叶细胞中基因表达的启动子及指导结节(如patatin基因启动子)和纤维细胞中(E6是发育调控的纤维蛋白的实例之一(John等，1992))基因表达的启动子。虽然在叶、胚珠及花发现有低水平的E6转录产物，此基因在纤维中最为活跃。
一些“组织特异性”启动子的组织特异性可能并不是绝对的，本领域内的熟练技术人员可以用白喉毒素序列加以检验。也可将不同的组织特异性启动子联用获得带有“泄漏”表达的组织特异性表达(Beals等，1997)。本领域内的熟练技术人员可分离出其他组织特异性启动子(参见美国专利NO.5,589,379)。
最终，对于导入到单子叶基因组来说，最理想的DNA片段可能是编码所需性状(如蛋白、脂类或淀粉的水解)并引入至处于全新启动子或增强子控制之下的同源基因或基因家族，甚或是同源或组织特异性(如根、轴环/鞘、轮生体、茎、earshank、核心或叶特异性)的启动子或调控元件。实际上，可以想象得出本发明的具体用途之一将是以组成型或诱导型方式对一基因进行打靶。
对于转基因植物中组织特异性基因打靶来说，可用的载体典型地包括组织特异性启动子，还可能包括诸如增强子序列等其他组织特异性的调控元件。根据本发明所公布的内容，指导基因在某些组织中特异或增强表达的启动子对于本领域内的熟练技术人员来说将变得众所周知。例如，这些启动子包括绿色组织特异性的rbcS启动子，在根部或受伤叶组织中具有更高活性的ocs、nos及mas启动子，指导基因在根部增强表达的截短(-90～+8)35S启动子，指导基因在根部表达的α-微管蛋白基因，以及来自于玉米储存蛋白基因、指导基因在胚乳中表达的启动子。
将组成性表达的基因(所有组织中均表达)与一反义基因共同引入可以实现功能性的组织特异性表达，其中该反义基因仅在所述基因不需要表达的组织中表达。例如，可将编码脂肪酶的基因加以引入以便它可利用来自于菜花样花叶病毒的35S启动子在所有组织中表达。例如利用玉米醇溶蛋白启动子使脂肪酶基因的反义转录物在玉米核中表达，将阻止脂肪酶蛋白在种子中蓄积。因此，所导入基因编码的蛋白将在除了核之外的所有组织中存在。
转基因植物中某一基因的表达可能仅在该植物发育的一定时期内是需要的。发育同步常与组织特异基因表达相关联。例如，玉米储存蛋白约在授粉15天后开始在胚乳中表达。
有数种诱导性启动子在本领域内众所周知。Gatz(1996)对其中的许多均作了回顾(也参见Gatz，1997)。这些实例包括四环素阻遏子系统、Lac阻遏子系统、铜诱导系统、水杨酸盐诱导系统(如PPR1a系统)、糖皮质激素诱导系统(Aoyama T等，1997)和蜕皮激素诱导系统。苯硫胺诱导系统(NO.5364,780号美国专利)、醇诱导系统(WO 97/06269及WO 97/06268)及谷光甘肽S转化酶启动子也包含在内。在多细胞生物的情况一，启动子也可对特定组织、器官或发育阶段来说是特异的。此类启动子的实例包括但不限于玉米ADP-gpp和玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子。
其他研究集中于对诸如盐度升高、干旱、病原体及创伤(Graham等，1985，Graham等，1985，Smith等，1986)之类环境应激或刺激产生应答发生诱导性调控的基因。据报道受伤土豆植物叶中有金属羧肽酶抑制蛋白蓄积(Graham等，1981)。也有报道甲基茉莉酮酸酯、激发子(elicitor)、热休克、厌氧性应激或除草剂安全剂等均可诱导其他基因表达。
嵌合反式作用病毒复制蛋白的调控表达可为其他基因策略进一步调控。例如，Odell等1990所述Cre介导的基因活化。因而，Cre-介导的激动可去除包含在启动子和复制蛋白编码区间以lox位点连接的3’调控序列、阻止嵌合复制基因表达的DNA片段，使所述反式作用复制基因得以表达。在此情况下，嵌合Cre基因、嵌合反式作用复制基因或二者均可处于组织特异性或发育特异性或诱导性启动子的调控之下。另一种基因策略是使用tRNA抑制子基因。例如，如Ulmasov等，1997所述，tRNA抑制子基因的调控性表达可在一定条件下调控反式作用复制蛋白的表达，其中该复制蛋白基因编码含有合适终止子的序列。同样，嵌合tRNA抑制子基因、嵌合反式作用复制基因或二者均可处于组织特异性或发育特异性或诱导性启动子的调控之下。
除了使用特别的启动子之外，其他类型的元件也可影响转基因的表达。特别是内含子已证明具有增强转基因表达的潜能。例如，Callis等(1987)报道，来自于玉米乙醇脱氢酶基因的内含子，可以增强转基因植物细胞中转基因的表达。类似的，Vasil等(1989)报道来自于玉米蔗糖合酶基因的内含子具有类似的增强表达活性。大米肌动蛋白第一内含子已广泛用于在大量不同的转基因农作物中增强转基因的表达(McElroy等，1991)。
其他元件包括可被内源性物质或外源性物质如锌指蛋白等调控的元件，锌指蛋白包括天然存在的锌指蛋白或嵌合锌指蛋白。参见NO.5,789,538号美国专利、WO 99/48909、WO 99/45132、WO 98/53060、WO 98/53057、WO 98/53058、WO 00/23464、WO 95/19431和WO98/54311等专利。
增强子是可刺激启动子活性的DNA序列，可以是该启动子所固有的元件，也可以是为增强特定启动子的表达水平或组织特异性而插入的异源元件。增强子可以在两个方向上操纵(相对于基因目的编码序列的5’到3’及3’到5’)，甚至移到启动子的上游或下游时仍可起作用。所有增强子及其他上游启动子元件与介导其效应的序列特异性DNA结合蛋白发生结合。
根据本发明，所用载体可构建成包含ocs增强子元件。此元件起初鉴定为一种来自于土壤杆菌章鱼碱合酶(ocs)基因的16bp回文增强子(Ellis等，1987)，至少在其他10种启动子中均存在该增强子(Bouchez等，1989)。当在单子叶转化等情况下应用时，使用诸如ocs元件之类的增强子元件尤其是该元件的多拷贝，可以提高起自邻近启动子的转录水平。
本发明的构建体也包括带3’端DNA序列的目的基因，该3’端DNA序列提供转录终止的信号并使得产生的mRNA可以聚腺苷酸化。用于植物的优选3’元件包括来自于根瘤土壤杆菌胭脂碱合酶基因(Bevan等，1983)、来自于瘤土壤杆菌章鱼碱合酶基因T7转录物终止子以及来自于土豆或番茄蛋白酶抑制剂I或II基因3’末端的3′元件。必要时，还可进一步包括诸如Adh内含子1(Callis等，1987)、蔗糖合酶内含子(Vasil等，1989)或TMV Ω元件(Gallie等，1989)的调控性元件。植物终止区域可方便地使用来自于根瘤土壤杆菌Ti质粒的终止区，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区域。也可参见Guerineau等(1991)、Proudfoot等(1991)、Sanfacon等(1991)、Mogen等(1990)、Munroe等(1990)、Ballas等(1989)、Joshi等(1987)。
此外，在转基植物细胞中进行特定基因产物的细胞内打靶或指导蛋白进入细胞外环境时可以构建及采用载体。通常通过将编码某一输送或信号肽序列的DNA序列与特定基因的编码序列连接起来构建这样的载体。所得输送肽或信号肽将分别把该蛋白转运到一特定的细胞内或细胞外目的地，然后本身发生翻译后切除。输送肽或信号肽通过促进蛋白穿过诸如液泡、囊泡、质体、线粒体膜等细胞内膜转运，或指导蛋白穿过细胞外膜来起作用。在植物中，信号序列可将聚核苷酸编码的多肽导向植物内特定的腔室。这样的目的地实例包括但不限于液泡、内质网、叶绿体或淀粉颗粒。将蛋白导向内质网并分泌入质外体的玉米γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列是一个此类信号肽实例(Torrent等，1997)。另一信号肽为将多肽固定在内质网内的SEKDEL氨基酸序列(Munro和Pelham，1987)。通过与蜡质基因造粉体靶向肽融合(Klosgen等，1986)，也可将多肽导向到造粉体或淀粉颗粒。
例如，将引入的DNA导向到核可能是有用的，因为这样可以提高转化的效率。为了实现定点整合，在核本身内部对基因进行导向很有用。例如，将基因取代细胞中已存在基因实现转化而使基因得以引入将是有用的。
既然转录起始位点和编码序列的起始位点之间的DNA序列，即未翻译的前导序列，可以影响基因表达，可考虑采用特别的前导序列。优选前导序列应该包括含预计可指导所连接基因最优表达之序列的序列，即包括可提高或维持mRNA稳定性并阻止不合时宜之翻译启动的一致前导序列。根据本发明的公开内容，选择这样的序列对于本领域的熟练技术人员来说是熟知的。最优选那些源自于植物中高表达基因的序列。
标记基因为了提高鉴别转化体的能力，可能需要采用选择或筛选标记基因作为目的可表达基因或其附加基因。“标记基因”是将截然不同的表型传给表达该标记基因的细胞，并可使转化细胞与不含该标记基因的细胞区别开来的基因。根据该标记是否赋有某一可通过化学方法选择即使用选择试剂(如除草剂、抗生素等等)的性状，或其是否为可通过观察或检验即“筛选”(如R-基因座性状)得到鉴别的简单性状，这些基因可编码选择标记或筛选标记。当然，许多合适的标记基因实例在本领域是大家熟知的，并可用于本发明的实践。
术语选择或筛选标记基因也包括编码“分泌标记物”的基因，其分泌物可作为鉴别或选择转化细胞的工具加以检测。实例包括编码可被杭体相互作用识别之分泌抗原或可通过其催化活性加以检测的分泌性酶的标记基因。可分泌蛋白分成数类，包括可用ELISA检测的扩散性小蛋白、可在细胞外溶液检测的活化酶(如α-淀粉酶、β-内酰胺酶、膦丝菌素乙酰转移酶)以及插入细胞壁或或被其捕获的蛋白(如延展蛋白或烟草PR-S表达单元中发现、包含一段前导序列的蛋白)。
就分泌性选择标记来说，使用编码最后隐蔽于细胞壁的蛋白并且该蛋白包括一个独特抗原表位的基因尤其具有优势。此类抗原标记最好采用一段在植物中具有低背景的抗原表位，一段启动子前导序列，该序列提供高效表达并导向穿过胞浆膜并产生细胞壁中发现、抗体可以接触到的蛋白。将正常分泌的细胞壁蛋白改良成包含一个独特表西半球也可满足这样的要求。
适于这种改良的一个蛋白实例是延展蛋白或富羟脯氨酸糖蛋白(HPRG)。例如，玉米HPRG分子(Steifel等，1990)在分子生物学、表达及蛋白质结构方面已得到很好的分析。但是，延展蛋白及/或富甘氨酸细胞壁蛋白的任一变体(Keller等，1989)均可添加抗原位点加以改良生，产生筛选标记。
选择标记可能与本发明相联用的选择标记包括但不限于，编码卡那霉素抗性并可用卡那霉素、G418等进行选择的neo基因(Potrykus等，1985)、编码双丙胺膦抗性的bar基因、编码改变EPSP合酶蛋白(Hinchee等，1988)从而具有草甘膦抗性的基因、诸如来自于臭鼻克雷伯氏杆菌、具有溴草腈抗性的bxn等腈水解酶基因(Stalker等，1988)、具有咪唑啉酮、磺酰脲或其他ALS抑制化合物抗性的突变乙酰乳酸合酶基因(ALS)(154,204号欧洲专利申请，1988)、具氨甲蝶呤抗性的DHFR基因(Thillet等，1988)，具有除草剂茅草枯抗性的茅草枯脱卤化酶基因、具有5-甲基色氨酸抗性的突变邻氨基苯甲酸酯合酶基因。当使用突变EPSP合酶基因时，可引入合适的叶绿体转运肽CTP而得到额外的益处(0,218,571号欧洲专利申请，1987)可用于选择转化体系统的选择标记基因的演示实施方案是编码膦丝菌素乙酰转移酶的基因，如来自于吸水链霉菌的bar基因或来自于绿色产色链霉菌的pat基因。膦丝菌素乙酰转移酶灭活除草剂双丙胺膦中的活性成分膦丝菌素(PPT)。PPT抑制谷氨酰胺合酶(Murakami等，1986，Twell等，1989)，导致氨迅速蓄积使细胞死亡。成功在单子叶植物中成功使用此选择系统是非常令人惊奇的，因为有报道在谷类实现转化是非常困难(Potrykus，19889)。
当在本发明的实践中需要采用双丙胺膦抗性基因时，用于此目的的一个特别有用的基因是可从链霉素(如ATCC NO.21,705)获得的bar或pat基因。有报道(Murakami等，1986；Thompson等，1987)，bar基因的克隆应用于除了单子叶植物这外的植物环境中(De Block等，1987；De Block等，1989)。
用于原核的选择标记包括四环素抗性或ampillicin抗性基因。
筛选标记可采用的筛选标记包括但不限于，编码各种发色底物为已知的酶的β-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)、编码产物调控植物组织中花青素色素(红色)生成的R-基因座基因(Dellaporta等，1988)、编码各种发色底物为已知(如PADAC，一种发色头孢菌素)的酶的β-内酰胺酶基因(Sutcliffe，1978)、编码可转化发色儿茶酚的儿茶酚二氧合酶的xylE基因(Zukowsky等，1983)、α-淀粉酶基因(Ikuta等，1990)、编码酪氨酸酶的基因(Katz等，1983)，其中酪氨酸酶可将酷氨酸氧化成DOPA和多巴醌，后者反过来聚积形成易于检测的化合物黑色素；以及含发色底物的半乳糖苷酶基因、可用生物发光法检测的萤光素酶基因(Ow等，1986)，甚至是可用钙敏感生物发光法检测的水母发光蛋白或绿色荧光蛋白基因(Niedz等，1995)。
来自于玉米R基因复合物的基因作为筛选标记应该特别有用。玉米中的R基因复合物编码一种调控大部分种子及植物组织中花色素甙色素生成的蛋白。来自于玉米R基因复合物的基因可用于玉米的转化，因为该基因在转化细胞中的表达不会伤害细胞。因此，R基因引入这些细胞将会导到红色色素的表达，并且如果引入稳定的话可对红色区域进行视觉评分。如果一株玉米系携带了花色素甙生物合成途径(C2、A1、A2、Bz1和Bz2)中编码酶中间体的基因的显性等位基因，但携带了R基因座的隐性等位基因，用R转化来自于该系的任何细胞将导致红色色素的形成。实例性的细胞系包括含rg-Stadler等位基因和TR112的Wisconsin 22，为r-g、b、P1的K55衍生物。如果C1和R等位基因同时引入，则可利用玉米的其他任意基因型。本发明中打算使用的另一筛选标记是由lux基因编码的萤火虫荧光素酶。例如，可用X-射线胶片、闪烁计数荧光分光度法、低亮度摄相机、光子计数相机或多孔发光计等检测转化细胞中lux基因的存在。可以预见的是本系统可用于研发群体的生物发光筛选，如在组织培养板上甚或是整株植物的筛选。
转化表达盒或含表达盒的载体构建体，可以插入细胞中。表达盒或载体构建体可以附加体的形式携带或整合入细胞的基因组中，如SV40衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒，来源于质体及噬菌体DNA组合的载体，牛痘、腺病毒、鸡痘及伪狂犬病的病毒DNA。但是，只要是可复制并能在宿主中存活，任何载体均可使用。如果表达盒引入植物细胞，转化的植物细胞可能长成转基因植物。相应地，本发明提供了转基因植物和转基因植物的产品。这样的产品包括但不限于种子、果实、子代及该转基因植物子代的产品。
就构建体引入细胞宿主来说，有各种各样的方法可以使用，而且对于本领域熟练技术人员来说都是已知的。可用聚乙二醇、氯化钙、病毒感染、DEAE右旋糖酐、噬菌体感染、电穿孔及其他本领域内熟知的方法转化细菌及许多真核细胞。真菌的转化可依据Gonni等(1987)所述来完成。可利用包括电穿孔、使用原生质球、醋酸锂等等在内的方法完成重组载体对酵母的转化。任何可使DNA引入动物细胞的方法均可使用例如，电穿孔、磷酸钙、脂质体感染，等等。
可利用杆状病毒将表达盒插入昆虫细胞(实例参见杆状病毒表达载体—实验手册，1992)。例如，将要进入重组基因的载体可与杆状病毒一起引入以便在培养的昆虫细胞培养上清中获得重组病毒。然后用重组病毒感染昆虫病毒，使该蛋白得以表达。此方法中所用的基因导入载体可包括pLV1392、pLV1393及pBluBacIII(均为Invitrogen的产品)。杆状病毒可以是蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，该病毒感染某些娥类昆虫。昆虫细胞可以是来自于草地夜蛾的Sf9和Sf21卵细胞及High5细胞(Invitrogen)，High5细胞是来自于大豆拟尺蛾(Trichoplusia ni)的卵细胞。为了进行含重组基因和含杆状病毒的共同转入，可使用磷酸钙或脂质体感染的方法。
将表达载体导入植物组织的方法包括直接感染，以及根瘤土壤杆菌与植物细胞共培养(Horsch等，1985)。Gruber等(1997)对土壤杆菌载体系统及土壤杆菌介导的基因转移作了描述。转化植物细胞的技术包括以根瘤土壤杆菌或发根土壤杆菌为转化试剂用DNA转化细胞、电穿孔、DNA注射、微粒轰击、粒子加速，等等(例如可见EP 295959和EP 138341)。
特别优先使用土壤杆菌(Agrobacterium spp.)的Ti及Ri质粒的双元载体。Ti来源的载体可转化大范围、包括单子叶植物和双子叶植物在内的高等植物，如大豆、棉、油菜、烟草及水稻等(Pacciotti等，1985；Byrne等，1987；Sukhapinda等，1987；Lorz等，1985；Potrykus等，1985；Byrne等，1987；Park等，1985；以及Hiei等，1994)。使用T-DNA转化植物细胞已有广泛的研究和详细的描述(例如参见EP 120516；Hoekema，1985；Krauf等，1983及An.等，1985)。本领域内的熟练技术人员也可使用其他转化方法，如外源DNA构建体的直接摄取(见EP 295959)、电穿孔技术(Fromm等，1986)或用核酸构建体包被的金属颗粒高速弹道弹丸(Kline等，1987，及NO.4,945,050号美国专利)。细胞转化后，本领域内的熟练技术人员可使之再生。最近说明的方法与将外源基因转化入商业上重要的农作物之间有着特别的关联，如油菜籽(DeBlock等，1989)、向日葵(Everett等，1987)、大豆(McCabe等，1988；Hinchee等，1988；Chee等，1989；Christou等，1989；及EP 301749)、水稻(Hiei等，1994)和玉米(Gordon Kamm等，1990；及Fromm等，1990)。
含基因组或合成片段的表达载体可导入原生质体或完整组织或分离的细胞中。优选将表达载体导入完整组织中。Maki等(1993)及Phillips等(1988)提供了培养植物组织的通用方法。
优选利用诸如微颗粒介导的输送、DNA注射、电穿孔等等的直接基因转移方法将表达载体导入玉米或其他植物组织中。更优选使用带生物弹射装置的微颗粒介导输送方法将表达载体导入植物组织。例如，可见Tomes等(1995)。
本领域内的熟练技术人员将会理解方法的选择可能取决于将要转化的植物类型即单子叶植物或双子叶植物。转化植物细胞的适当方法包括但不限于微注射(Crossway等，1986)、电穿孔(Riggs等，1986)、土壤杆菌介导的转化(De Blaere等，1987及Hinchee等，1988)、直接基因转移(Paszkowski等，1984，引用我们的专利)及利用来自于Agracetus，Inc.，Madison，Wis.和BioRad，Herules，Calif.的设备的弹道颗粒激发(例如，可参见Sanford等，NO.4,945,050号美国专利及McCabe等，1988)。也可参见，Weissinger等，1988；Sanford等，1987(洋葱)；Christou等，1988(大豆)；McCabe等，1988(大豆)；Datta等，1990(水稻)；Klein等，1988(玉米)；；Klein等，1988(玉米)；；Klein等，1988(玉米)；Fromm等，1990(玉米)；Gordon-Kamm等，1990(玉米)；Svab等，1990(烟草叶绿体)；koziel等，1993(玉米)；Shimamoto等，1989(水稻)；Christou等，1991(水稻)；EP 0 332 581号欧洲专利申请(鸭茅(orchardgrass)及其他早熟禾亚科植物(pooideae))；Vasil等，1993(小麦)；Weeks等，1993(小麦)以及分子生物学中的方法(1998)。
植物的转化可用单个的DNA分子或多个DNA分子(即共转化)一起进行，这些技术均适用于与表达盒和本发明的构建体一起使用。有大量的转化载体可用于植物的转化，并且本发明的表达盒可用于与这些载体任意联用。载体的选择取决于优选的转化技术及转化的靶种属。
许多载体可在用根瘤土壤杆菌的转化中使用。这些载体典型地至少携带了一段T-DNA边界序列及诸如pBIN19.Bevan(1984)的诱导载体。在土壤杆菌介导的转化中另一有用的载体是双元载体pCIB10，它含有编码在植物中进行选择的卡那霉素抗性基因、T-DNA的左侧及右侧边界序列，可引入具有广泛宿主范围的质粒pRK252中的序列，使之可在大肠杆菌及土壤杆菌中均可复制。Rothstein等(1987)对其构建作了描述。Gritz等(1983)描述了v如何构建各种导入潮霉素B磷酸转移酶基因的pCIP10衍生物。这些衍生物可使转基因植物细胞仅对潮霉素(pCIB743)或对潮霉素和卡那霉素(pCIB715，pCIB717)进行选择。
使用直接基因转移形式或土壤杆菌介导转移的形式的方法通常但不是必须与选择标记一起进行，该标记可提供对抗生素(如卡那霉素、潮霉素或氨甲蝶呤)或除草剂(如膦丝菌素)的抗性。但是，植物转化的选择标记的选择对于本发明并不是关键的。
对于某些植物组织来说，可偏向于不同的抗生素或除草剂选择标记。在转化中使用的常规选择标记包括对卡那霉素及相关抗生素具有抗性的nptII基因(Messing & Vierra，1982；Bevan等，1983)，对除草剂膦丝菌素具有抗性的bar基因(White等，1990；Spencer等，1990)，对抗生素潮霉素具有抗性的hph基因(blochinger & Diggelmann)，以及对氨甲蝶呤具有抗性的dhfr基因(Bourouis等，1983)。
pCIB3064就是这样一个将直接基因转移技术与除草剂Basta(或膦丝菌素)联合起来的有用载体。该载体基于pCIB246质粒，pCIB246包含与大肠杆菌GUS基因操纵性融合的CaMV 35S启动子和CaMV35S转录终止子，并在WO 93/07278中作了描述，其内容在此引入作为参考。来自于绿色产色链霉菌的bar基因(Thompson等，1987)是对膦丝菌素产生抗性的一个有用基因。此载体适合于克隆含其自有调控信号的植物表达盒。另一转化载体是pSOG35，它利用大肠杆菌二氢叶酸还原酶(DHFR)作为对氨甲蝶呤产生抗性的选择标记。
任何可以亚克隆繁殖的植物组织，不管其由器官发生还是胚发生，均可用本发明的构建体转化。术语器官发生指芽和根相继从分生中心发育而来的过程，而胚生成则指芽和根以一样的方式同时(不是先后)从体细胞或配子发育的过程。特定组织的选择很大程度上取决于可用的克隆繁殖系统、最适用的组织和要转化特定种属。靶组织的示例包括叶圆盘(leaf disk)、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子体、愈合组织、已存在的分生组织(如顶端分生组织、腋芽、根分生组织)及诱导的分生组织(如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。
本发明的植物可以采用各种各样的形式。植物可以是转化细胞和未转化细胞的嵌合体；可以是克隆的转化体(如所有细胞转化成含有表达盒的细胞)；可以包含转化组织及未转化组织的嫁接物(如转化的根原种嫁接到柑桔种中未转化的幼芽上)。转化植物可用诸如克隆繁殖或传统培育技术的各种方法进行繁殖。例如，第一代转化植物(或T1)可自身产生纯合的第二代转化植物(或T2)，T2植物可进一步用传统的培育技术进行繁殖。可将一个显性选择标记(如npt II)与表达盒相关联，以辅助培育。
本发明可用于转化任何品种的植物，包括但不限于谷类(玉米)、芸苔属(如B.napus，B.rapa，B.juncea)尤其是像芸苔这样可用作种子油的品种、苜蓿(紫花苜蓿)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secalecereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、黍(如pear millet(珍珠粟))、黄米(糯性黍米)、小米(Setaria italica)、龙爪粟(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、番红花(Carthamustinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、土豆(Solanum tuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypiumhirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Cofea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑桔树(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Oleaeuropaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳大利亚坚果(Macadamia integrifolia)、杏仁(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物及松类。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(如Lactucasativa)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、扁白豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)及诸如黄瓜(C.sativus)、哈蜜瓜(C.cantalupensis)、香瓜(C.melo)的香瓜属(Cucumis)成员。观赏植物包括村鹃花(Rhododendron spp.)、八仙花属(Macrophylla hydrangea)、芙蓉属(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipaspp.)、水仙花(石蒜科)、牵牛花(矮牵牛属)、康乃馨(香石竹)、一品红(猩猩木)和菊花。可能在本发明中应用的针叶树类包括诸如火炬松(火炬松)、爱氏松(湿地松)、美国黄松(美国黄松)、海滩松(小干松)、蒙特例松(辐射松)以及道格拉斯杉(黄杉)之类的松树；西部铁杉(加拿大铁杉)、水杉(白云杉)、美国杉树(北美红杉)；诸如银冷杉(太平洋银冷衫)、香脂冷杉(胶冷杉)之类的冷杉；以及诸如西部红杉(北美乔柏)、阿拉斯加黄柏(阿拉斯加黄扁柏)之类的香柏。豆类植物包括菜豆(beans)和豌豆(peas)。豆包括关华豆、刺槐豆、胡芦巴、绿豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、扁豆、鹰嘴豆等。荚果包括但不限于诸如花生的花生属，诸如小寇花、毛叶苕子的蚕豆属，小豆，绿豆和鹰嘴豆，羽扇豆属如白羽扇豆，车轴草属，菜豆属如普通的豆角和利马豆，碗豆属如蚕豆，草木犀属如红花草，苜蓿属如紫花苜蓿，莲花如三叶草，扁豆属如扁豆和假木兰。本发明方法中使用的优选粮草和草地草包括紫花苜蓿、果园草、高牛毛草、黑麦草、蔓延弯曲的草及小糠草。
本发明植物优选为农作物，如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉、番红花、花生、高粱、小麦、燕麦、黑麦、黍、烟草、大麦、水稻、番茄、土豆、南瓜、甜瓜、荚果类作物如豌豆、菜豆及大豆，等等。
重组酶制备重组植酸酶时，适当的宿主得以转化和生长后，用合适的方法(如温度变换或化学诱导)诱导选择启动子，细胞再培养一段时间以收获重组酶。细胞一般用离心来收集，用物理或化学的方法加以裂解，保留所得粗提取物以进一步纯化。
蛋白表达中采用的细胞可用任意常规方法裂解，包括反复冻融、超声、机械裂解，或使用细胞裂解剂，这些方法都是本领域内熟练技术人员所熟知的。
从重组细胞培养物中复原和纯化酶可以使用包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、亲和层析、磷酸纤维素层析、疏水交换层析、亲和层析、羟磷灰石层析和植物凝集素层析在内的方法。必要时，在完成成熟蛋白构型时使用蛋白重新折叠步骤。最后，可用高效液相色谱(HPLC)进行最后的纯化。
本发明的酶可以是化学合成方法的产品，或用重组技术从真核宿主如高等植物生成。
根据重组生产方法中所采用的宿主细胞不同，本发明的酶可进行糖基化加以共价修饰，也可不修饰。真核细胞中分泌蛋白的糖基化起调节蛋白质折叠、构象、热稳定性和抗蛋白水解的作用。就特定的植酸酶应用来说，该酶的糖基化形式要优于非糖基化形式。例如，在动物饮料中使用糖基化植酸酶可以帮助保护该酶在形成小球时不会发生热变性，当穿过动物的胃时不会水解失活，帮助将活化的酶输送到小肠及作用部位。就食物加工应用来说，仅在食物加工过程中需要酶活性而最终产品是不需要的，优选非糖基化、不耐热、对蛋白水解敏感的植酸酶。
本发明的酶也可包括或不包括初始的甲硫氨酸残基。
可在需要或想要此酶的活性时，使用本发明的酶。在一优选实施方案中，使用该酶催化植酸酶在动物饮料中的水解。在另一优选实施方案中，使用该酶催化植酸酶在食物中的水解。
稳定转化植物的生成和鉴定转化的植物细胞置于合适的选择性培养基中来选择转基因细胞，然后让其长成愈合组织。从愈合组织长芽，然后芽在长根培养基生成苗。正常情况下，各种构建体与一种标记相连以便在植物细胞中进行选择。传统的标记可对杀菌剂(尤其是抗生素，如卡那霉素、G418、博菜霉素、潮霉素、氯霉素、除草剂，等等)产生抗性。相对缺乏所导入DNA的细胞来说，所用的特别标记使得转化细胞可以进行选择。包括本发明转录/表达盒在内的DNA构建体其组分可从对宿主细胞来说为天然(内源)或外来(异源)的序列制备。从“外来”序列制备指该序列在构建体导入的野生型宿主中未发现。异源构建体将至少包含一个对来源于转录起始区的基因来说是非天然的的区域。
为了确认转基因细胞和植物中转基因的存在，可采用各种分析方法。这些分析方法包括对本领域内熟练技术人员来说熟知的“分子生物学”测定法，如Southern和Northern印迹、原位杂交及诸如PCR或RT-PCR的基于核酸的扩增方法、诸如通过免疫学方法(ELISA及Western印迹)或酶学功能方法等检测蛋白质产物存在的“生化”测定方法、诸如叶或根部分析的植物分部分析法，也包括分析整个再生表型的方法。
可使用本领域内熟练技术人员所熟知的技术将DNA从细胞或其中包括任意植物部分的器官或组织中分离出来以测定特定核酸片段的存在。应注意通常不存在完整的序列，大概为细胞中序列发生重排或缺失所致。
通过本发明的方法所导入的核酸元件可用聚合酶链反应(PCR)确定其存在与否。利用此技术扩增不连续核酸片段并用凝胶电沪进行检测。这种分析可以测定预选择的核酸片段是否在稳定转化体中存在，但不能证明所导入宿主基因组中的预选择核酸是完整的。另外，利用PCR技术也不可能测定转化体是否含有导入基因组中不同位点的外源基因，即不能确定转化体是否为独立的起源。预期的是利用PCR技术可能可以克隆与所导入特定DNA片段相连的宿主基因组DNA片段。
可用Southern杂交技术测定转化体中DNA整合入宿主基因组的阳性证据及独立身份。利用此技术可以鉴定导入宿主基因组的DNA序列及旁侧的宿主DNA序列。因此，指定转化体的Southern杂交模式作为该转化体的鉴别特征之一。另外还可能通过Southern杂交来证明高分子量DNA中所导入特定DNA片段的存在，即确认所导入的特定DNA片段已整合入宿主细胞基因组中。Southern杂交技术提供了用PCR获得的信息，如某一特定DNA片段的存在与否，但也可证明DNA片段整合入基因组中并鉴定每一单独的转化体。
可以预期的是利用Southern杂交作了修改的点印迹或槽印迹杂交技术，可以获得来源PCR的相同信息，如某一特定DNA片段的存在与否。
PCR和Southern杂交技术均可用于证明特定DNA片段传递到了子代。在大部分情况下，指定转化体的特征性Southern杂交模式在子代中分隔成一个或多个孟德尔基因(Spencer等，1992；Laursen等，1994)，表明基因得以稳定地遗传。胚系传递和相同Southern印迹杂交模式及在愈合组织、R0植物及为转化基因而分离出来的R1子代中转化DNA的强度，可以提示父系转化体(R0)和愈合组织的非嵌合性质。
相对于DNA分析技术可利用从植物任一部分离出来的DNA来实施，RNA可能仅在特定细胞或组织中表达，因而需从这些组织中制备用于分析的RNA。PCR技术也可用于对所导入特定DNA片段产生的RNA进行检测和定量。在PCR的这一应用中，首先要用诸如逆转录酶之类的酶将RNA逆转录成DNA，然后用传统的PCR技术扩增此DNA。大部分情况下，PCR技术虽然有用，但不能证明RNA产物的完整性。有关该RNA产物进一步的信息可从Northern印迹来获得。此技术可证明RNA种属的存在，并给出该RNA有关完整性的信息。某一RNA种属的存在与否也可用点或槽Northern杂交来测定。这些技术是对Northern印迹的修饰，仅可证明某一RNA种属的存在与否。
因此，尽管Southern印迹和PCR可用于检测所述的特定DNA片段，它们不能提供关于该特定DNA片段是否在表达的信息。可通过特异性的鉴别所导入特定DNA片段的蛋白产物或评价其表达所产生的表型改变来评估表达情况。
特定蛋白生成和鉴定的分析可利用该蛋白的物理-化学、结构、功能或其他性质。独特的物理-化学性质或结构性质可使蛋白利用诸如自然或变性凝胶电泳或等电聚焦电泳的电泳方法、诸如离子交换或凝胶排拆层析的层析技术加以分离。各个蛋白的独特结构为利用特异性抗体以ELISA检测方法等方式检测其存在提供了机会。可采取途径联用以更特具特异性，如联用抗体用于定位已用电泳技术分离的个体基因产物的Western印迹。可用别的技术以绝对确认目的产物的鉴别，如纯化后进行氨基酸测序来评价。尽管这些是最常用的，其他方法也可使用。
通过其功能性尤其是催化涉及特异底物及产物的特异性化学反应的酶活性，测定方法也可用于鉴别蛋白的表达。这些反应可以是利用物理或化学的方法提供和定量反应底物的减少或产物的生成。实施例随所分析的酶不同而不一样。
通过评价基因表达的表型结果来测定该基因产物的频繁表达。这些测定方法采取多种形式，包括但不限于分析该植物的化学组成、形态学或生理性质改变。
植酸酶组合物一般地，植酸酶为液体或干物。
液体组合物除了植酸酶外不一定包含其他物质，在高纯度时尤其如此。然而可以添加诸如甘油、山梨醇、单丙二醇的稳定剂。液体也可包括其他添加剂，如盐、糖、防腐剂、pH调节剂、蛋白质及肌醇六磷酸盐(一种植酸酶的底物)。典型的液体组合物为水性或油性混悬液。液体组合物可以在可选的小丸形成成之前或之后加到食物或饲料中。
当组合物采取干体形式、除了酶之外不需要包含其他物质时，可以是冻干或喷雾干燥的组合物。干组合物可以是呈粒状，易于与食物或饲料组分等混合形成预混合组分。酶颗粒的颗粒大小优选混合物其他组分的大小相兼容。这样就提供了一种安全、方便地将酶导入已加工食物或动物饲料等的方法。
例如，可将液体酶溶液与疏松剂如地面大豆粗粉共同冷冻，然后将混合物冻干，从而制备稳定的植酸酶制剂。水分减少以及植酸酶与疏松剂结合的相互作用可保护酶免受诸如温度超过复合饲料制备过程中所经历的温度等外界环境因素的影响。还可将用于目标酶的液体发酵混合物中可能以副产品存在的潜在蛋白水解酶的活性降到最低，以此进一步增强干制剂的稳定性。所得干燥酶-大豆粉混合物可耐受极高的温度。例如，在96℃加热120分钟后，干酶制剂可保留其原始酶活性的97.8％。按配方制成的酶混合物可用作家禽及猪生产的食物补充剂。例如，在1Kg标准玉米-大豆粉食物中加入500酶单位的本发明耐热植酸酶，可降低当前动物营养品的无机磷酸盐补充剂用量，即从0.45％降到0.225％。以含0.225％磷酸盐及补充有按配方制成的植酸酶的食物来喂养鸡，与用含0.45％磷酸盐的标准食物具有相当的功效。而且磷酸盐补充剂的减少可降低磷酸盐污染的程度，从而显著减少动物集约商业生产对环境的影响。
使用小颗粒干制剂的潜在不利之处在于其形成粉尘的趋势及颗粒表面目标酶局部浓度偏高。酶蛋白饱和的粉尘颗粒可带来免疫学的顾虑，而酶主要定位于小颗粒的表面可能影响稳定性，尤其是在饲料的加工过程中和储存期延长时。
因此，本发明进一步提供了制剂的非加工方法，该方法包括在诸如玉米、小麦或大豆等粮食中生成和输送本发明的酶。完整粮食保护目标酶免受外界环境因素影响并使粉尘的产生减至最少。这种酶输送的方法可使配制成本显著减少，尤其是与目前商用低粉尘颗粒制剂的成本比较时。此外，可从种子制备蛋白提取物，提取物可进一步加工成稳定的液体或利用冻干或喷雾干燥制成干品。例如，具有酶学活性的植酸酶在玉米中产生的量可达每公斤种子1,000,000单位的水平，而且具活性的酶可用水提物从种子复原。
在填充物质和酶一起凝聚、形成颗粒的过程中，利用凝聚技术在高度修剪的混合物中制备结块颗粒。用具有吸附酶或为酶所包被的载体物质核心来制备吸附颗粒。
典型的填充物质为诸如硫酸钠的盐。其他填充剂包括高岭土、滑石、硅酸镁铝和纤维素纤维(cellulose fibre)。凝聚颗粒中也可选择性地包括诸如糊精之类的粘合剂。
典型的载体物质包括木薯、玉米、土豆、水稻、小麦等形式的淀粉。盐也可用作载体物质。
可选的是，用包衣混合物包被颗粒。此类混合物包含包被试剂，优选疏水包被试剂，如氢化的棕榈油和牛油，如果必要的活，可包含诸如碳酸钙或高岭土等其他添加剂。
另外，植酸酶组合物可包含其他取代物，如着色剂、芳香化合物、稳定剂、维生素、矿物质、其他饲料或食物增强酶，等等。这些尤其在所谓的预混合物中使用。
“食物或饲料添加剂”是打算或适合加到食物或饮饲料中的必要纯化合物或多组分组合物。特别地，它是一种欲成为食物或饲料产品的组分之一或影响食物或饲料产品任意特性的特质。因此，植酸酶添加剂理解为在主要食物或饲料物质中并不是天然成分或其浓度不以天然浓度存在的植酸酶，例如可单独或与其他饲料添加剂从饲料物质分别加到饲料中，或植酸酶是一种饲料物质的一个完整部分但已用重组DNA技术在其中产生。典型的添加剂通常包含诸如维生素、矿物质或饲料增强酶及适当载体和/或赋形剂之类的一种或多种化合物。
即用型植酸酶添加剂在这里指不在动物饲料内部或已加工食物中生成的添加剂。即用型植酸酶添加剂可用于直接或优选与其他饲料或食物成分混合后直接喂养人类或动物。例如，依据本发明此方面的饲料添加剂与其他饲料组分一起生成饲料。此类其他饲料组分包括一种或多种其他(优选耐热的)酶补充剂，维生素饲料添加剂、矿物质饲料添加剂和氨基酸饲料添加剂。然后将适量可能包括数种组分的所得(组合)饲料添加剂与其他饲料组分如谷类及蛋白补充剂混合，形成动物饲料。可用现有的加工器械如双制粒机、蒸气制粒机、膨胀机或挤压机，将这些组分加工成动物饲料。
类似的，依据本发明此方面的饲料添加剂与其他食物组分以产生加工的食物产品。此类其他食物组分包括一种或多种其他(优选耐热的)酶补充剂，维生素食物添加剂和矿物质食物添加剂。然后将适量可能包括数种组分的所得(组合)食物添加剂与其他食物组分如谷类及植物蛋白混合，形成加工食物成品。可用任意现有加工器械将这些组分加工成加工食物成品。
在一优选实施方案中，本发明的植酸酶组合物包含一种或多种有效量的饲料或食物增强酶，尤其是该饲料或食物增强酶选自α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶尤其是乳糖酶、其他植酸酶、β-葡聚糖酶尤其是内切(endo)-β-1，4-葡聚糖酶和内切-β-1，3(4)-葡聚糖酶、纤维素酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶尤其是阿拉伯半乳聚糖内切-1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖内切-1，3-β-半乳糖苷酶、内切葡聚糖酶尤其是内切-1，2-β-葡聚糖酶、内切-1，3-α-葡聚糖酶和内切-1，3-β-葡聚糖酶，果胶降解酶尤其是果胶酶、果胶酯酶、果胶裂解酶，多聚半乳糖醛酸酶、arabinanase、rhamnogalacturonase、rhamnogalacturonan乙酰酯酶、rhamnogalacturonan-α-鼠李糖苷酶、果胶酸裂解酶和α-galacturonisidase，甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶，甘露聚糖乙酰酯酶，木聚糖乙酰酯酶，蛋白水解酶，木聚糖酶，arabinoxylanase，以及诸如脂肪酶、磷脂酶和角质素分解酶等脂肪分解酶。
本发明动物饲料添加剂在饮食之前或与饮食同时补充给动物。优选的是本发明饲料添加剂与饮食同时补充给动物。
食物或饲料中的植酸酶有效量约为10到20,000FTU/kg，优选约10到15,000FTU/kg，更优选约10到10,000FTU/kg，尤其优选约100到5,000FTU/kg，特别是约100到2,000FTU/kg饲料或食物。
利用植酸酶加工和生产人类食物和动物饲料也属于本发明的范围。用于人类食物的谷物和面粉可用植酸酶进行酶学处理以减少材料中的植酸钙镁含量。植酸钙镁的含量降低可增加基本物质如铁、钙和锌的营养利用度从而增强食物的质量。除了增加食物的营养质量，在食物加工过程中使用植酸酶可以提高食物生产方法的总体效能。例如，大豆蛋白分离生产时在白色大豆薄片加添加植酸酶，可显著提高可提取蛋白的产量和质量。食物生产时植酸酶仅在生产和加工程中具有活性，在最终的食物产品中无活性。例如，此方面与生面团的制备和烘焙相关。类似的，动物饲料谷物如吐司大豆粉或芸苔粉，在制造复合饲料之前可用植酸酶预处理。在复合饲料制备前除去动物饲料组分中的抗营养因素可以生成营养质量更好和更有价值的动物饲料成分。在此加工方法中，饲料制备时植酸酶具有活性，摄入处理过的食物后在动物的消化道中可能具有活性也可有没有活性。
除了用植酸酶作食物加工辅助外，本发明的范围包括将植酸酶用作人用补充消化辅助剂。可在进食前摄取片剂形式的植酸酶，以将活化的酶输送到受者的胃肠道。消费者将在体内经受营养的获取，并可从食物加工时不能用植酸酶处理的食物获得。
在食物或饲料制品或添加剂的制备时使用植酸酶，即植酸酶仅在制造时具有活性而在最终的食物或饲料产品中没有活性，也属于本发明的范围。例如，本发明此方面与生面团的制备和烘焙、及其他基于谷类的即食型产品的生产相关。
将植酸酶作为动物动物饲料及加工食品的外源添加剂的另一种可能是，将含有植酸酶的转基因植物材料添加到饲料中，优选添加到加工转基因种子中，在种子中植酸酶已通过异源基因表达合成了。动物饲料中可包括表达异源植酸酶的植物部分如转基因的种子或其他植物材料如根、茎、叶、木材、花、树皮及/或果实，可以原始状态或进一步加工后加入。在以谷类为基础的饲料或食物中，谷类优选小麦、大麦、玉米、高梁、黑麦、燕麦、黑小麦或水稻。植酸酶也可方便地在单胃及多胃动物尤其是小牛中使用。鱼和甲壳动物的食物也可补充植酸酶以便在集约生产系统中进一步提高食物转化率、减少排泄磷的含量。本发明的饲料可供动物使用，如家禽，例如火鸡、鹅、鸭，以及猪、马、牛、绵羊、山羊、犬、猫，以及鱼和甲壳动物。优选将饲料应用于猪或家禽，包括但不限于烤鸡、母鸡尤其是正下蛋白的母鸡、火鸡和鸭。
饲料组合物及使用方法本发明的植酸酶(如上所述配制)可与其他成分组合形成具有特定优势的全新饲料组合物。
例如，集约动物生产操作限制所产生动物粪便的磷酸盐污染是合宜的。饮食中存在的磷酸盐含量及饮食中的磷酸盐利用率是影响动物粪便中磷酸盐排泄量的主要因素。目前，植物的利用率或是大豆粉、玉米粒(及其他饲料)中存在的谷物来源磷酸盐的利用率与主要以肌醇六磷酸形式存在的磷酸盐一样低。为了使动物的生长效率最大化，在饲料中加入无机磷酸盐，使饲料组合物含有充足含量的可利用磷酸盐。然而，这些饲料制剂包含太多的总磷酸盐，从而产生磷酸盐污染。
尽管目前商用的植酸酶使磷酸酶利用度更高，仍被推荐与加入高含量的无机磷酸盐一起使用。本发明的植酸酶活性很高，以致可用于产生全新饲料制剂，具有下列性质a)无机盐磷酸盐的含量显著降低，b)实现饲料的上好转化率，提高相对正常饮食所增加的体重。目前，商用植酸酶不能使以不含添加无机磷酸盐的饲料所喂养的动物有效生产。
具体的，本发明的动物饲料包含本发明植酸酶与动物饲料成分组合而成的组合物，并形成基本上只含低水平无机磷酸盐的饲料。在一优选实施方案中，本发明的饲料组合物包含典型的饲料成分、微量营养元素、维生素等及有效量的耐热植酸酶和无机磷酸盐，其中植酸酶及磷的含量约为每公斤饲料含50-20,000单位植酸酶及少于0.45％的无机磷，优选每公斤饲料含100-10,000单位植酸酶及少于0.225％的无机磷尤其是每公斤饲料含150-10,000单位植酸酶及少于0.15％的无机磷，或每公斤饲料含250-20,000单位植酸酶同时不含添加的外源无机磷。
与农场动物生产相关的改善增加体重及食物转化率(FCR)也属于本发明的范围。本发明的植酸酶可以体重增加及FCR得到改善，尤其是当与低无机磷酸盐饮食联用时。具体的，本发明的方法通过将含有本发明植酸酶及无机磷酸盐不高于0.45％的饮食喂养动物，来改善FCR或低无机磷酸盐饮食的体重增加该方法。优选包含用含植酸酶及少于0.225％无机磷酸盐的饮食喂养，或最优选用含植酸酶及不添加无机磷的饮食喂养。
本发明的动物饲料可在单胃或多胃动物中使用。本发明的动物饲料可用于饲养家禽或猪或小牛或伴侣动物如狗或猫或马。实施例3中提供了这些饲料的实例及其用途。
本发明也提供了一种动物饲养方法，使环境磷酸盐的负荷显著降低。该方法包含用含本发明植酸酶及减量无机磷(少于0.45％)的组合物喂养大量或成群的农场动物。更优选该方法包含用含本发明植酸酶及减量无机磷(少于0.225％)的组合物喂养大量或成群的农场动物，或最优选用含本发明植酸酶及不含无机磷的组合物喂养大量或成群的农场动物。此方法可以实现动物的高密度管理，而使农场作业释放入环境的磷酸盐减至最少。
对本发明有用的方法I.对本发明有用的表达盒先在表达盒中将欲在转基因植物中表达的编码序列装配，并连接到可在植物中表达的合适启动子的3’端。表达盒也可进步包含该转基因进行选择所需要的其他任何序列。此类序列包括但不限于转录终止子，增强表达的外来序列如内含子、关键序列(vital sequence)，及将基因产物靶向到特定细胞器和腔室的序列。然后这些表达盒可转到本文所述的植物转化载体中。
A.启动子选择表达盒中使用的的启动子将决定转基因在转基因植物中的空间和时间表达模式。所选择的启动子将使转基因在特定细胞(如叶上皮细胞、叶肉细胞、根皮质细胞)或特定组织或器官(如根、叶或花)中表达，所进行的选择应反映转基因产物的蓄积部位。启动子的强度即促进转录的能力各不相同。根据所用的宿主细胞系统，均可采用在量的合适启动子，包括该基因的天然启动子。下面是可在本发明表达盒中采用的的启动子非限制性实例。
组成型启动子a.泛素启动子已知泛素是在多种细胞中蓄积的基因产物，其启动子已从数种物种中克隆出来在转基因植物中使用(如向日葵-Binet等，Plant Science7987-94(1991)；玉米-Christensen等，Plant Molec.Biol.12619-632(1989)；以及arabidopsis-Norris等，Plant Mol.Biol.21895-906(1993))。已在转基因单子叶系统中研究成了玉米泛素启动子，专利公布EP 0 342 926(Lubrizol公司)公开了其序列和为单子叶植物转化所构建的载体，其内容在此引入作为参考。Taylor等人(Plant CellRep.12491-495(1993))描绘了一种载体(pAHC25)，它包含玉米泛素启动子和第一个内含子，通过微粒轰击导入之后在大量的单子叶植物的细胞悬液中具有很高的活性。Arabidopsis泛素启动子在与本发明的核苷酸序列一起使用是理想的。泛素启动子同时适宜于单子叶和双子叶转基因植物中的基因表达。合适的载体包括pAHC25的衍生物或本申请中所述的任意转化载体。可将合适的泛素启动子及/或内含子序列导入载体，对其进行修饰。
b.CaMV 35S启动子已公开的专利申请EP 0 392 225(于1991年9月25日公开；CibaGeigy公司；实施例23)描述了质粒pCGN1761的构建，其内容在此引入入作为参考。该质粒含双CaMV 35S启动子和tml转录终止子，在启动子和终止子间存在一个唯一的EcoRI位点，并具有pUC型的主链。构建了含修饰多接头的pCGN1761的衍生物，该接头除了已有的EcoRI位点外还包括NotI和XhoI位点。该衍生的特指pCGN1761ENX对于克隆其多接头内转基因植物内的表达受35S启动子调控的cDNA序列或编码序列(包括微生物ORF序列)时非常有用。构建体的这样一个完整35S启动子-编码序列-tml终止子表达盒，可在启动子5’的HindIII、SphI、SalI和XbaI位点及终止子3’端的XBaI、BamHI和BglI位点进行切除，用于转移到诸如下述转化载体。而且，双35S启动子片段可用HindIII、SphI、SalI、XbaI或Pstl进行5’端切除，及在任意多接头位点(EcoRI、NotI或XhoI)进行3’端切除，以用其他启动子取而代之。如果必要的话，可导入能增强翻译的序列对克隆位点的周围进行修饰。这一点在需要过表达时尤其有用。例如，可如美国NO.5,639,949号专利(1997年6月17日颁给CibaGeigy公司)所述对pCGN1761ENX作出修饰，优化翻译起始位点，其他内容在此引入作为参考。
c.肌动蛋白启动子
已知大部分类型的细胞中均有数种同功型的肌动蛋白表达，因而肌动蛋白启动子是组成型启动子的一个好选择。特别是来自于水稻ActI基因的启动子已克隆出来并得到鉴定(McElroy等，Plant Cell 2163-171(1990))。发现该启动子的一个1.3kb片段含在水稻原生质体中表达所需的所有调控序列。而且，已构建了特别在单子叶植物中使用、基于ActI启动子的大量表达载体(McElroy等，Mol.Gen.Genet.231150-160(1991))。它们导入了ActI内含子1、AdhI 5’旁侧序列和AdhI内含子1(来自于玉米乙醇脱氢酶基因)，及来自于CaMV35S启动子的序列。表现出高表达水平的载体是35S与ActI内含子或ActI 5’旁侧序列和ActI内含子的融合体。对(GUS报告基因的)起始ATG附近的序列进行优化也可增强表达。McElroy等所述(Mol.Gen.Genet.231150-160(1991))的启动子表达盒易于修饰用于基因表达，尤其适宜于在单子叶植物宿主中使用。例如可从McElroy构建体中移除含启动子的片段，并用它取代pCGN1761ENX中的双35S启动子，pCGN1761ENX就可以插入特定的基因序列了。然后将这样构建的融合基因转到合适的转化载体中。在一单独的报道中，也发现水稻ActI启动子及其第一个内启子也可在培养的大麦细胞中指导高水平表达(Chibbar等，Plant Cell Rep.12506-509(1993))。
诱导型表达a.PR-1启动子pCGN1761ENX中的双35S启动子可选择适合于高水平表达的其他任意启动子取代。例如，美国专利NO.5,614,395(1997年3月25日颁给Ciba Geigy)中所述的化学物质调控启动子如烟草PR-1a启动子，可取代该双35S启动子。此外，也可使用Lebel等在Plant J.16223-233(1998)中所述的arabidopsis PR-1启动子。启动子优先选择用限制性内切酶从其来源切下来的启动子，但也可替代性地选择用携带合适末端限制性酶切位点的引物通过PCR扩增出来的的启动子。应该先进行PCR扩增，然后在靶载体中克隆扩增的启动子后对对其重新测序，检查是否有扩增错误发生。将化学物质/病原体可调控的烟草PR-1a启动子从pCIB1004质粒(其构建参见EP 0 332 104(1991年3月20日公开，Ciba Geigy)的实施例21，其内容在此引入作为参考)中切下来，并转到pCGN1761ENX质粒(Uknes等，Plant Cell 4645-656(1992))中。用NcoI切割pCIB1004质粒，所得线性片段的3’突出端用T4 DNA聚合酶处理使之变成平端。然后将该片段用HindIII切割，所得含PR-1a启动子片段用凝胶纯化，将克隆入双35S启动子已除去的pCGN1761ENX中。这一步这样操作用XhoI切割、T4 DNA聚合酶平端化，然后用HindIII切割，将pCIB1004启动子片段所克隆入的、含大一些载体终止子的片段分离出来。这一步产生的一种含PR-1a启动子、tml终止子及具有唯一EcoRI和NotI位点的插入多接头的pCGN1761ENX衍生物。所选的编码序列可插入此载体中，随后可将融合产物(即启动子-基因-终止子)转到包括下文所述转化载体在类的选定转化载体中。
可使用各种化学调节剂诱导选定编码序列在根据本发明所转化的植物中表达，这些调节剂包括美国专利NOs.5,523,311和5,614,395公开的苯并噻二唑、异烟酸、水杨酸类化合物。
b.乙醇诱导的启动子可被某些醇或酮如乙醇诱导的的启动子，也可用于本发明编码序列的诱导性表达。例如，来自于构巢曲霉alcA基因的启动子就是这样一种启动子(Caddick等，1998，Nat.Biothechnol，16177-180)。在构巢曲霉中，alcA基因编码乙醇脱氢酶I，其表达由化学诱导剂存在时的AlcR转录因子调控。就本发明的目的来说，含与基本35S启动子融合的alcA基因启动子序列的placA:CAT质粒(Caddick等，1998，Nat.Biothechnol，16177-180)中编码CAT的序列用本发明的编码序列取代，以形成具用受alcA基因启动子调控的编码序列的表达盒。这一步用本领域内所熟知的方法完成。
c.糖皮质激素诱导的启动子本发明核酸序列的诱导表达也计划使用基于甾体激素的系统。例如，使用了了一种糖皮质激素介导的诱导系统(Aoyama和Chua，1997，The Plant Journal，11)，基因的表达用糖皮质激素如合成的糖皮质激素，优选地塞米松来诱导，浓度优选0.1mM至1mM，更优选10mM到100mM。出于本发明目的考虑，用本发明的核酸序列取代了萤光素酶基因序列以形成含有本发明核酸序列的表达盒，其中本发明的核酸序列受六拷贝与35S基本启动子融合的GAL4上游激活序列调控。这一步用本领域内众所周知的方法完成。该反式作用因子包含与疱疹病毒蛋白VP16反式激活域(Picard等，1988，GenesDevel.，2718-729)融合的GAL4 DNA-结合域(Keegan等，1986，Science，231699-704)，其中VP16与大鼠糖皮质激素受体的激素结合域融合(Picard等，1988，Cell，541073-1080)。本领域所知或此处所述的任意适于植物中表达的载体均可调控该融合蛋白的表达。该表达盒也可包含于含有与6xGAL4/基本启动子融合的本发明核酸序列的植物中。这样就可实现融合蛋白的组织或器官特异性，从而实现本发明表达盒的组织或器官特异性。
d.创伤诱导的启动子创伤诱导的启动子也适宜于基因表达。已有大量这样的启动子报道(例如，Xu等，Plant Molec.Biol.22573-588(1993)；Logemann等，Plant Cell 1151-158(1989)；Rohrmeier & Lehle，Plant Molec.Bil.22783-792(1993)；Firek等，Plant Molec.Bil.22129-142(1993)；Warner等，Plant J.3191-201(1993))，并且均适宜于在本发明中使用。Logemann等描述了双子叶植物土豆wunI基因的5’上游序列。Xu等表明来自于双子叶植物土豆(pin2)的创伤诱导启动子在单子叶植物水稻中具有活性。Rohrmeier & Lehle进一步描述了玉米WipI cDNA的克隆，它由创伤诱导并可用于利用标准技术分离同源启动子。类似的，Firek等和Warner等描述了一个来自于芦笋的创伤诱导基因，其在创伤和病原体入侵部位局部表达。利用本领域众所周知的克隆技术，可将这些启动子转到合适的载体中，与属于本发明的基因融合，并可用于在植物受伤部位表达这些基因。
3.组织特异性表达a.根特异性表达
基因表达的另一模式是根部表达。本发明构建体和方法的合适根启动子之一是Framond(FEBS 290103-106(1991))及美国专利NO.5,466,785(1995年11月14日颁给Ciba Geigy)所述的玉米金属硫蛋白样(MTL)基因启动子，在此将其内容引入作为参考。该“MTL”启动子转到诸如pCGN1761ENX的合合适载体中以插入选定的基因，随后将不整个启动子-基因-终止子表达盒转到目标转化体载体中。
b.髓(pith)倾向性表达专利申请WO 93/07278(1993年4月15日公布，Ciba Geigy)描述了如何分离玉米trpA基因，该基因倾向于在髓细胞中表达，在此将其引入作为参考。其基因序列和启动子从转录起始位点延伸到-1726bp。利用标准分子生物学技术，可将此启动子或其部分转到诸如pCGN1761的载体中，取代35S启动子，并用于驱动外源基因以髓倾向表达的方式表达。实际上，含髓倾向性启动子或其部分的片段可转到任意载体中并加以修饰，在转基因植物中利用。
c.叶特异性表达Hudspeth和Grula(Plant Molec Biol 12579-589(1989))描述了一个编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的基因。利用标准分子生物学技术，该基因的启动子可用于驱动任意基因以叶特异性的方式在转基因植物中表达。
d.花粉特异性表达WO 93/07278(1993年4月15日公布，Ciba Geigy)描述了玉米钙钙依赖性蛋白激酶(CDPK)基因的分离方法，该基因在花粉细胞中表达。该基因和启动子从转录起始位点延伸到1400bp。利用标准分子生物学技术，该启动子或其部分可转到诸如pCGN1761的载体中，取代35S启动子，并驱动本发明的核酸序列以花粉特异性的方式表达。
B.转录终止子本发明的表达盒中可使用各种各样的转录终止子。这些终止子负责终止超越转基因的转录并校正mRNA聚腺苷酸化。合适的终止子是已知在植物中起作用的终止了，包括但不限于CaMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子和碗豆rbcS E9终止子。这些在单子叶植物和双子叶植物中均可使用。另外，基因的天然转录终止子也可使用。
C.增强或调控表达的序列已发现大量序列可在转录单元内增强基因的表达，这些序列可与本发明基因连接起来以增强其在转基因植物中的表达。
已发现各种内含子序列可增强基因表达，尤其是在单子叶植物中。例如，已发现，当导入到玉米细胞时，玉米AdhI基因的内含子显著地增强野生型基因在其同源启动子之下的表达。已发现内含子1效率特别高，并增强与氯霉素乙酰转移酶基因融合的融合构建体的表达(Callis等，Genes Develop.11183-1200(1987))。在相同的实验系统中，来自于玉米bronzel基因的内含子在增强表达方面具有类似的作用。内含子序列已按常规导入到植物转化载体中，通常在非翻译前导序列内。
大量来源于病毒的非翻译前导序列也公认能增强表达，并且在双子叶植物中特定有效。具体地说，来自烟草花叶病毒(TMV，“W序列”)、玉米褪绿斑点病毒(maize chlorotic mottle virus，MCMV)、紫花苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列可有效增强表达(例如，Gallie等，Nucl.Acids Res.158693-8711(1987)，Skuzeski等，Plant Molec.Biol.1565-79(1990))。其他在本领域内已知的前导序列包括但不限于细小核糖核酸病毒前导序列，如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5′非编码区)(Elroy-Stein，O.，Fuerst，T.R.，和Moss，B.，PNASUSA 866126-6130(1989))；马铃薯病毒前导序列，如TEV前导序列(烟草腐蚀病毒)(Allison等，1986)；MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)，Virology(1549-20)；人类免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列，(Macejak，D.G.，和Sarnow，P.，Nature 35390-94(1991))；来自于紫花苜蓿花叶病毒包衣蛋白mRNA(AMV RNA4)的未翻译序列，(Jobling，S.A.，和Gehrke，L，Nature 325622-625(1987))；烟草花叶病毒前导序列(TMV)，(Gallie，D.R.等，MolecularBiology of RNA，237-256页(1989))；以及玉米褪绿斑点病毒(MCMV)前导序列(Lommel，S.A.等，Virology 81382-385(1991))。也可参见Della-Cioppa等，Plant physiology 84965-968(1987)。
D.GC/AT含量在本领域内，已知可对基因的编码区进行优化成首选宿主密码子，从而使蛋白在植物中的表达最优化。相应地，植物中的优先密码子选择与某些微生物的优先密码子选择是不同的。将所克隆微生物ORF内的密码子选择与植物基因(尤其是来自于目标植物的基因)中的密码子选择比较，将可以鉴别ORF内优先改变的密码子。典型的植物进化已导致在单子叶植物中强列倾向第三个碱基位置选择C和G，而在双子叶植物中此位置则倾向于选择A和T。将基因进行改造，导入特定目标转基因物种的优先密码子选择，下面所述许多关于GC/AT含量和不合理剪接的问题将得到解决。
典型的植物基因GC含量超过35％。植物中富含AT核苷酸的ORF序列会带来数个问题。首先，ATTTA基序被认为可导致信息的不稳定，并在许多短生命期mRNA的3’端发现。其次，大家认为在信息中不恰当的位置出现聚腺苷酸化的信号如AATAAA可导致转录不成熟截短。另外，单子叶可能将富含AT的序列视为内含子并识别旁侧的剪接位点(见下文)。
E.靠近起始甲硫氨酸的序列植物与微生物的不同之处在于其信息不含固定的核糖体结合位点。相反，大家认为核糖体粘附到信息的5’末端并扫描第一个可用的ATG，并在此位点开始翻译。然而，大家认为在该ATG旁边倾向于出现某些核苷酸，在ATG处包含真核细胞的共有翻译起始子可以实现微生物基因的表达。Clontech(1993/1994目录，210页，在此引入作为参考)提出将一段序列作为在植物中表达E.coli uidA基因的共有翻译起始子。还有，Joshi(NAR 156643-6653(1987)，在此引入作为参考)比较了许多植物ATG旁边的序列，并提出了另一共有序列。当在植物中表达微生物ORF遇到困难时，在起始ATG处包含这些序列中的一段可能可以促进翻译。在这样的情况下，共有序列的最后三个核苷酸可能因为其第二个AA残基发生改变而不宜于包括进去。GenBank数据库中14个玉米基因的检查得到下列结果14个玉米基因中起始ATG前的位置-10-9-8-7-6-5-4-3-2-1C 38 4 6 2 5 6 0 10 7T 30 3 4 3 2 1 1 10A 23 1 4 3 2 3 7 23G 63 6 0 6 5 4 6 15可在核苷酸序列将要导入以及ATG旁边序列进行改以导入优选核苷酸的目标植物种属中进行此分析。
从非植物来源克隆并非植物中表达优化的基因也可含有在植物中识别为5’或3’剪接位点的基序并被切去，从而产生截短的或缺失的信息。可利用本领域内熟知的技术将这些位点去除。
用于修改编码序列和邻近序列的技术在本领域内众所周知。当微生物ORF的起始表达水平低时，需要如上所述对该序列作出改变，然后按照本领域内众所周知的方法完成合成基因的构建。例如，已公布的公开专利EP 0 385 962(1990年9月5日公布，Monsanto)、EP0359 472(1995年12月27日颁给Lubrizol)、WO 93/07278(1993年4月15日公布，Ciba-Geigy)均作了描述，其内容在此引入作为参考。大部分情况下，优选在转到转基因植物之前用瞬时检测系统(本领域内众所周知)分析基因构建体的表达。
II.植物转化载体及选择标记大量可用于植物转化的转化载体在植物转化领域内是常规的技术，本发明的相关基因可与这些载体的任任何一个联接使用。载体的选择取决于优选的转化技术和要转化的目标种属。就某些特定的目标种属来说，可倾向于使用不同的抗生素或除草剂选择标记。在转化中常规使用的选择标记包括对卡那霉素及相关抗生素具有抗性的nptII基因(Messing & Vierra，1982，Gene 19259-268；Bevan等，1983，Nature，304184-187)，对除草剂膦丝菌素具有抗性的bar基因(White等，1990，Nucl.Acids Res 181062；Spencer等，1990，Thor.Appl.Genet 79625-631)，对抗生素潮霉素具有抗性的hph基因(Blochinger &Diggelmann，Mol Cell Biol 42929-2931)，和对氨甲蝶呤具有抗性的dhfr基因(Bourouis等，1983，EMBO J.2(7)1099-1104)，以及对草甘膦具有抗性的EPSPS基因(美国专利No 4,940,835和5,188,642，分别于1990年7月10日和1993年2月23日颁给Monsanto)和提供代谢甘露糖能力(美国专利No 5,767,378和5,994,629，分别于1998年6月16日和1999年11月30日颁给Novartis)的甘露糖-6磷酸异构酶基因(此处也称为磷酸甘露糖异构酶基因)。
适宜于土壤杆菌转化的载体有许多载体可供用根瘤土壤杆菌转化时使用。它们通常携带至少一段T-DNA边界序列，包括诸如pBIN19(Bevan，Nucl.Acids Res.1984)的诱导载体。下面描述了如何构建两种适宜于土壤杆菌转化的载体。
pCIB200和pCIB2001双元载体pCIB200和pCIB2001用于构建与土壤杆菌一起使用的重组载体，按下述方式构建。用NarI消化四环素抗性基因可切除的pTJS75(Schmidhauser & Helinski，1985，J.Bacteriol.164446-455)产生pTJS75kan，然后插入来自于pUC4K、携带有NPTII(Messing &Vierra，1982，Gene 19259-268；Bevan等，1983，Nature，304184-187；McBride等，1990，Plant Molecular Biology 14266-276)的AccI片段。XhoI连接子与含T-DNA左、右边界、植物选择性nos/nptII嵌合基因及pUC多接头(Rothstein等，1987，Gene 53153-161)的PCIB7的EcoRV片段连接，将Xhol消化的片段克隆到SalI消化的pTJS75kan中以产生pCIB200(也可见EP 0 332 104，实施例19；1991年3月20日公布，Ciba Geigy)。pCIB200含有下列唯一额外限制限酶切西位点EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI和SalI。pCIB2001是将含另外限制性酶切位点的多接头插入pCIB200所得的衍生物。pCIB2001中多接头中的唯一限制性酶切位点是EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、SalI、MluI、BclI、AvrII、ApaI、HpaI和StuI。除了具有这此唯一的限制性酶切位点外，pCIB2001也有植物和细菌卡那霉素选择性、土壤杆菌介导转化的T-DNA左右边界、在大肠杆菌和其他宿主间迁移的RK2衍生trfA功能，以及同样来源于RK2的OriT及OriV功能。pCIB2001多接头适合用于克隆含其自有调控信号的植物表达盒。
pCIB10及其潮霉素选择衍生物pCIB10双元载体含有一个编码在植物中进行选择的卡那霉素抗性基因和T-DNA的左、右边界序列，并导入来自于具有广泛宿主范围的pRK252质粒的序列，使得它可同时在大肠杆菌和土壤杆菌中复制。它的构建如Rothstein等所述(1987，Gene 53153-161)。Gritz等(1983，Gene 25179-188)描述了v如何构建各种导入潮霉素B磷酸转移酶基因的pCIP10衍生物。这些衍生物可使转基因植物细胞仅对潮霉素(pCIB743)或对潮霉素和卡那霉素(pCIB715，pCIB717)进行选择。
适宜于非土壤杆菌转化的载体不用根瘤土壤杆菌的转化需绕过所选转化载体中T-DNA序列的要求，因此除了上述含有T-DNA序列的载体外，可利用不含这些序列的载体。不依赖于土壤杆菌的转化技术包括通过微粒轰击、原生质体摄取(如PEG和电穿孔)及微注射进行转化。载体的选择很大程度上取决于所转化种属的优先选择性。下面描述了如何构建适宜于非土壤杆菌转化的典型载体。
pCIB3064pCIB3064是适宜于直接基因转移技术、与除草剂basta(或膦丝菌素)选择联用的pUC衍生载体。pCIB246质粒包含与大肠村菌GUS基因操纵性融合的CaMV 35S启动子及CaMV 35S转录终止子，PCT已公布的WO 93/07278专利申请(1993年4月15日公布，Ciba Geigy)对此作了描述。该载体的35S启动子包含两段5’端起始位点的ATG序列。这些位点用标准PCR技术进行突变以消除ATG并产生SspI和PvuII限制性酶切位点。新的酶切位点距离SalI位点96和37bp，距真正的起始位点101和42bp。所得的pCIB246衍生物指定为pCIB3025。用SalI和SacI消化pCIB3025，从中切除GUS基因，末端钝化并重新连接从而生成pCIB3060质粒。从John Innes Centre，Norwich获取pJIT82质粒，并将含来源于绿色产色链霉菌bar基因的一段400bp SmaI片段切下来，插入pCIB3060的HpaI位点(Thompson等，1987，EBO J 62519-2523)。所产生的pCIB3064，包含处于CaMV35S启动子和终止子调控之下、进行除草剂选择的bar基因，具氨苄青霉素抗性的基因(进行大肠杆菌选择)及含有唯一SphI、PstI、HindIII和BamHI的多接头。该载体适宜于含自身调控信号的植物表达盒的克隆。
pSOG19和pSOG35pSOG35质粒是利用对氨甲蝶呤具有抗性的大肠杆菌二氢叶酸还原酶(DFR)基因作为选择标记的转化载体。用PCR扩增35S启动子(-800bp)、来自于玉米Adh1基因的内含子6(-550bp)和18bp来自于pSOG10的GUS未翻译前导序列。也用PCR扩增编码大肠杆菌II型二氢叶酸还原酶基因的一段250bp片段，并将这两个片段用来自于pB1221(Clontech)的SacI-PstI片段装配，其中pB1221包含pUC19载体主链和胭脂碱合酶终止子。将这些片段装配起来后生成pSOG19，包含与内含子6序列融合的35S启动子、GUS前导序列、DHFR基因及胭脂碱合酶终止子。用来自于玉米褪绿斑点病毒(MCMV)的前导序列取代pSOG19中的GUS前导序列生成pSOG35。pSOG19和pSOG35携带有氨苄青霉素抗性的pUC基因，并具有可用于外源物质克隆的HindIII、SphI、PstI和EcoRI位点。
适宜于叶绿体转化的的载体使用质体转化载体pPH143(WO 97/32011，实施例36，1997年9月4日公布，Novartis)在植物质体中表达本发明的核苷酸序列。将核苷酸序列插入pPH143以取代编码PROTOX的序列。然后将该载体用于质体转化并进行壮观霉素抗性选择。此外，将核苷酸序列插入pPH143以取代aadH基因。此时，转化体可由PROTOX抑制剂抗性进行选择。
III.转化方法按照本发明转化的植物可以单子叶或双子叶植物，包括但不限于玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、菜豆、碗豆、菊苣、莴苣、卷心菜、花椰菜、椰菜、芜箐、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、葫芦瓜、南瓜、大麻、西葫芦、苹果、梨、温柏、甜瓜、卡诺拉、李、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高梁、甘蔗、甜菜、向日葵、苜蓿、烟草、胡萝卜、棉、紫花苜蓿、水稻、土豆、茄子、黄瓜、拟南芥及诸如松类和落叶植物的木质植物，尤其是玉米、小麦或甜菜。
一旦需要的DNA序列转化入特定的植物物种中，它可在该物种中繁殖或利用传统的培育技术进入相同种属的其他变体，尤其包括商用变体。
下面说明了转化双子叶植物或单子叶植物的代表性技术以及代表性的质体转化技术。
双子叶植物的转化双了叶植物的转化技术在本领域内众所周知，包括基于土壤杆菌的技术和不需要土壤杆菌的技术。非土壤杆菌的技术涉及原生质体或细胞对外源基因物质的直接摄取。这一点可通过PEG或电穿孔介导的摄取、微粒轰击介导的输送或微注射完成。Paxzkowski等，1984，EMBO J 32717-2722；Potrykus等，1985，Mol.Gen.Genet.199169-177；Reich等，1986，Biotechnology 41001-1004；以及Klein等，1987，Nature 32770-73等描述了这些技术的实例。在各种情况下转化的细胞用本领域内已知的技术再生成完整的植物。
因为其转化效率高和可广泛为许多不同的物种所利用，土壤杆菌介导的转化是用于双子叶的优选技术。土壤杆菌转化通常涉及将携带目标外源DNA的双元载体(如pCIB200或pCIB2001)转到适当的土壤杆菌菌株，该菌株需要宿主土壤杆菌菌株中共存Ti质粒或染色体(例如，pCIB200和pCIB2001的CIB542菌株(Uknes等，1993，Plant Cell 5159-169))上所携带vir基因的互补。重组载体向土壤杆菌的转移用携带该重组双元载体的大肠杆菌通过三亲体配对方法完成，其中携带重组双元载体的大肠杆菌为携带诸如pRK2013的质粒并能把重组载体移到目标土壤杆菌的辅助大肠杆菌。此外，该重组双元载体可通过DNA转化转到土壤杆菌(Hfgen & Willmitzer，1988，Nucl.Acids Res.169877)。
用重组土壤杆菌对目标植物种属的转化通常涉及土壤杆菌与来自于该植物的外植体共培养，以及遵循本领域内熟知的方案。在选择性培养基上使转化的组织再生，其中该选择性培养基携带有位于双链质粒T-DNA边界间的抗生素或除草剂抗性标记。
用基因转化植物细胞的另一途径涉及在植物组织或细胞推进无活性或具有生物活性的颗粒。美国专利NO.4,945,050、5,036,006及5,100,792公开了此技术，均颁给Sanford等(分别于1990年7月31日、1991年7月30日和1992年3月31日颁发)。一般地，该方法涉及在有效穿透细胞外表面及其提供掺入内部的条件下推进无活性或具生物活性的颗粒。当使用无活性颗粒时，可用含目的基因的载体包被颗粒，从而将载体导入细胞。此外，目标细胞可用载体包围以便该载体可通过颗粒的激发而进入细胞。生物活性的颗粒(如干酵母细胞、干细菌或细菌噬菌体，均含有需要引入的DNA)也可推进植物细胞组织中。
单子叶植物的转化大部分单子叶植物种属的转化现在也成为常规了。优选的技术包括用PEG(聚乙二醇)或电穿孔技术及颗粒轰击将基因直接转入愈合组织中。转化可用单个DNA种属或多DNA种属(即共转化)实施，这些均适用于本发明。共转化具有避免完全载体构建，产生转基因植物该目标基因与选择标记的非链接基因座、选择标记可在后来的子代中去除的优势，这样是非常理想的。然而，使用共转化的一个劣势是分离的DNA种属整合入基因组的频率少于100％(Schocher等，1986，Biotechnology 41093-1096)。
专利申请EP 0 292 435(1995年7月26日颁给Ciba Geigy)、EP0 392 225(1991年9月25日公布，Ciba Geigy)和WO 93/07278(1993年4月15日公布，Ciba Geigy)描述了从玉米原种近交系制备愈合组织和原生质体的技术、用PEG或电穿孔技术进行转化的技术和从转化的原生体再生玉米植物的技术。Gordon-Kamm等(1990，Plant Cell2603-618)及Fromm等(1990，Biotechnology 8833-839)公开了用颗粒轰击转化A188衍生的玉米系的技术。而且，WO 93/07278(1993年4月15日公布，Ciba Geigy)和Koziel等(1993，BioTechnology 11194-200)描述了用颗粒轰击转化玉米原种近交系的技术。此技术利用从授粉14-15天后的玉米穗切下来长1.5-2.5mm的未成熟玉米胚，pDS-1000He生物弹射装置用于轰击。
水稻的转化也可利用原生质体或颗粒轰击的直接基因转移技术完成。已描述了原生质体介导的转化用于japonica-type及Indica-type(Zhang等，1988，Plant Cell Rep 7379-384；Shimamoto等，1989，Nature 338274-277；Datta等，1990，Biotechnology 8736-740)。两种类型均可用颗粒轰击进行常规转化(Christou等，1991，Biotechnology 9957-962)。而且，WO 93/21335(1993年11月28日公开，Plant Genetic Systems)描述了通过电穿孔转化水稻的技术。专利申请0 332 581(1996年12月11日颁给Ciba Geigy)描述了产生、转化及再生Pooideae原生质体的技术。这些技术可以实现Dactylis及小麦的转化。此外，Vasil等(1992，Biotechnology 10667-674)描述了利用颗粒轰击入C型长期可再生愈合组织细胞的小麦转化，Vasil等(1993，Biotechnology 111553-1558)和Weeks等(1993，Plant Physiol.1021077-1084)也描述了用未成熟胚及未成熟胚衍生的愈合组织的小麦转化。然而小麦转化的优选技术涉及通过未成熟胚的颗粒轰击的小麦转化，包括在基因输送前的高蔗糖或高麦芽糖的步骤。在轰击前，将任意数量的胚(长0.75-1mm)种植到含3％蔗糖和3mg/L 2，4-D的MS培养基上(Murashiga & Skoog，1962，PhysiologiaPlantarum 15473-497)以诱导体细胞胚，此步可以在黑暗中进行。在选择轰击当天，将胚从诱导培养基取下来置于渗压剂上(即含加入所需浓度蔗糖或麦芽糖的诱导培养基，浓度典型为15％)。可使胚的胞质皱缩2-3小时，然后轰击。尽管不是关键的，通常是每目标板24个胚。利用标准方法将携带基因的合适质粒(如pCIB3064或pSG35)沉淀到微米大小的金颗粒上。用DuPont BioListics氦装置以约1000psi的脉压使用标准80目屏幕对每一板胚射击。轰击之后，胚放回到黑暗中恢复约24小时(仍在渗压剂上)。24小时后，将胚从渗压剂上移下来并放回诱导培养基，在再生前放置约一个月。约一个月后胚外植体与正在发育的胚愈合组织转到含合适选择试剂(pCIB3064时是10mg/L basta，pSOG35时是2mg/L氨甲蝶呤)的再生培养基上(MS+1mg/L NAA，5mg/L GA)。经过约一个月后，发育的芽转至更大的诸如“GA7s”的无菌容器中，其含有一半浓度的MS、2％蔗糖、及同样浓度的选择试剂。
利用土壤杆菌转化单子叶植物已有描述。参见WO 94/00977(1994年1月20日公布，日本烟草公司)及美国专利NO.5,591,616(1997年1月7日颁给日本烟草公司)，其内容在此引入作为参考。
质体的转化基本按方法所述(Svab，Z.和Maliga，P.，1993，PNAS 90，913-917)，Nicotiana tabacum c.v.‘Xanthi nc’的种子在T琼脂培养基上以每板七个呈1”环形排列发芽，播种12-14天后用来源于pPH143及pPH145质粒的DNA包被的1μm钨颗粒(M10，Biorad，Hercules，CA)轰击。轰击后的幼苗在T培养基上孵育2天，然后将叶切下来置于明光(350-500umol光子/m2/s)上远轴一侧含500μg/ml二盐酸壮观霉素(Sigma，St.Louis，MO)的RMOP培养基(Svab，Z.，Hajdukiewica，p.和Maliga，p.，1990，PNAS 87，8526-8530)板上。轰击3到8周后仍底层叶仍是原色的稳定芽亚克隆到相同的选择培养基，使其形成愈合组织，分离次级芽并进行亚克隆。用标准Souther印迹技术(Sambrook等，1989，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港)分析独立亚克隆中完全分离的已转化质体基因组拷贝(同质体)。BamHI/EcoRI消化的总细胞DNA(Mettler，I.J.，1987，Plant MolBiol reporter 5，346-349)在1％Tris硼酸盐(TBE)琼脂糖凝胶上分离，转到尼龙膜(Amersham)上，并根据来自于含rps7/12质体目标序列一部分的PC8的0.7kb BamHI/HindIII DNA片段，用32P-标记的随机引物DNA序列探测。同质的芽以无菌方式种到含链霉素的MS/IBA培养基中(McBride，K.E.等，1994，PNAS 91，7301-7305)并转移到温室里。
本发明将进一步描述下列实施例，这些实施例不以任何方式对本实施例1推断的Nov9x氨基酸序列(SEQ ID NO1)用GCG分析程序Backtranslate和高表达玉米基因密码子表(参见美国专利NO.5,625,136)转化成玉米优化的核酸序列。由Integrated DNA technologies，Inc.公司(Coralville，IA)制备合成的基因。
Nov9x植酸酶氨基酸序列(8个突变以粗体和下划线标明)(SEQID NO1)MAQSEPELKLESVVIVSRHGVRAPTKATQLMQDVTPDAWPTWPVKLGELTPRGGELIAYLGHYWRQRLVADGLLPKCGCPQSGQVAIIADVDERTRKTGEAFAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPLKTGVCQLDNANVTDAILERAGGSIADFTGHYQTAFRELERVLNFPQSNLCLKREKQDESCSLTQALPSELKVSADCVSLTGAVSLASMLTEIFLLQQAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFDLLQRTPEVARSRATPLLDLIKTALTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALELNWTLPGQPDNTPPGGELVFERWRRLSDNSQWIQVSLVFQTLQQMRDKTPLSLNTPPGEVKLTLAGCEERNAQGMCSLAGFTQIVNEARIPACSLNov9x植酸酶经玉米优化的核酸序列(SEQ ID NO2)5’和3’末端分别包括BamHI和SacI克隆位点(下划线标明)。起始密码和终止密码以粗体显示。
GGATCCACCATGGCGCAGTCCGAGCCGGAGCTGAAGCTGGAGTCCGTGGTGATCGTGTCCCGCCACGGCGTGCGCGCCCCGACCAAGGCCACCCAGCTCATGCAGGACGTGACCCCGGACGCCTGGCCGACCTGGCCGGTGAAGCTCGGCGAGCTGACCCCGCGCGGCGGCGAGCTGATCGCCTACCTCGGCCACTACTGGCGCCAGCGCCTCGTGGCCGACGGCCTCCTCCCGAAGTGCGGCTGCCCGCAGTCCGGCCAGGTGGCCATCATCGCCGACGTGGACGAGCGCACCCGCAAGACCGGCGAGGCCTTCGCCGCCGGCCTCGCCCCGGACTGCGCCATCACCGTGCACACCCAGGCCGACACCTCCTCCCCGGACCCGCTCTTCAACCCGCTCAAGACCGGCGTGTGCCAGCTCGACAACGCCAACGTGACCGACGCCATCCTGGAGCGCGCCGGCGGCTCCATCGCCGACTTCACCGGCCACTACCAGACCGCCTTCCGCGAGCTGGAGCGCGTGCTCAACTTCCCGCAGTCCAACCTCTGCCTCAAGCGCGAGAAGCAGGACGAGTCCTGCTCCCTCACCCAGGCCCTCCCGTCCGAGCTGAAGGTGTCCGCCGACTGCGTGTCCCTCACCGGCGCCGTGTCCCTCGCCTCCATGCTCACCGAAATCTTCCTCCTCCAGCAGGCCCAGGGCATGCCGGAGCCGGGCTGGGGCCGCATCACCGACTCCCACCAGTGGAACACCCTCCTCTCCCTCCACAACGCCCAGTTCGACCTCCTCCAGCGCACCCCGGAGGTGGCCCGCTCCCGCGCCACCCCGCTCCTCGACCTCATCAAGACCGCCCTCACCCCGCACCCGCCGCAGAAGCAGGCCTACGGCGTGACCCTCCCGACCTCCGTGCTCTTCATCGCCGGCCACGACACCAACCTCGCCAACCTCGGCGGCGCCCTGGAGCTGAACTGGACCCTCCCGGGCCAGCCGGACAACACCCCGCCGGGCGGCGAGCTGGTGTTCGAGCGCTGGCGCCGCCTCTCCGACAACTCCCAGTGGATTCAGGTGTCCCTCGTGTTCCAGACCCTCCAGCAGATGCGCGACAAGACCCCGCTCTCCCTCAACACCCCGCCGGGCGAGGTGAAGCTCACCCTCGCCGGCTGCGAGGAGCGCAACGCCCAGGGCATGTGCTCCCTCGCCGGCTTCACCCAGATCGTGAACGAGGCCCGCATCCCGGCCTGCTCCCTCTAATAGAGCTCA.制备具玉米优化植酸酶基因的表达盒构建下列表达盒以在带各种靶信号的玉米种子中表达Nov9X植酸酶。Nov9X编码序列的5’末端有BamHI克隆位点，3’末端有SacI克隆位点。
pNOV4054包含与合成Nov9X植酸酶融合的γ-玉米醇溶蛋白N-末端信号序列(MRVLLVALALLALAASATS)(SEQ ID NO3)，它将植酸酶靶向到内质网并分泌到质外体中(Torrent等，1997)。紧接信号序列的第一个残基是Ala，它取代了Nov9x的Met1。
pNOV4054植酸酶融合氨基酸序列(SEQ ID NO4)(γ-玉米醇溶蛋白以粗体显示)
MRVLLVALALLALAASATSAAQSEPELKLESVVIVSRHGVRAPTKATQLMQDVTPDAWPTWPVKLGELTPRGGELIAYLGHYWRQRLVADGLLPKCGCPQSGQVAIIADVDERTRKTGEAFAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPLKTGVCQLDNANVTDAILERAGGSIADFTGHYQTAFRELERVLNFPQSNLCLKREKQDESCSLTQALPSELKVSADCVSLTGAVSLASMLTEIFLLQQAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFDLLQRTPEVARSRATPLLDLIKTALTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALELNWTLPGQPDNTPPGGELVFERWRRLSDNSQWIQVSLVFQTLQQMRDKTPLSLNTPPGEVKLTLAGCEERNAQGMCSLAGFTQIVNEARIPACSLpNOV4054植酸酶融合核苷酸序列(SEQ ID NO5)显示了旁侧的5’BamHI和3’SacI克隆位点(下划线标明)。起始密码和终止密码以粗体显示。
GGATCCACCATGAGGGTGTTGCTCGTTGCCCTCGCTCTCCTGGCTCTCGCTGCGAGCGCCACCAGCGCTGCGCAGTCCGAGCCGGAGCTGAAGCTGGAGTCCGTGGTGATCGTGTCCCGCCACGGCGTGCGCGCCCCGACCAAGGCCACCCAGCTCATGCAGGACGTGACCCCGGACGCCTGGCCGACCTGGCCGGTGAAGCTCGGCGAGCTGACCCCGCGCGGCGGCGAGCTGATCGCCTACCTCGGCCACTACTGGCGCCAGCGCCTCGTGGCCGACGGCCTCCTCCCGAAGTGCGGCTGCCCGCAGTCCGGCCAGGTGGCCATCATCGCCGACGTGGACGAGCGCACCCGCAAGACCGGCGAGGCCTTCGCCGCCGGCCTCGCCCCGGACTGCGCCATCACCGTGCACACCCAGGCCGACACCTCCTCCCCGGACCCGCTCTTCAACCCGCTCAAGACCGGCGTGTGCCAGCTCGACAACGCCAACGTGACCGACGCCATCCTGGAGCGCGCCGGCGGCTCCATCGCCGACTTCACCGGCCACTACCAGACCGCCTTCCGCGAGCTGGAGCGCGTGCTCAACTTCCCGCAGTCCAACCTCTGCCTCAAGCGCGAGAAGCAGGACGAGTCCTGCTCCCTCACCCAGGCCCTCCCGTCCGAGCTGAAGGTGTCCGCCGACTGCGTGTCCCTCACCGGCGCCGTGTCCCTCGCCTCCATGCTCACCGAAATCTTCCTCCTCCAGCAGGCCCAGGGCATGCCGGAGCCGGGCTGGGGCCGCATCACCGACTCCCACCAGTGGAACACCCTCCTCTCCCTCCACAACGCCCAGTTCGACCTCCTCCAGCGCACCCCGGAGGTGGCCCGCTCCCGCGCCACCCCGCTCCTCGACCTCATCAAGACCGCCCTCACCCCGCACCCGCCGCAGAAGCAGGCCTACGGCGTGACCCTCCCGACCTCCGTGCTCTTCATCGCCGGCCACGACACCAACCTCGCCAACCTCGGCGGCGCCCTGGAGCTGAACTGGACCCTCCCGGGCCAGCCGGACAACACCCCGCCGGGCGGCGAGCTGGTGTTCGAGCGCTGGCGCCGCCTCTCCGACAACTCCCAGTGGATTCAGGTGTCCCTCGTGTTCCAGACCCTCCAGCAGATGCGCGACAAGACCCCGCTCTCCCTCAACACCCCGCCGGGCGAGGTGAAGCTCACCCTCGCCGGCTGCGAGGAGCGCAACGCCCAGGGCATGTGCTCCCTCGCCGGCTTCACCCAGATCGTGAACGAGGCCCGCATCCCGGCCTGCTCCCTCTAATAGAGCTC
pNOV4058包含与合成Nov9X植酸酶融合的γ-玉米醇溶蛋白N-末端信号序列，其中Nov9X植酸酶C末端带有附加的一段SEKDEL序列以便将其靶向并固定于内质网内(Munro和Pelham，1987)。紧接信号序列的第一个残基是Ala，它取代了Nov9x的Met1。
pNOV4058植酸酶融合氨基酸序列(SEQ ID NO6)(N-末端的γ-玉米醇溶蛋白和C-末端的SEKDEL序列以粗体显示)MRVLLVALALLALAASATSAAQSEPELKLESVVIVSRHGVRAPTKATQLMQDVTPDAWPTWPVKLGELTPRGGELIAYLGHYWRQRLVADGLLPKCGCPQSGQVAIIADVDERTRKTGEAFAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPLKTGVCQLDNANVTDAILERAGGSLADFTGHYQTAFRELERVLNFPQSNLCLKREKQDESCSLTQALPSELKVSADCVSLTGAVSLASMLTEIFLLQQAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFDLLQRTPEVARSRATPLLDLIKTALTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFLAGHDTNLANLGGALELNWTLPGQPDNTPPGGELVFERWRRLSDNSQWIQVSLVFQTLQQMRDKTPLSLNTPPGEVKLTLAGCEERNAQGMCSLAGFTQIVNEARIPACSLSEKDELpNOV4058植酸酶融合核苷酸序列(SEQ ID NO7)显示了旁侧的5’BamHI和3’SacI克隆位点(下划线标明)。编码γ-玉米醇溶蛋白信号序列和SEKDEL信号序列的序列以粗体显示。
GGATCCACCATGAGGGTGTTGCTCGTTGCCCTCGCTCTCCTGGCTCTCGCTGCGAGCGCCACCAGCGCTGCGCAGTCCGAGCCGGAGCTGAAGCTGGAGTCCGTGGTGATCGTGTCCCGCCACGGCGTGCGCGCCCCGACCAAGGCCACCCAGCTCATGCAGGACGTGACCCCGGACGCCTGGCCGACCTGGCCGGTGAAGCTCGGCGAGCTGACCCCGCGCGGCGGCGAGCTGATCGCCTACCTCGGCCACTACTGGCGCCAGCGCCTCGTGGCCGACGGCCTCCTCCCGAAGTGCGGCTGCCCGCAGTCCGGCCAGGTGGCCATCATCGCCGACGTG
GACGAGCGCACCCGCAAGACCGGCGAGGCCTTCGCCGCCGGCCTCGCCCCGGACTGCGCCATCACCGTGCACACCCAGGCCGACACCTCCTCCCCGGACCCGCTCTTCAACCCGCTCAAGACCGGCGTGTGCCAGCTCGACAACGCCAACGTGACCGACGCCATCCTGGAGCGCGCCGGCGGCTCCATCGCCGACTTCACCGGCCACTACCAGACCGCCTTCCGCGAGCTGGAGCGCGTGCTCAACTTCCCGCAGTCCAACCTCTGCCTCAAGCGCGAGAAGCAGGACGAGTCCTGCTCCCTCACCCAGGCCCTCCCGTCCGAGCTGAAGGTGTCCGCCGACTGCGTGTCCCTCACCGGCGCCGTGTCCCTCGCCTCCATGCTCACCGAAATCTTCCTCCTCCAGCAGGCCCAGGGCATGCCGGAGCCGGGCTGGGGCCGCATCACCGACTCCCACCAGTGGAACACCCTCCTCTCCCTCCACAACGCCCAGTTCGACCTCCTCCAGCGCACCCCGGAGGTGGCCCGCTCCCGCGCCACCCCGCTCCTCGACCTCATCAAGACCGCCCTCACCCCGCACCCGCCGCAGAAGCAGGCCTACGGCGTGACCCTCCCGACCTCCGTGCTCTTCATCGCCGGCCACGACACCAACCTCGCCAACCTCGGCGGCGCCCTGGAGCTGAACTGGACCCTCCCGGGCCAGCCGGACAACACCCCGCCGGGCGGCGAGCTGGTGTTCGAGCGCTGGCGCCGCCTCTCCGACAACTCCCAGTGGATTCAGGTGTCCCTCGTGTTCCAGACCCTCCAGCAGATGCGCGACAAGACCCCGCTCTCCCTCAACACCCCGCCGGGCGAGGTGAAGCTCACCCTCGCCGGCTGCGAGGAGCGCAACGCCCAGGGCATGTGCTCCCTCGCCGGCTTCACCCAGATCGTGAACGAGGCCCGCATCCCGGCCTGCTCCCTCTCCGAGAAGGACGAGCTGTAATAGAGCTCB.分离用于玉米中胚乳特异表达的启动子从pGZ27.3质粒将来自于玉米γ-玉米醇溶蛋白基因的启动子扩增673bp的片段。γ-玉米醇溶蛋白具有胚乳特异性(Torrent等，1997)。将HindIII和BamHI克隆位点分别导入5’和3’末端。这些位点以下划线标明。
玉米γ-玉米醇溶蛋白基因启动子核酸序列(SEQ ID NO8)AAGCTTCGATCATCCAGGTGCAACCGTATAAGTCCTAAAGTGGTGAGGAACACGAAACAACCATGCATTGGCATGTAAAGCTCCAAGAATTTGTTGTATCCTTAACAACTCACAGAACATCAACCAAAATTGCACGTCAAGGGTATTGGGTAAGAAACAATCAAACAAATCCTCTCTGTGTGCAAAGAAACACGGTGAGTCATGCCGAGATCATACTCATCTGATATACATGCTTACAGCTCACAAGACATTACAAACAACTCATATTGCATTACAAAGATCGTTTCATGAAAAATAAAATAGGCCGGACAGGACAAAAATCCTTGACGTGTAAAGTAAATTTACAACAAAAAAAAAGCCATATGTCAAGCTAAATCTAATTCGTTTTACGTAGATCAACAACCTGTAGAAGGCAACAAAACTGAGCCACGCAGAAGTACAGAATGATTCCAGATGAACCATCGACGTGCTACGTAAAGAGAGTGACGA
GTCATATACATTTGGCAAGAAACCATGAAGCTGCCTACAGCCGTCTCGGTGGCATAAGAACACAAGAAATTGTGTTAATTAATCAAAGCTATAAATAACGCTCGCATGCCTGTGCACTTCTCCATCACCACCACTGGGTCTTCAGACCATTAGCTTTATCTACTCCAGAGCGCAGAAGAACCCGATCGACAGGATCCC.分离用于玉米中胚芽特异表达的启动子用从GenBank登记号L22344设计的引物，将来自于玉米基因组DNA中主要玉米胚芽球蛋白glob1的启动子和5’非编码区扩增成1427个碱基对的片段。该球蛋白启动子主要是胚芽特异性(Belanger和Kriz，1989)。将HindIII和BamHI克隆位点分别导入5’和3’末端。这些位点以下划线标明。
玉米球蛋白1启动子核酸序列(SEQ ID NO9)AAGCTTAGTGCCATCCTTGGACACTCGATAAAGTATATTTTATTTTTTTTATTTTGCCAACCAAACTTTTTGTGGTATGTTCCTACACTATGTAGATCTACATGTACCATTTTGGCACAATTACATATTTACAAAAATGTTTTCTATAAATATTAGATTTAGTTCGTTTATTTGAATTTCTTCGGAAAATTCACATTTAAACTGCAAGTCACTCGAAACATGGAAAACCGTGCATGCAAAATAAATGATATGCATGTTATCTAGCACAAGTTACGACCGATTTCAGAAGCAGACCAGAATCTTCAAGCACCATGCTCACTAAACATGACCGTGAACTTGTTATCTAGTTGTTTAAAAATTGTATAAAACACAAATAAAGTCAGAAATTAATGAAACTTGTCCACATGTCATGATATCATATATAGAGGTTGTGATAAAAATTTGATAATGTTTCGGTAAAGTTGTGACGTACTATGTGTAGAAACCTAAGTGACCTACACATAAAATCATAGAGTTTCAATGTAGTTCACTCGACAAAGACTTTGTCAAGTGTCCGATAAAAAGTACTCGACAAAGAAGCCGTTGTCGATGTACTGTTCGTCGAGATCTCTTTGTCGAGTGTCACACTAGGCAAAGTCTTTACGGAGTGTTTTTCAGGCTTTGACACTCGGCAAAGCGCTCGATTCCAGTAGTGACAGTAATTTGCATCAAAAATAGCTGAGAGATTTAGGCCCCGTTTCAATCTCACGGGATAAAGTTTAGCTTCCTGCTAAACTTTAGCTATATGAATTGAAGTGCTAAAGTTTAGTTTCAATTACCACCATTAGCTCTCCTGTTTAGATTACAAATGGCTAAAAGTAGCTAAAAAATAGCTGCTAAAGTTTATCTCGCGAGATTGAAACAGGGCCTTAAAATGAGTCAACTAATAGACCAACTAATTATTAGCTATTAGTCGTTAGCTTCTTTAATCTAAGCTAAAACCAACTAATAGCTTATTTGTTGAATTACAATTAGCTCAACGGAATTCTCTGTTTTTTCTATAAAAAAAGGGAAACTGCCCCTCATTTACAGCAAATTGTCCGCTGCCTGTCGTCCAGATACAATGAACGTACCTAGTAGGAACTCTTTTACACGCTCGGTCGCTCGCCGCGGATCGGAGTCCCAGGAACACGACACCACTGTGTAACACGACAAAGTCTGCTCAGAGGCGGCCACACCCTGGCGTGCACCGAGCCGGAGCCCGGATAAGCACGGTAAGGAGAGTACGGCGGGACGTGGCGACCCGT
GTGTCTGCTGCCACGCAGCCTTCCTCCACGTAGCCGCGCGGCCGCGCCACGTACCAGGGCCCGGCGCTGGTATAAATGCGCGCTACCTCCGCTTTAGTTCTGCATACAGTCAACCTAACACACCCGAGCATATCACAGTGGGATCCD.构建玉米优化植酸酶基因的植物转化载体构建玉米转化的双元载体通过两个步骤完成。在第一步中，将三个片段融合以产生表达盒。该表达盒由以融合方式连接的HindIII-BamHI启动子盒(上述B和C部分)、BamHI-SacI Nov9x盒(上述A部分)和SacI-KpnI终止子盒组成。终止子盒包括一个反向的PEPC内含子。将表达盒以HindIII-BamHI片段转到pNOV2117双元载体中，pNOV2117含磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因，可用甘露糖对转基因细胞进行选择。
制备的植物转化双元载体概况如表1。将此6个载体导入玉米内。
表1所列的Nov9X双元载体均含相同的带PEPC内含子的终止子盒。pNOV4051、4055、4059载体含球蛋白启动子盒，pNOV4053、4057、4059载体含γ-玉米醇溶蛋白启动子盒。pNOV4051和4053载体含有如SEQ ID NO2所示序列、具有胞浆靶向性的Nov9X。pNOV4055和4057载体含有来自于pNOV4054、具有质外体靶向性的Nov9X。pNOV4059和4061载体含有来自于pNOV4058、具有内质网停留性的Nov9X。
表1
载体pNOV4057和pNOV4059已于2001年12月28日保藏于位于大学街1815N，Peoria，Illinois 61604，USA的美国农业研究培养物保藏中心(NRRL)，保藏号分别为NRRL B-30537和NRRL B-30538。该中心是根据布达佩斯条约有关国际承认的、用于专利方法的微生物保藏目的建立的国际保藏机构。
实施例2玉米和小麦的基因修饰如上所述将插入适当载体中的合成Nov9X基因用土壤杆菌介导的转化导入玉米，用生物弹射转化导入小麦。根据美国专利NO.5,767,378和5,994,629，使用Positech系统使稳定的转化体在选择性培养基人从组织再生。
土壤杆菌介导的玉米转化基本上按照Negrotto等，2000，Plant Cell Reports 19798-803所述实施未成熟玉米胚芽的转化。其中所述的各种培养基成分可以加以替换。
转化质粒和选择标记用于转化的基因克隆入上述适宜于玉米转化的载体中。所用载体含作为选择标记的磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因(Negrotto等，2000，Plant Cell Reports 19798-803)。
根瘤土壤杆菌的制备含植物转化质粒的土壤杆菌株LBA4404(pSB1)置YEP固体培养基(酵母提取物(5g/L)，蛋白胨(10g/L)，NaCl(5g/L)，15g/L琼脂，pH6.8)上于28℃生长2到4天。将约0.8×109重组质粒转化土壤杆菌悬浮于含100μM乙酰丁香酮(As)的LS-inf培养基(LSAs培养基)中(Negrotto等，2000，Plant Cell Reports 19798-803)细菌在此培养基中预诱导30-60分钟。
接种将来自于A188或其他合适玉米基因型的未成熟胚芽从8～12天龄的穗切下来，置于液态LS-inf+100μM As(LSAs)。胚芽涡旋5秒，用新鲜感染培养基漂洗一遍。弃去感染培养基，加入土壤杆菌溶液，胚芽涡旋30秒，让其与稳定于细菌上5分钟。然后将胚芽转到盾片覆盖的LSAs培养基，于黑暗中培养2～3天。随后，以每petri皿20～25个胚芽将其转到补充有头孢噻肟(250mg/L)和硝酸银(1.6mg/L)的LSDc培养基中(Negrotto等，2000)，在黑暗中于28℃培养约10天。
转化细胞的选择和转化植物的再生将生成胚芽性愈合组织的未成熟胚芽转到LSD1M0.5S培养基(含取代二氯甲氧苯酸0.5mg/L 2，4-D、10g/L甘露糖、5g/L蔗糖、不含硝酸盐的LSDc)。培养物在此培养基上选择6周，在3周时进行亚培养步骤。幸存的愈合组织转移到LSD1M0.5S培养基使其发胀，或转移到Reg1培养基(如Negrotto等，2000所述)。在明光(方案为16小时光/8小时暗)下培养后，将绿色组织转到不含生长调控剂(如Negrotto等，2000所述)的Reg2培养基，孵育1～2周。将幼苗转到含Reg3培养基的Magenta GA-7盒子中(Magenta公司，Chicago III.)，在光线下生长。Nov9X表达盒PCR阳性的植物转到土壤中，于温室内生长。
DNA分析用+/-PCR测试或Taqman拷贝数测试来测定Nov9X基因的存在。用Taqman拷贝数测试测定PMI选择标记的存在。用+/-PCR测试测定链霉素抗性选择性标记。
实施例3玉米种子的蛋白提取物在授粉24～40天后或约30天时(DAP)收割第一代和第二代转基因玉米植物的穗。新鲜的谷粒和分离的胚乳于室温在水中粉碎。用研钵和杵在水中提取蛋白。
此外，将谷粒置穗轴上于105°F干燥5天。用Kleco组织粉碎机于室温将干谷粒粉碎约20～30秒，得到粉末。100mg粉末加1ml缓冲液，于室温孵育20分钟，将蛋白提取出来。
4℃离心10分钟，除去不溶物质。提取物置冰上。用ADV01蛋白检测试剂(Cytoskeleton，Denver，CO)以BSA为标准测定蛋白浓度。蛋白测定在96孔板中以310μl反应体系进行。用SpectraMaxPlus读板仪(Molecular Devices)测量595nm的吸光度。典型地，10μl 10倍稀释提取物进一步用300μl ADV01试剂稀释。
酶测定植酸酶活性的评估植酸酶活性的测定可按照Englelen等(2001)所述方法在37℃进行，其活性基于评估肌醇六磷酸水解释放的无机磷酸盐含量。一个酶活性单位定义为在测定条件下每分钟释放1μmol无机磷酸盐所需的酶用量。例如，植酸酶活性可以这样测量将2.0ml酶制品与4.0ml的9.1mM肌醇六磷酸混合于37℃孵育60分钟，其中肌醇六磷酸溶于pH5.5、补充有1mM CaCl2的250mM醋酸钠缓冲液；孵育后，加入4.0ml显色终止试剂终止反应，终止试剂由等量的的10％(w/v)钼酸铵和0.235％(w/v)钒酸铵储备液组成；对比磷酸盐在415nm处的一系列分光光度标准测量所释放的磷酸盐含量。用生成的标准曲线将含植酸酶样品所测得的A415nm吸收值进行插值计算植酸酶活性。此外，用植酸酶标准品生成的植酸酶活性曲线可以代替磷酸盐标准曲线来测定酶活性，植酸酶标准品的活性由厂商担保。比活可以每mg蛋白的酶活性单位表示。
此外，也可按Wyss等，1999的方法稍作修改测量植酸酶活性。测定在1.5ml试管和96孔微量反应板中进行。试管测定时，将5μl的1M醋酸钠(pH4.5)、10μl的10mM肌醇六磷酸(Sigma目录号P8810)、5μl的1M蒸馏水与5μl稀释提取物混合一起，开始测定。反应液于37℃孵育10分钟，将试管置于冰上，立即加入25μl 15％三氯醋酸(TCA)结束反应。终止反应液用450μl蒸馏水稀释。
加入500μl比色试剂(0.6M硫酸、2％抗坏血酸和0.5％钼酸铵)开始磷酸盐浓度的比色测定，于50℃孵育15分钟。测定800nm处的吸收值并与磷酸钾标准曲线比较，以此测定磷酸盐的浓度。
在微量反应板(平底，孔容量为300μl)中测定时，将20μl的1M醋酸钠、40μl的10mM肌醇六磷酸和40μl稀释提取物混合，开始测定。混合时反应板置于冰上。反应板用箔密封，置反应板加热仪(Boekel-Grant PH-100)于37℃放置10分钟。然后将反应板转到冰上，加入100μl的15％TCA结束反应。取15μl终止反应液用135μl蒸馏水在第二块反应板上稀释，加入150μl比色剂开始比色反应。第二志反应板包括了磷酸盐标准品。反应板用箔密封，置反应板加热仪(Boekel-Grant PH-100)于50℃放置15分钟。对标准品和样品在820nm处的吸收值进行重复读数。
SDS-PAGE及Western印迹分析电泳样品缓冲液及流动缓冲液如Laemmli，1970。样品煮沸2分钟，然后用预凝的NOVEX Tris-进行甘氨酸凝胶(Invitrogen)电泳。电泳转移用NOVEX Mini-Cell系统(Invitrogen)按其操作方案和缓冲液配方进行。转移缓冲液含12mM Tris、96mM甘氨酸和20％甲醇。于25V和室温下将多肽向硝化纤维素(NOVEX LC2000)转移1～2小时。在30mM Tris-盐酸(pH10.2)、150mM NaCl和补充有3％BSA的0.05％吐温-20(TBST)中孵育，于室温封闭15分钟。
山羊初级免疫血清从Duncroft，Inc.公司(Lovettsville，VA)获得。将山羊与从大肠杆菌(从Diversa获得)提取的重组Nov9X植酸酶一起孵育。印迹与第一抗体(TBST以1∶2000稀释)一起于室温孵育1小时，然后用TBST洗涤35分钟。用TBST以1∶50,000稀释的第二抗体(小鼠抗-山羊IgG)重复此步骤。用增强化学发光使印迹显现出来。
实施例3用载体pNOV4057和pNOV4061转化的第一代转基因植物的玉米种子内Nov9X植酸酶的蓄积玉米种子所产生植酸酶的示范性制剂之一是液体提取物的形式。这里描述了去胚、水提取、加热和离心对Nov9X植酸酶的富集。
用来自两棵第一代转基因植物产生成熟穗的新鲜谷粒分析植酸酶活性。这些植物源自已用质粒pNOV4057(305A13事件)和pNOV4061(305B11事件)转化的胚芽。从不含Nov9X植酸酶基因的第三方穗获得相同年龄的新鲜谷粒。此对照植物(264A8C#14事件)包含pNOV4314载体，其编码一种异源酶。各从三支穗取6粒谷粒和胚乳，用研钵和杵碾碎。在谷粒中加入ddH2O，到10ml。用混悬液的可溶性级分进行总蛋白和植酸酶活性的分析。
谷粒及胚乳提取物的植酸酶测定结果如图1所示。该测定测量了37℃孵育10分钟后反应液中的磷酸盐浓度。阴性对照组织的提取物也包括在内，以测定内源性磷本盐的水平(图1，上图)此北景磷酸盐水平可在数种基于对照样品粉末提取物的分析中重现(数据未列出)。进行背景磷酸盐校正后，计算两种含Nov9X植酸酶基因的植物中的植酸酶活性。植酸酶活性以从6粒谷类所提取的总单位表示，如图1的下图所示。来自于相同穗的谷粒和胚乳来说，其总植酸酶活性差异由于转基因分离所致。
图1中分析的各胚乳提取物均取一部分于60℃加热30分钟。如图2所示，这些提取物中的植酸酶活性不受加热影响。用SDS-PAGE对未加热和加热过的胚乳提取物样品进行分析(图2B)。Nov9X基因产物计算出来的大小为43kDa。提取物中存在大量大小为40-50kD的蛋白。在加热过程中，此蛋白保持可溶，是加热后胚乳提取物可溶性组分中含量最多的组分。将来自于山羊的抗血清与大肠杆菌产生的的Nov9X一起孵育，进行Western印迹分析，鉴别到了凝胶中此区域内的条带。此条带是重组植酸酶的良好侯选者。
液体制剂的另一酶来源是用干燥种子或从干燥种子获得的粉末。可对种子碾磨以生成粉末。从数种植物于30DAP(授粉后天数)收获的种子于105°F干燥5天。干燥的种子如前所述粉碎、用缓冲液提取蛋白。22棵植物谷类提取物的植酸酶活性比较如图3所示。此分析包括了24棵植物初筛时具有最高植酸酶活性的4棵植物。
玉米种子产生的另一示范性植酸酶制剂是破碎或碾碎的谷粒或粉末。含植酸酶的粉末可作为补充剂直接加到动物饲料中，或可进一步加工，如加工成小丸的形式。下面的试验比较了液体提取物与粉末的植酸酶活性。取20毫克(mg)粉末200μl缓冲液于室温孵育20分钟。将一列试管置冰上冷却，同时将第二列试管中的不溶物质于4℃离心将其除去。第一列试管的总悬液及第一列试管的总悬液用提取缓冲液稀释，使终体积为5ml。加入肌醇六磷酸(10ml，0.1M)和醋酸钠(10ml，0.5M，pH5)，将试管于37℃孵育10分钟。终浓度为40mM肌醇六磷酸代表了上述所用标准方法的10倍提高。将反应液置冰上冷却，立即加入等体积(25μl)的15％TCA。离心(15分钟，4℃，3,700rpm)除去不溶的物质，取部分上清如上所述测量磷酸盐浓度。
将粉末提取物的植酸酶活性与粉本悬液的植酸酶活性进行比较，以测定缓冲液提取方法的效率。将全部谷粒粉末(20mg)与200μ提取缓冲液一起孵育，测定上清组分和粉末悬液的总植酸酶活性。结果如图4所示。上图显示了等量反应液中的总磷酸盐浓度。事件266B-2E是不含重组植酸酶的阴性对照。分析这些样品测内源磷酸盐的水平。事件305B-20A和305A-24A是分别用pNOV4061和pNOV4057载体转化的转基因植酸酶事件。黄色柱为含可溶提取物反应液中的磷酸盐浓度，蓝色柱为含粉末悬液的反应液中的磷酸盐浓度。对于两个转基因事件，均在转基因粉末存在的条件下释放出额外的磷酸盐。
图4的下图比较了两事件的可溶性提取物(黄色)和粉末悬液(蓝色)植酸酶活性。对于事件305B-20A(pNOV4061)和305A-24A(pNOV4057)，分别额外获得了50％和80％的活性，仍与粉末相关。
实施例4
Nov9x植酸酶在T2种子中的胚乳特异性表达授粉后于24天和26天收割含pNOV4057构建体的T2植物穗。每一植物取10粒谷粒分解成胚芽、胚乳和外壳。将10颗胚乳和10颗胚芽组合，加8ml蒸馏水用研钵和杵在室温将其碾碎。离心，将不溶物质除去。测定胚乳及胚芽样品上清组分中的比活。如图5所示，转基因胚乳提取物中的特异性植酸酶活性超过300。相反，转基因胚芽提取物的比活少于10。该内乎检测不到的活性可能是小片胚乳污染胚芽所致。
加热新鲜T2胚乳提取物可极大地促进Nov9X植酸酶富集如前面所公开的那样，玉米种子所产生植酸酶的示范性制剂之一是液体提取物的形式。这里描述了去胚、水提取、加热和离心对Nov9X植酸酶的富集。
如上所述，将谷粒人工去胚，将胚乳在水中用研钵和杵碾碎。新鲜胚乳的水提物于60℃加热30分钟，离心除去不溶物质。用SDS-PAGE(胶未列出)分析未加热和加热过的样品。在加热过的样品中发现了富集的约45kD的蛋白(箭头所指)，是Nov9X植酸酶的预期大小。该蛋白在对照提取物中未发现，在转基因提取物中是含量最多的蛋白。我们推断该蛋白就是Nov9X植酸酶。未加热和加热过的样品其总植酸酶活性相同(图6A)，说明玉米产生的植酸酶是耐热的。加热后样品的比活上升达2倍之多(图6B)。这些结果说明了一种从玉米种子制备Nov9X植酸酶液体制剂的可能策略。使用干燥胚乳或全颗粒，同样的方法应该也可产生重组酶高度富集的提取物。
用于家禽饲养试验的T2温室种子的生产和加工如前面所公开的那样，示范性植酸酶制剂之一是破碎或碾碎的谷粒或粉末。含植酸酶的粉末可作为补充剂直接加到动物饲料中，或可进一步加工，如加工成小丸的形式。
从七个不同T0转基因事件而来的T1种子在温室中长成玉米植物。所有植物均包含一个或多外拷贝由Taqman分析测定的Nov9X基因。这些T1植物或自花受精，或用来自于近交或JHAF031的花粉受精。授粉后约30天收割穗并于105干燥5天。就这6个转基因事件来说，对每一穗均收集不同穗的T2种子。将种子于室温在通风橱中用设成最细研磨的Kitchen Mill(K-TEC)碾碎。各批种子重约66g到398g．立即将粉末从研磨室转到通风橱中的密封塑料袋中。转到密封塑料袋后立即测量粉末的温度，温度不超过41℃。粉末于4℃储存。
如上所述，收集来源于6个不同T0转基因事件的T2玉米种子并碾碎。来自玉米近交A188的样品也进行加工，作为阴性对照。用上述测定干燥种子蛋白提取物的方法测定玉米粉末的植酸酶活性，植酸酶测定用微量反应板方式。蛋白提取物约100mg的粉末样品测量两次。
所选用于种子增加的六个转基因事件表2所示。它们来源于pNOV4057和pNOV4061质粒，分别编码质外体靶向和内质网停留形式的Nov9X植酸酶。自我受精和杂交植物的种子组分在事件池间变化很大。几乎所有的T1植物都不是Nov9X同源的。这些因素导致不可能用最终T2种子中基因拷贝数校正酶产率。每公斤粉末以单位测量的可提取植酸酶活性含量为325,000～1,300,000(表2)。
表2表明，碾碎T2温室种子粉末可提取植酸酶活性的产率。A188为非转基因近交。
表2
在室温碾碎玉米不会降低植酸酶活性。所收集305A-24A事件的种子在碾碎前分成两半。一批在室温碾碎。转移后这批碾出来的粉末其温度是38℃。另一批与粉末在4℃的凉室保持45分钟。然后在凉室中碾碎。密封好的粉末移到环境温度的通风橱中，将粉末转到塑料袋中。这批冷碾碎的粉末转移后立即测量的温度是24℃。如表2最下面2行所示，在低温碾碎种子不能改善可提取植酸酶活性的产率。于室温(RT)碾碎的事件305A-24A来源种子植酸酶产率是1,283,910单位/kg，相同池内在低温下碾碎的种子是1,306,934单位/kg。
表3显示了分离事件按载体收集时的总粉末和植酸酶产率。这些数据是表2事件特异性数据的总和。少于1kg粉末的质外体靶向和内质网停留形式的酶其可提取植酸酶活性均超过800,000总单位。这里所述粉末是用作饲料添加剂的Nov9X植酸酶可能制剂实例之一。表3提供了质外体靶向和内质网停留形式的碾碎T2温室种子植酸酶产率。
表3
实施例5玉米近交种子的植酸酶活性从含前导事件的数株制备粉末样品(1克)，用50mM Tris-盐酸(pH8.0)、100mM NaCl、2mM于室温搅拌提取1小时。提取液体积是100ml。离心使提取物澄清，用醋酸钠缓冲液(pH5.5)稀释。用Engelen等(2001)的方法，稍作修改，于pH5.5和37℃测量植酸酶活性。测定以1ml终反应体积在微量反应板上进行。结果如图7所示。
实施例6饲养试验来自于玉米种子的植酸酶制剂是玉米粉末或磨碎中间体。图8A、图8B、图8C总结了三项饲养试验的结果，其中小鸡饲料补充了玉米粉末配制的Nov9X植酸。含可提取植酸酶活性的转基因玉米种子样品用锤式或圆盘式粉碎机碾碎，然后直接加到饲料样品中，彻底混合。处理后的食物可直接以混合饲料使用(试验I)，或用蒸气处理制成小丸(试验II和III)。在所有情况下植酸酶玉米粉末均加到含有减量磷酸盐(阴性对照)的饲料配方。这可以实现比较低磷酸盐饮食(阴性对照)、高磷酸盐饮食(阳性对照)和补充了以碾碎玉米制剂形式的低磷酸盐饮食。
图8(A、B和C)中的结果饲料转化率(FCRs)绘制。FCR指消耗的饲料量除以小鸡纯体重增加值。比值越低说明小鸡每消耗单位饲料所获得的体重增加越多。比值越低表明小鸡更能利用所消耗的饲料。使用标准家禽饮食，并在饮食中加入两种含量的无机磷酸盐0.450％(阳性对照)和0.225(阴性对照和补充有酶的饮食)。0.45％是商用家禽饮食的常用水平。每围栏8只小鸡，每次饮食平行，一直长到21天龄，减去一天龄时的体重测得最终体重。记录每栏小鸡消耗的饲料量，测定平均饲料消耗量。
图8A显示了以混合饮食喂养小鸡的试验结果。在此试验中，将整个转基因玉米粒碾碎成粉末，以此配制Nov9X植酸酶。从含pNOV4057(外质体靶向植酸酶)或pNOV4061(内质网停留植酸酶)载体的植物中收割转基因谷粒。以玉米粉末形式将Nov9X植酸酶补充到低磷酸盐饮食，可以改善FCR并使性能恢复到与阳性对照相等或更好的水平。这些结果说明，玉米粉末形式的Nov9X植酸酶制剂改善了低磷酸盐饮食所喂养小鸡的FCR。
图8B显示了以小丸饲料喂养小鸡的试验结果。在此试验中，玉米粉末形式的Nov9X植酸酶制剂在蒸气处理和成丸前加到低磷磷酸盐小鸡饲料中。与图8A一样，检测了质外体靶向和内质网停留形式的Nov9X植酸酶。补充植酸酶可以使性能恢复到与阳性对照所观察到的结果相等或更好的水平。这些结果说明，在玉米种子直接合成、玉米粉末形式的Nov9X植酸酶制剂改善了低磷酸盐饮食所喂养小鸡的FCR。
图8B显示了一项试验结果，其中外质体形式的Nov9x植酸酶(由pNOV4057载体编码)制剂呈精细研磨物、中等研磨物或粗磨玉物末形式。粗磨材料由不小于2000微米的颗粒组成，中等研磨材料的大小主要是500～2000微米，而精细研磨粉末小于500微米。与图8B一样，在蒸气处理成丸前将三种制剂加到低磷酸食物中。这三种制剂的所有测试剂量均可改善饲料转化率。并且这三种制剂所有试验剂量均胜过阳性对照。这些结果证明了碎裂玉米种子的Nov9X植酸酶优选制剂对小鸡的效果。
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所有出版物、专利及专利申请均在此引入作为参考。尽管在前面所述的说明书中已描述了与本发明相关的某些优选实施方案并且为演示的目的而阐明了许多细节，但是本发明容许其他实施方案及此处所述的某些细节可以变化很大而不脱离本发明的基本原则，这些对于本领域内熟练技术人员来说是显而易见的。
序列表<110>Lanahan，MikeBetts，Scott<120>用于动物饲料的耐热植酸酶<130>70099<150>60/344,476<151>2001-12-28<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>412<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Nov9X植酸酶<400>1Met Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val1 5 10 15Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln20 25 30Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu35 40 45Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp50 55 60Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Lys Cys Gly Cys Pro65 70 75 80
Gln Ser Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg85 90 95Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile100 105 110Thr Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn115 120 125Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp130 135 140Ala Ile Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His145 150 155 160Tyr Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln165 170 175Ser Asn Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu180 185 190Thr Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Cys Val Ser195 200 205Leu Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu210 215 220Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr225 230 235 240Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe245 250 255
Asp Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro260 265 270Leu Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys275 280 285Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly290 295 300His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp305 310 315 320Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val325 330 335Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val340 345 350Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu355 360 365Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys370 375 380Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln385 390 395 400Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu405 410<210>2<211>1256
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>玉米优化的Nov9X植酸酶<400>2ggatccacca tggcgcagtc cgagccggag ctgaagctgg agtccgtggt gatcgtgtcc 60cgccacggcg tgcgcgcccc gaccaaggcc acccagctca tgcaggacgt gaccccggac120gcctggccga cctggccggt gaagctcggc gagctgaccc cgcgcggcgg cgagctgatc180gcctacctcg gccactactg gcgccagcgc ctcgtggccg acggcctcct cccgaagtgc240ggctgcccgc agtccggcca ggtggccatc atcgccgacg tggacgagcg cacccgcaag300accggcgagg ccttcgccgc cggcctcgcc ccggactgcg ccatcaccgt gcacacccag360gccgacacct cctccccgga cccgctcttc aacccgctca agaccggcgt gtgccagctc420gacaacgcca acgtgaccga cgccatcctg gagcgcgccg gcggctccat cgccgacttc480accggccact accagaccgc cttccgcgag ctggagcgcg tgctcaactt cccgcagtcc540aacctctgcc tcaagcgcga gaagcaggac gagtcctgct ccctcaccca ggccctcccg600tccgagctga aggtgtccgc cgactgcgtg tccctcaccg gcgccgtgtc cctcgcctcc660atgctcaccg aaatcttcct cctccagcag gcccagggca tgccggagcc gggctggggc720cgcatcaccg actcccacca gtggaacacc ctcctctccc tccacaacgc ccagttcgac780ctcctccagc gcaccccgga ggtggcccgc tcccgcgcca ccccgctcct cgacctcatc840aagaccgccc tcaccccgca cccgccgcag aagcaggcct acggcgtgac cctcccgacc900tccgtgctct tcatcgccgg ccacgacacc aacctcgcca acctcggcgg cgccctggag960ctgaactgga ccctcccggg ccagccggac aacaccccgc cgggcggcga gctggtgttc 1020gagcgctggc gccgcctctc cgacaactcc cagtggattc aggtgtccct cgtgttccag 1080accctccagc agatgcgcga caagaccccg ctctccctca acaccccgcc gggcgaggtg 1140
aagctcaccc tcgccggctg cgaggagcgc aacgcccagg gcatgtgctc cctcgccggc 1200ttcacccaga tcgtgaacga ggcccgcatc ccggcctgct ccctctaata gagctc 1256<210>3<211>19<212>PRT<213>玉米<400>3Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser1 5 10 15Ala Thr Ser<210>4<211>431<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>pNOV4054植酸酶融合体<400>4Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser1 5 10 15Ala Thr Ser Ala Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val20 25 30Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln35 40 45Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys
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225 230 235 240Ile Phe Leu Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly245 250 255Arg Ile Thr Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn260 265 270Ala Gln Phe Asp Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg275 280 285Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro290 295 300Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe305 310 315 320Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu325 330 335Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly340 345 350Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp355 360 365Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys370 375 380Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu385 390 395 400Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly
405 410 415Phe Thr Gln Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu420 425 430<210>5<211>1313<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pNOV4054植酸酶融合体<400>5ggatccacca tgagggtgtt gctcgttgcc ctcgctctcc tggctctcgc tgcgagcgcc 60accagcgctg cgcagtccga gccggagctg aagctggagt ccgtggtgat cgtgtcccgc 120cacggcgtgc gcgccccgac caaggccacc cagctcatgc aggacgtgac cccggacgcc 180tggccgacct ggccggtgaa gctcggcgag ctgaccccgc gcggcggcga gctgatcgcc 240tacctcggcc actactggcg ccagcgcctc gtggccgacg gcctcctccc gaagtgcggc 300tgcccgcagt ccggccaggt ggccatcatc gccgacgtgg acgagcgcac ccgcaagacc 360ggcgaggcct tcgccgccgg cctcgccccg gactgcgcca tcaccgtgca cacccaggcc 420gacacctcct ccccggaccc gctcttcaac ccgctcaaga ccggcgtgtg ccagctcgac 480aacgccaacg tgaccgacgc catcctggag cgcgccggcg gctccatcgc cgacttcacc 540ggccactacc agaccgcctt ccgcgagctg gagcgcgtgc tcaacttccc gcagtccaac 600ctctgcctca agcgcgagaa gcaggacgag tcctgctccc tcacccaggc cctcccgtcc 660gagctgaagg tgtccgccga ctgcgtgtcc ctcaccggcg ccgtgtccct cgcctccatg 720ctcaccgaaa tcttcctcct ccagcaggcc cagggcatgc cggagccggg ctggggccgc 780atcaccgact cccaccagtg gaacaccctc ctctccctcc acaacgccca gttcgacctc840
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<223>pNOV4058植酸酶融合体<400>6Met Arg Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ser1 5 10 15Ala Thr Ser Ala Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val20 25 30Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln35 40 45Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys50 55 60Leu Gly Glu Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly
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245 250 255Arg Ile Thr Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn260 265 270Ala Gln Phe Asp Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg275 280 285Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro290 295 300Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe305 310 315 320Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu325 330 335Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly340 345 350Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp355 360 365Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys370 375 380Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu385 390 395 400Ala Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly405 410 415Phe Thr Gln Ile Val Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu Ser
420 425 430Glu Lys Asp Glu Leu435<210>7<211>1331<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pNOV4058植酸酶融合体<400>7ggatccacca tgagggtgtt gctcgttgcc ctcgctctcc tggctctcgc tgcgagcgcc 60accagcgctg cgcagtccga gccggagctg aagctggagt ccgtggtgat cgtgtcccgc 120cacggcgtgc gcgccccgac caaggccacc cagctcatgc aggacgtgac cccggacgcc 180tggccgacct ggccggtgaa gctcggcgag ctgaccccgc gcggcggcga gctgatcgcc 240tacctcggcc actactggcg ccagcgcctc gtggccgacg gcctcctccc gaagtgcggc 300tgcccgcagt ccggccaggt ggccatcatc gccgacgtgg acgagcgcac ccgcaagacc 360ggcgaggcct tcgccgccgg cctcgccccg gactgcgcca tcaccgtgca cacccaggcc 420gacacctcct ccccggaccc gctcttcaac ccgctcaaga ccggcgtgtg ccagctcgac 480aacgccaacg tgaccgacgc catcctggag cgcgccggcg gctccatcgc cgacttcacc 540ggccactacc agaccgcctt ccgcgagctg gagcgcgtgc tcaacttccc gcagtccaac 600ctctgcctca agcgcgagaa gcaggacgag tcctgctccc tcacccaggc cctcccgtcc 660gagctgaagg tgtccgccga ctgcgtgtcc ctcaccggcg ccgtgtccct cgcctccatg 720ctcaccgaaa tcttcctcct ccagcaggcc cagggcatgc cggagccggg ctggggccgc 780atcaccgact cccaccagtg gaacaccctc ctctccctcc acaacgccca gttcgacctc 840
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1.制备耐热植酸酶的方法，包括在植物细胞中表达一种表达盒，该表达盒包含和编码耐热植酸酶的核酸分子可操纵性相连接的启动子，其中耐热植酸酶于60℃下30分钟后仍保留至少40％活性，在pH 4.5、37℃条件下比活超过200U/mg。
2.权利要求1的方法，其进一步包括分离所述耐热植酸酶。
3.权利要求1的方法，其中所述耐热植酸酶包括SEQ ID NO1序列。
4.权利要求1的方法，其中所述耐热植酸酶在pH 4.5和37℃条件下的比活超过400U/mg。
5.权利要求1的方法，其中所述耐热植酸酶在pH 4.5和37℃条件下的比活超过600U/mg。
6.权利要求1的方法，其中所述耐热植酸酶在pH 4.5和37℃条件下的比活超过800U/mg。
7.权利要求1的方法，其中所述启动子是泛素启动子。
8.权利要求1的方法，其中所述启动子是植物组织特异性启动子。
9.权利要求8的方法，其中所述启动子是胚乳特异性启动子。
10.权利要求9的方法，其中所述胚乳特异性启动子是玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子或玉米ADP-葡萄糖焦磷酸化酶启动子。
11.权利要求10的方法，其中所述启动子包括SEQ ID NO8或SEQ ID NO9序列。
12.权利要求1的方法，其中所述启动子是植物胚芽特异性启动子。
13.权利要求12的方法，其中所述启动子包括玉米球蛋白1启动子。
14.权利要求12的方法，其中所述启动子包括玉米油质蛋白KD18启动子。
15.权利要求4的方法，其中所述植物细胞为玉米、小麦或大豆细胞。
16.权利要求1的方法，其中所述核酸分子编码包括耐热植酸酶的融合多肽。
17.权利要求16的方法，其中所述融合多肽包括可操纵性与植酸酶连接的信号序列。
18.权利要求17的方法，其中所述信号序列将植酸酶靶向植物细胞中的造粉体、内质网、质外体或淀粉颗粒。
19.权利要求17的方法，其中所述信号序列是来自于蜡质基因的N末端信号序列或来自γ-玉米醇溶蛋白的N末端信号序列。
20.权利要求17的方法，其中所述信号序列是淀粉结合域。
21.权利要求20的方法，其中所述淀粉结合域是与耐热植酸酶C末端可操纵性连接的蜡质淀粉封装域。
22.权利要求17的方法，其中所述融合多肽包含与耐热植酸酶C末端可操纵性连接的SEKDEL。
23.权利要求1的方法，其中所述耐热植酸酶的半衰期在pH大于2、小于4时超过25分钟。
24.权利要求1的方法，其中所述耐热植酸酶是糖基化的。
25.制备动物饲料的方法，包括a)提供饲料组分和含权利要求1或2所述耐热植酸酶的植酸酶制品的混合物；b)在使混合物中肌醇六磷酸水解的温度和湿度条件下处理混合物以得到动物饲料。
26.权利要求25中的方法制备的动物饲料，其中所述动物饲料的肌醇六磷酸含量比用未处理组分所制成饲料中的肌醇六磷酸含量低。
27.制备动物饲料的方法，包括a)提供动物饲料组分和含权利要求1或2所述耐热植酸酶的植酸酶制品的混合物；b)在超过50℃的温度下加热混合物以得到热处理的动物饲料混合物。
28.权利要求27的方法，其中所述植酸酶制品是液体混合物。
29.权利要求27的方法，其中所述植酸酶制品是固体混合物。
30.权利要求27的方法，其中所述制品是转基因植物物质。
31.权利要求30的方法，其中所述转基因物质为转基因玉米颗粒、碾碎的玉米、玉米粉末或从玉米制备的酶提取物。
32.权利要求27的方法，其中所述植酸酶制品还包括至少一种维生素、矿物质、耐热植酸酶之外的一种酶、有机酸、原生物(细菌)或必需的油或辅产品。
33.权利要求27的方法，其中所述植酸酶制品的无机磷酸盐少于约1％。
34.权利要求27的方法，其中a)所述混合物的无机磷酸盐少于约0.45％。
35.权利要求27的方法所生成的热处理动物饲料混合物。
36.权利要求27的方法，还包括用成丸压榨机挤出热处理过的混合物以得到丸状动物饲料。
37.权利要求36的方法所生成的丸状动物饲料。
38.包含权利要求1或2中植酸酶的动物饲料组合物。
39.权利要求38的动物饲料组合物，其中所述植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于400U/mg。
40.权利要求38的动物饲料组合物，其中所述植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于600U/mg。
41.权利要求38的动物饲料组合物，其中所述植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于800U/mg。
42.权利要求38的动物饲料组合物，其中所述耐热植酸酶的半衰期在pH大于2、小于4时超过25分钟。
43.包含权利要求1或2中耐热植酸酶的酶饲料添加剂。
44.权利要求43的酶饲料添加剂，其中所述耐热植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于400U/mg。
45.权利要求43的酶饲料添加剂，其中所述耐热植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于600U/mg。
46.权利要求43的酶饲料添加剂，其中所述植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于800U/mg。
47.权利要求43的酶饲料添加剂，其中所述耐热植酸酶的半衰期在pH大于2.0、小于4.0时超过25分钟。
48.一种制备用于饲料制剂、含耐热植酸酶的组合物的方法，该方法包括a)将含有权利要求1或2的耐热植酸酶的液体溶液与大豆粉末合在一起，得到混合物；和b)将混合物冻干，得到冻干组合物。
49.权利要求48的方法，还包括将冻干组合物与其他饲料组分合在一起，以得到进一步的混合物。
50.权利要求48的方法，其中所述耐热植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于200U/mg。
51.权利要求48的方法，其中所述耐热植酸酶的半衰期在pH大于2.0、小于4.0时超过25分钟。
52.权利要求48所述方法制备的冻干组合物。
53.一种降低饲料转化率和增加体重的方法，该方法包括用一定量含权利要求1或2所述耐热植酸酶的饲料饲养动物以降低动物的饲料转化率。
54.一种改善饲料转化率降低或提高用无机磷酸盐含量低于0.45％的饲料所饲养动物的体重增加的方法，包括用无机磷酸盐含量低于0.45％、含权利要求1或2所述耐热植酸酶的饲料以有效改善饲料转化率或体重增加的用量饲养动物。
55.一种使动物对饮食性磷需求最低化的方法，该方法包括用含权利要求1或2所述耐热植酸酶的饲料以可提高饲料中磷在动物中生物利用度的用量饲养动物。
56.一种使动物对饮食性磷需求最低化的方法，该方法包括用含权利要求1或2所述耐热植酸酶的饲料饲养动物。
57.一种增强动物对饲料中所存在磷的利用的方法，该方法包括用含权利要求1或2所述耐热植酸酶的饲料以可提高饲料中磷在动物中生物利用度的用量饲养动物。
58.一种增强动物对饲料中有机磷来源的有机磷酸盐利用的方法，该方法包括用含权利要求1或2所述耐热植酸酶的饲料以可提高饲料中无机磷在动物中生物利用度的用量饲养动物。
59.一种降低动物排泄物中磷酸盐水平的方法，该方法包括用含权利要求1或2所述耐热植酸酶的饲料以可降低动物中排泄物中磷酸盐水平的用量饲养动物。
60.一种降低动物排泄物中磷酸盐水平的方法，该方法包括用无机磷含量低于0.45％、含权利要求1或2所述耐热植酸酶的饲料以可降低动物中排泄物中磷酸盐水平的用量饲养动物。
61.权利要求53至60任一项所述方法，其中饲料是家禽饲料。
62.权利要求53至60任一项所述方法，其中饲料是猪饲料。
63.权利要求53至60任一项所述方法，其中所述耐热植酸酶包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5序列。
64.权利要求53至60任一项所述方法，其中所述耐热植酸酶在动物消化道中的半衰期中约30分钟。
65.一种改善谷物加工的方法，包括在加工该谷物时加入权利要求1或2所述耐热植酸酶。
66.权利要求65的方法，其中所述谷物为玉米、小麦、大豆、卡诺拉或甘蔗。
67.一种改善加工谷物产品营养价值的方法或谷物加工方法，该方法包括加工过程中，以可有效提高饲料营养价值的用量在谷物产品中加入权利要求1或2所述耐热植酸酶。
68.权利要求67所述方法，其中谷物为玉米，谷物加工方法为湿碾法，加工后的产品为玉米麸质饲料、玉米麸质及玉米淀粉。
69.权利要求67所述方法，其中所述谷物为玉米、小麦、大豆、卡诺拉或甘蔗。
70.权利要求67所述方法，其中所述谷物为诸如大豆、卡诺拉或油菜的含油种子，加工的谷物产品是含油种子的粉。
71.一种改善动物饲料营养价值的方法，该方法包括在制备所述动物饲料的过程中，以可有效提高饲料营养价值的用量加入权利要求1或2所述耐热植酸酶。
72.一种改善人类食物营养价值的方法，该方法包括在制备所述人类食物的过程中，以可有效提高食物营养价值的用量加入权利要求1或2所述耐热植酸酶。
73.包含权利要求1或2所述耐热植酸酶的食物组合物。
74.一种制备人类食物的方法，该方法包括a)提供食物组分和权利要求1或2所述耐热植酸酶的混合物；和b)在使混合物中植酸水解的温度和湿度条件下处理混合物，以得到人类食物。
75.权利要求74所述方法制备的处理后人类食物，其中所述人类食物的植酸含量比相应未处理的人类食物中的含量要低。
76.包含权利要求1或2所述耐热植酸酶的食物添加剂。
77.权利要求76所述食物添加剂，其中所述耐热植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于400U/mg。
78.权利要求76所述食物添加剂，其中所述耐热植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于600U/mg。
79.权利要求76所述食物添加剂，其中所述耐热植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于800U/mg。
80.权利要求76所述食物添加剂，其中所述耐热植酸酶的半衰期在pH大于2.0、小于4.0时超过25分钟。
81.一种制备用于食物配制、含耐热植酸酶的组合物的方法，该方法包括a)将含权利要求1或2所述耐热植酸酶的液体溶液与粗粉合在一起，得到混合物；和b)将混合物冻干，得到冻干组合物。
82.权利要求81的方法，还包括将冻干组合物与其他食物组分合在一起，以得到进一步的混合物。
83.权利要求81的方法，其中所述耐热植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于800U/mg。
84.权利要求81的方法，其中所述耐热植酸酶的半衰期在pH大于2.0、小于4.0时超过25分钟。
85.用权利要求81所述方法制备的冻干组合物。
86.含权利要求1所述耐热植酸酶的饲料丸。
87.含权利要求2所述耐热植酸酶的饲料丸。
88.一种制备表达耐热植酸酶的转化植物的方法，该方法包括a)将包含启动子的表达盒导入植物细胞以得到转化的植物细胞，其中启动子与编码耐热植酸酶的核酸分子可操纵性连接，该酶在60℃时过30分钟后仍保留至少40％活性，并且在pH4.5及37℃时比活大于200U/mg；b)从转化的植物细胞获得转基因植物，该植物在其细胞内表达耐热植酸酶。
89.权利要求88的方法，其中所述植物细胞是双子叶植物细胞。
90.权利要求88的方法，其中所述植物细胞是单子叶植物细胞。
91.权利要求88的方法，其中所述植物细胞是谷类细胞。
92.权利要求88的方法，其中所述植物细胞是玉米细胞。
93.权利要求88的方法，其中所述植物细胞是大豆细胞。
94.权利要求88的方法，其中耐热植酸酶包括SEQ ID NO1序列。
95.权利要求88至94中任一项的方法，其中所述耐热植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于400U/mg。
96.权利要求88至94中任一项的方法，其中所述耐热植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于60U/mg。
97.权利要求88至94中任一项的方法，其中所述耐热植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于800U/mg。
98.包含表达盒的转化植物，其中该表达盒包含与编码耐热植酸酶的核酸分子可操纵性连接的启动子，该酶在60℃时过30分钟后仍保留至少40％活性，并且在pH4.5及37℃时比活大于200U/mg。
99.权利要求98的植物，其中耐热植酸酶包括SEQ ID NO1序列。
100.权利要求98的植物，其是双子叶植物。
101.权利要求100的植物，其是大豆植物。
102.权利要求98的植物，其是单子叶植物。
103.权利要求102的植物，其是玉米或小麦植物。
104权利要求98的植物，其中所述植物的种子中表达有耐热植酸酶。
105.权利要求98的植物，其中所述启动子为胚芽特异性启动子。
106.权利要求105的植物，其中所述胚芽特异性启动子为玉米球蛋白1启动子或玉米油质蛋白KD18启动子。
107.权利要求98的植物，其中所述启动子为胚乳特异性启动子。
108.权利要求107的植物，其中所述胚乳特异性启动子为玉米ADP-葡萄糖磷酸酶启动子或玉米γ-玉米醇溶蛋白启动子。
109.权利要求98的植物，其中所述核酸分子编码包含所述耐热植酸酶的融合多肽。
110.权利要求109的植物，其中所述融合多肽包含与所述耐热植酸酶可操纵性连接的γ-玉米醇溶蛋白N末端信号序列。
111.权利要求109的植物，其中所述融合多肽包含与耐热植酸酶C末端可操纵性连接的SEKDEL。
112.权利要求109的植物，其中所述融合多肽包含与耐热植酸酶可操纵性连接的N末端蜡质质外体靶向肽。
113.权利要求109的植物，其中所述融合多肽包含与耐热植酸酶C末端可操纵性连接的蜡质淀粉封装域。
114.权利要求98的植物，其中所述耐热植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于400U/mg。
115.权利要求98的植物，其中所述耐热植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于600U/mg。
116.权利要求98的植物，其中所述耐热植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于800U/mg。
117.权利要求98所述植物的产物，其包括耐热植酸酶。
118.权利要求117所述的产物，其为种子、谷粒或果实。
119.权利要求117所述的产物，其为植物。
120.权利要求119所述的产物，其中所述植物为杂交植物。
121.权利要求120所述的产物，其中所述植物为近交植物。
122.权利要求65的谷物加工产物，其包含权利要求1或2所述耐热植酸酶。
123.权利要求67的玉米粒加工产物，其包含权利要求1或2所述耐热植酸酶。
124.权利要求68的含油种子加工产物，其包含权利要求1或2所述耐热植酸酶。
125.权利要求1或2生成的转化植物。
126.权利要求125所述方法，其中转化植物为玉米、小麦或大豆。
127.权利要求48所述方法，其中所述耐热植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于400U/mg。
128.权利要求48所述方法，其中所述耐热植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于600U/mg。
129.权利要求48所述方法，其中所述耐热植酸酶在pH4.5及37℃时比活大于800U/mg。
全文摘要
本发明提供了被优化在植物中表达、编码耐热植酸酶的合成植酸酶多聚核苷酸，及分离的耐热植酸酶。还提供了包括植酸酶的饲料或食品，以及表达耐热植酸酶的转基因植物。进一步提供了制备和使用耐热植酸酶的方法，如在饲料和食品加工过程中使用耐热植酸酶的方法。
文档编号A23L1/211GK1622825SQ02828409
公开日2005年6月1日 申请日期2002年12月30日 优先权日2001年12月28日
发明者M·B·拉纳汉, S·贝茨 申请人:先正达公司