专利名称：一种抑制端粒酶活性的肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和分子生物学研究领域。发明涉及一种高效抑制端粒酶活性的蛋白肽段及其制备和应用。
背景技术：
端粒酶(Telomerase)是一种合成和延伸细胞染色体端粒的核糖核蛋白，它包含两种基本成分逆转录酶催化亚基hTERT和RNA组分hTR。端粒酶能以自身RNA为模板，反转录合成端粒重复列，加到染色体的末端，以弥补细胞分裂时端粒DNA的丢失，维持端粒的长度。研究表明在正常人体细胞内端粒酶活性几乎检测不到，因此，人正常体细胞分裂次数是有限的，细胞每分裂一次，端粒便丢失50-200bp，当端粒缩短到一定程度时细胞生长受到抑制，即称为细胞衰老，并走向死亡。然而，在绝大多数恶性肿瘤细胞(85%)中普遍可以检测到端粒酶活性且活性较强，端粒酶对端粒的重新合成补偿了它在细胞繁殖过程中的持续丢失，从而使得细胞可以不断的分裂，这是细胞永生化和癌变的一个重要机制。Kim等分析总结了大量研究结果，检测了 100多种恶性肿瘤标本，指出端粒酶诊断肿瘤的敏感性为85%，特异性为91%，阳性预测值为91%，阴性预测值为81%，充分表明端粒酶在肿瘤诊断中的价值(Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 1994 Dec 23 ；266 (5193) :2011-5.)。端粒酶的激活被认为是发生恶性肿瘤的主要因素之一，其激活及表达程度与肿瘤的发生和转移密切相关，抑制端粒酶并使端粒缩短被认为是抑制癌细胞的一种机制，因此端粒酶成为肿瘤靶向治疗的理想靶点。有许多公司正在开发端粒酶抑制剂治疗肿瘤，其中GRN163L已经开始了临床2期实验，几个端粒酶疫苗也即将完成临床试验进入市场。LPTS (Liver Putative Tumor Suppressor)是本发明人利用定位克隆的方法从人的正常肝cDNA文库中得到的一个肝相关的候选抑癌新基因[C.Liao，Μ. J. Zhao, H. Song，K.Uchida，K.K. Yokoyama，T.P.Li，Identification of the gene for a novel liver-related putative tumor suppressor at a high-frequency loss of heterozygosity region of chromosome 8p23 in human hepatocellular carcinoma. Hepatology 2000，32721-727]。LPTS基因定位于人第8号染色体区段，该区段在多种恶性肿瘤细胞中高频缺失。研究表明LPTS在肝癌组织及肝癌细胞系中表达量极低或检测不到，将LPTS基因导入肝癌细胞，能抑制肝癌细胞的生长、增殖、最后引起死亡 [Liao C，Zhao MJ ；Mutation analysis of novel human liver-related putative tumor suppressor gene in hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol，2003，9 89-93]]。LPTS基因于2004年已获得中国发明专利授权(赵慕钧等“一种肝癌相关基因及其应用”，专利号ZL 00115395. 1，专利权人中国科学院上海生物化学研究所；授权公告日2004年10月13日)。2001年Lu博士的实验室报导了 LPTS基因的另一个全长转录本PinXl，发现PinXl编码的蛋白可以结合端粒酶催化亚基hTERT并抑制端粒酶活性BhouΧ. Z. ,Lu K. P ； The Pin2/TRFl_interacting protein PinXl is a potent telomerase inhibitor. Cell，2001，107，347-359]，从机制上第一次证明了 LPTS/PinXl 作为一种天然的端粒酶抑制蛋白可抑制肿瘤细胞的增殖，为肿瘤的靶向治疗提供了新的途径。本发明人在2005年申请了一项有关制备LPTS蛋白的发明专利(赵慕钧等“端粒酶活性抑制蛋白的制备和纯化”，专利申请号=200510030526. 5，申请日:2005年10月14日；专利权人中国科学院上海生命科学研究院)。在该专利中提供了 LPTS蛋白(LPGENE1)和LPTS抑制端粒酶的活性片段LPTS133-328(LPGENE》的制备方法，并提供了 LPTS抑制端粒酶的活性片段位于其C端的133-3 氨基酸残基。本发明人在2008年申请的专利揭示了 TAT与LPTS133-328 的融合蛋白(专利申请号2008100413 . 4)，经证实该融合蛋白可穿透细胞膜的且具有极其优异的抑制肿瘤细胞生长的效果。鉴于LPTS蛋白是一种与肿瘤细胞生长密切相关的重要的蛋白，因此非常需要对其进行进一步地深入研究，以开发出更为有效的肿瘤抑制药物，满足临床应用所需。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效抑制端粒酶活性的蛋白肽段及其制备和应用。在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽(蛋白)，所述多肽是(a)包含SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的多肽；(b) SEQ ID NO 1氨基酸序列经过一个或多个(如1_10个；较佳地1_5个；更佳地 1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(C)与(a)限定的多肽序列有90% (较佳地95%，更佳地98%，最佳地99% )以上相同性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。在另一优选例中，所述的多肽不具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列(LPTS全长序列)，SEQ ID NO 2中第133-328位所示氨基酸序列(LPTSm8)和SEQ ID NO 2中第 2讨-3观位所示氨基酸序列。在另一优选例中，所述的多肽包含SEQ ID NO 2中第255 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第256 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 257 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第258 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第259 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 260 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第261 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第262 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 263 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第264 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第265 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 266 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第267 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第268 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 269 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第270 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第271 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 272 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第273 3 位所示氨基酸序列，或
包含SEQ ID NO 2中第274 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 275 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第276 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第277 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 278 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第279 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第280 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 281 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第282 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第283 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 284 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第285 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第286 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 287 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第288 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第289 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 290 3 位所示氨基酸序列。在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它含有一核苷酸序列，该核苷酸序列编码所述的多肽。在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体。在本发明的另一方面，提供一种所述的多肽的制备方法，该方法包括(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出所述的多肽。在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于制备抑制细胞内端粒酶活性的组合物。在另一优选例中，所述的组合物用于防治端粒酶异常激活相关疾病。在另一优选例中，所述的端粒酶异常激活相关疾病是肿瘤。在本发明的另一方面，提供一种复合物，所述的复合物包含所述的多肽，以及与该多肽相容的物质。在另一优选例中，所述的复合物是融合蛋白，所述的多肽与至少一条功能性蛋白相连接(较佳地通过肽键连接)，所述的功能性蛋白有5-500个(较佳地5-300个；更佳地 10-250个)氨基酸。在另一优选例中，所述的功能性蛋白选自穿膜蛋白(如反式激活蛋白TAT)，标签蛋白(如GST蛋白)，报告蛋白(如GFP蛋白)，人血清白蛋白(延长半衰期)，人IgGl =Fc 片段(延长半衰期)。在另一优选例中，所述的多肽与所述的功能性蛋白直接相连，或通过连接肽连接。 所述连接肽的长度为1-20个氨基酸，更佳为2-10个氨基酸。如所述连接肽的氨基酸序列为GGS。在另一优选例中，所述的融合蛋白不具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列(LPTS全长序列)，SEQ ID NO 2中第133-328位所示氨基酸序列(LPTS133_328)和SEQ ID NO 2中第 2讨-3观位所示氨基酸序列。在另一优选例中，所述的复合物包含选自以下的物质蛋白活性促进剂、蛋白活性稳定剂、延长蛋白半衰期的制剂(如PEG，PEG-脂质体)。
在本发明的另一方面，提供一种组合物，它含有安全有效量的所述的多肽或所述的复合物，以及药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的组合物用于抑制细胞内端粒酶活性。在另一优选例中，所述的组合物用于防治端粒酶活性增高肿瘤。在本发明的另一方面，提供一种制备组合物的方法，所述组合物抑制细胞内端粒酶活性，所述方法包括将安全有效量的所述的多肽或所述的复合物与药学上可接受的载体混合。在本发明的另一方面，提供一种药盒，所述药盒中含有所述的多肽；或含有所述的复合物；或含有所述的组合物。在另一优选例中，所述的药盒用于抑制细胞内端粒酶活性。在另一优选例中，所述的药盒用于防治端粒酶活性增高肿瘤。在本发明的另一方面，提供一种(优选体外，优选非治疗性地)抑制细胞内端粒酶活性的方法，包括给予受试者有效量的所述的多肽；或所述的复合物；或所述的组合物。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、SDS-PAGE显示GST_LPTS29(1_328融合蛋白的诱导表达及纯化。泳道1为IPTG诱导前的GST-LPTS29ch328基因工程菌表达的蛋白；泳道2为IPTG诱导后该工程菌表达的蛋白；泳道3-5为纯化后收集到的3管GST-LPTS29ch328蛋白。图2、GST-LPI^29Q_328，GST-LPTS133I8以及GST-LPTS抑制端粒酶活性的检测与比较。A、GST-LPTS29ch328，GST_LPTS133_328 以及 GST-LPTS 融合蛋白结构示意图；B,TRAP 法检测 GST-LPI^29ch328，GST-LPTS133I8 以及 GST-LPTS 蛋白抑制端粒酶的活性。蛋白的用量分别为5、10、25、50、100、200、250nM，如图所示。GST蛋白作为对照。检测样品经10% PAGE非变性胶电泳后银染结果。图3、LPTS290^328对肝癌BEL7404细胞生长的影响。A、Western Blot 检测 GFP、GFP-LPTS, GFP-LPTS29ch328 在其稳定转染细胞株 GFP/7404, GFP-LPTS/7404 和 GFP_LPTS29(1_328/7404 中的表达。兔源 anti_GFP 抗体作为杂交探针；B、MTT法绘制各稳定细胞株的生长曲线图；C、GFP/7404, GFP-LPTS/7404 和 GFP_LPTS29(1_328/7404 等细胞培养过程中细胞状态图。图中箭头所指为处于危机期、衰老症状的细胞，D、为脱壁死亡后的 GFP-LPI^29Q_328/7404 细胞。图4、Southern Blot实验检测LPTS和LPTS29ch328对肝癌BEL7404细胞端粒长度的影响。A、转染GFP或GFP-LPTS的BEL7404细胞经FACS分选后持续培养，选取不同的培养代数(PD)细胞如图所示，抽取其基因组DNAJSHinf I和Afa I内切酶消化后与单链端粒重复序列(TTAGGG) 6探针杂交； B、转染GFP或GFP-LPTS29ch328的BEL7404细胞经FACS流式细胞仪分选后倍增8代，抽取其基因组DNA，经Hinf I和Afa I内切酶消化后与单链端粒重复序列32p_ (TTAGGG) 6探针杂交。本图为放射自显影后的结果。
具体实施例方式本发明人经过深入的研究，首次分离到LPTS蛋白(全长序列如SEQ ID NO 2)的抑制端粒酶的活性区域，该活性区域位于LPTS蛋白的第290-3 位(LPTS29ch328)。该活性区域的活性超过全长LPTS蛋白及LPTS上的其它片段，并能更快地诱导肿瘤细胞死亡。本发明为肿瘤的靶向治疗提供了更为有效的抑制端粒酶活性的蛋白。术语如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“对象”、“个体”、或“患者”指需要进行诊断或治疗的任何目标，尤其是哺乳动物对象，特别是人，其它对象包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。特别受关注的是那些端粒酶异常激活的对象。如本文所用，“核酸”和“核酸序列”指聚合形式的任意长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。它包括(但不限于)单链、双链的DNA或RNA，基因组DNA和cDNA。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂或稀释剂。如本文所用，“有效量”或“安全有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别 (如非人灵长类等)、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构
成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上
由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。本发明的多肽及其编码基因LPTS是第一个被发现可以直接和人端粒酶催化亚基hTERT结合并抑制端粒酶催化活性的蛋白。本发明人以全长的LPTS蛋白为基础，预测并筛选了多种LPTS序列片段，经过反复研究比较，发现LPTS蛋白抑制端粒酶的活性区域可以缩小到该蛋白的第四0-3观位氨基酸序列区域内，该位置才是抑制端粒酶催化活性的最关键区域，其足以发挥抑制端粒酶催化活性的作用，从而获得了本发明的多肽。为了验证所述的多肽的功能，本发明人在体外通过基因工程技术表达了 GST-LPTS29ch328融合蛋白。在本发明的一个实施例中，采用测定端粒酶活性的 TRAP(telomeric repeat amplification protocol)实验技术,检测了 GST_LPI^29(I_328 融合蛋白在体外抑制肿瘤细胞端粒酶的活性。该方法是一种基于PCR技术的端粒酶活性检测方法，端粒酶来源于一种肝癌细胞裂解液。检测结果发现GST-LPTS29ch328有很强的抑制端粒酶
7的活性。为此，本发明人进一步比较了 GST-LPTS2H与GST-LPTS和GST-LPTS133,蛋白的活性。检测结果表明GST-LPTS和GST-LPTS133I8蛋白在50nM的时候显示有抑制端粒酶的活性，IOOnM的时候抑制活性较强，但不能完全抑制反应体系中的端粒酶；而LPTS29ch328在 50ηΜ的时候抑制活性已很强，在IOOnM的时候可完全抑制体系中的端粒酶活性。以上结果说明LPTS29ch328具有比全长LPTS和LPTS133_328更强的端粒酶抑制活性，是LPTS蛋白抑制端粒酶活性的功能域。为了检测LPTS29c^8在体内抑制肿瘤细胞的活性，在本发明的一个实施例中，构建了 LPTS29ch328、LPTS与绿色荧光蛋白GFP融合的真核表达质粒，GFP-LPTS29ch328和GFP-LPTS。 在肝癌BEL7404细胞中分别转染GFP-LPTS29ch328，GFP-LPTS以及对照GFP表达质粒，经2周的G418筛选之后，分别采用流式细胞仪FACS分选出有绿色荧光蛋白表达的细胞，然后进行传代培养。分选得到的GFP-LPTS29Q_328/7404，GFP-LPTS/7404, GFP/7404细胞，利用兔源 anti-GFP多克隆抗体进行western blot检测，发现都可以稳定表达相应的蛋白。在细胞传代培养的过程中，GFP-LPTS290_328/7404细胞的生长较GFP-LPTS/7404和GFP/7404的要慢。本发明人选取FACS分选后倍增5代的上述稳定细胞株，进行了 MTT试验，并绘制生长曲线。结果证明，与对照GFP/7404细胞相比较，GFP-LPTS29Q_328/7404细胞生长最慢，GFP-LPTS/7404 渐次。说明LPTS29c^8抑制肿瘤细胞的生长能力较其全长蛋白LPTS要强。在肿瘤细胞中过表达LPTS蛋白，可以导致细胞生长变慢、变扁平、进入危机期，最终死亡。但这是一个较长期的效应，一般需要培养6周后出现。细胞在转染LPTS29ch328后，很快发生死亡，经2周的G418筛选之后只能获得少量细胞进行FACS分选，分选获得的LPTS29(i_328/7404细胞继续培养10天左右，就相继出现衰老症状，并且很快就全部变圆后脱壁死亡。结果说明过表达 LPTS29c^8导致肿瘤细胞死亡的能力很强，可能比LPTS全长蛋白抑制肿瘤的效率要高，更有应用价值。为了证明LPTS29c^8抑制肿瘤细胞是靶向抑制细胞端粒的合成，在本发明的一个实施例中，采用 Southern Blot 方法检测了 GFP_LPTS29(1_328/7404，GFP-LPTS/7404，GFP/7404 细胞端粒的长度。实验结果表明，对照GFP/7404细胞传代过程中端粒保持稳定，长度在 4. 5kb左右；GFP-LPTS/7404细胞在传代过程中端粒逐渐缩段，在培养第5代时端粒缩短至 3. 8kb左右，第25代的时候端粒缩短到2. 8kb左右；GFP-LPTS29(1_328/7404细胞传代时间短， 培养过程中细胞死亡多，在第8代时端粒已经缩短至2. 5kb左右了。结果说明，LPTS29ch328有着非常强的端粒酶抑制活性，其在细胞体内能抑制端粒的合成和延伸，是一种靶向抑制端粒酶的肿瘤抑制肽。由于本发明揭示了抑制端粒酶催化活性的最关键区域，因此可以理解，一些蛋白 (比如一些包含有本发明的多肽的融合蛋白)，只要它们包含有该最关键区域、且不包含影响该关键区域结构或活性的因素(可通过有限次实验方便地验证)，也将具有抑制端粒酶催化活性的作用，这些蛋白也被包含在本发明中。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主， 本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括所述多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或 (iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。本发明还包括具有与所述多肽相同功能的、SEQ ID NO :1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-10个，较佳地1-5个，更佳地1-3个， 最佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为10个以内，较佳地为5个以内，更佳地为3个以内)氨基酸。例如，在本领域中， 用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和 /或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括所述多肽的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与所述多肽杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗所述多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含所述多肽或其片段的融合蛋白。发明还提供所述多肽或多肽的类似物。这些类似物与天然所述多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，“所述多肽保守性变异多肽”指与SEQ ID NO 1的氨基酸序列相比， 有至多10个，较佳地至多5个，更佳地至多3个，最佳地至多2个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。表 权利要求
1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽是(a)包含SEQID NO 1所示氨基酸序列的多肽；(b)SEQID NO :1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)限定的多肽序列有90%以上相同性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它含有一核苷酸序列，该核苷酸序列编码权利要求1所述的多肽。
3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的载体。
5.一种权利要求1的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包括(a)在适合表达的条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出权利要求1的多肽。
6.权利要求1所述的多肽的用途，用于制备抑制细胞内端粒酶活性的组合物。
7.如权利要求6所述的多肽的用途，所述的组合物用于防治端粒酶异常激活相关疾病。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的端粒酶异常激活相关疾病是肿瘤。
9.一种复合物，所述的复合物包含权利要求1所述的多肽，以及与该多肽相容的物质。
10.如权利要求9所述的复合物，其特征在于，所述的复合物是融合蛋白，权利要求1所述的多肽与至少一条功能性蛋白相连接，所述的功能性蛋白有5-500个氨基酸。
11.如权利要求9所述的复合物，其特征在于，所述的复合物包含选自以下的物质蛋白活性促进剂、蛋白活性稳定剂、延长蛋白半衰期的制剂。
12.—种组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽或权利要求 9所述的复合物，以及药学上可接受的载体。
13.一种制备组合物的方法，所述组合物抑制细胞内端粒酶活性，所述方法包括将安全有效量的权利要求1所述的多肽或权利要求9所述的复合物与药学上可接受的载体混合O
14.一种药盒，其特征在于，所述药盒中含有权利要求1所述的多肽；或含有权利要求9 所述的复合物；或含有权利要求12所述的组合物。
全文摘要
本发明涉及一种抑制端粒酶活性的肽及其制备方法和应用。本发明的肽具有显著抑制肿瘤细胞的端粒酶活性的功能。在肿瘤细胞内表达本发明的肽可以抑制肿瘤细胞的生长，并导致细胞死亡。本发明的肽能够专一性抑制端粒酶，在肿瘤的靶向治疗中具有重要的应用前景。
文档编号C12N1/15GK102311493SQ20111018460
公开日2012年1月11日 申请日期2011年7月1日 优先权日2010年7月2日
发明者冯剑, 李载平, 答亮, 赵慕钧, 赵静, 陈光明, 陈国元 申请人:中国科学院上海生命科学研究院