专利名称：一种膨润土固定化脂肪酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种膨润土固定化脂肪酶的制备方法。
背景技术：
脂肪酶(EC 3. 1. 3. 3)可以用于多种水不溶性酯类的水解、酯化和转酯化等不同的催化反应，是一类具有多种催化功能的酶，被广泛应用于医药、食品、日化和油脂加工等重要的工业领域。由于游离脂肪酶不能重复利用、不稳定、与产物不易分离以及在有机相中容易“团聚”而失活的缺点，很难实现连续化生产，制约了其在工业上的应用。而利用物理或化学的方法将脂肪酶固定在水不溶性载体上，制备成稳定性强、可以重复利用的固定化脂肪酶，可以克服游离脂肪酶的以上缺点，同时又保持了脂肪酶的催化特性。因此，固定化脂肪酶极大的提升了脂肪酶在工业上的应用价值，拓宽了其应用范围。游离酶经固定化后，其载体表面的微环境对提高固定化酶的催化活力和稳定性有重要的影响。目前，常用的脂肪酶固定化载体主要有壳聚糖、海藻酸钠等天然有机高分子材料，聚丙烯酸、离子交换树脂等有机合成高分子材料，以及多孔玻璃、硅胶等无机材料。这些材料大多具有生物相容性较好、传质性能佳等特点，但也存在着一定的局限性。如以壳聚糖为载体的固定化酶其机械强度有待提高，载体比较容易崩解而造成酶的泄露；而有机聚合物分子对酶蛋白的“毒害”作用也是不容忽视的，容易造成脂肪酶催化活力的下降；硅胶等无机材料由于其疏水性很差，既不利于脂肪酶在载体上的正确折叠，也不利于水不溶性酯类在载体上的传质和催化，从而使催化速率和产率出现下降；另外，随着化工原料和产品价格的不断攀升，载体较高的购置成本也不利于脂肪酶催化在工业上的应用。因此，要找到一种理想固定化载体是很不容易的，同时对于制备高催化性能的固定化脂肪酶来讲又是至关重要的。膨润土在我国储量丰富，其价格低廉、化学惰性、结构-功能可调、热稳定性和环境相容性好。而载体表面丰富的反应基团又为其载体修饰创造了良好的条件，我们可以通过选择不同的修饰剂及其比例，实现对膨润土结构和功能的调节。目前，已有利用膨润土固定化α -淀粉酶、碱性磷酸酶等的报道，但固定化后其催化活力都出现了不同程度的下降。 而在膨润土固定化脂肪酶过程中，引入有机表面活性剂的修饰，将载体修饰与脂肪酶负载相耦合的固定化方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种膨润土固定化脂肪酶的制备方法，本发明制得的固定化脂肪酶不仅稳定性好、重复性能佳，同时又具有比游离脂肪酶更好的催化活性。为了达成上述目的，本发明的解决方案是
一种膨润土固定化脂肪酶的制备方法，包括以下步骤将一定量的钙基膨润土 (浙江临安城北膨润土有限公司)浸渍于NaCl溶液中，将处理后的膨润土溶于ρΗ 3 9的缓冲溶液中，并加入一定量的有机表面活性剂对膨润土载体进行改性；然后加入一定量的脂肪酶粉末进行固定化反应，使载体表面改性和固定化反应在同一反应体系中连续进行；离心弃去上清液，得到的载体，置于真空干燥箱内干燥，研磨成粉后即得。所述的NaCl溶液浓度为0. 1 mol/L,钙基膨润土与NaCl溶液的质量体积比为 1 5 1 20(w/v)，并搅拌0 5 h，静置36 h后，固体沉淀用蒸馏水洗涤3 6次，直至经检验无Cl—为止。所述的处理后的膨润土与缓冲溶液的质量体积比为1 2 1 10。所述的缓冲溶液采用磷酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液中的一种。所述的有机表面活性剂采用十六烷基三甲基溴化铵，十六烷基三甲基氯化铵， 十八烷基三甲基溴化铵，十八烷基三甲基氯化铵中的一种；(以上有机表面活性剂购自Alfa Aesar公司)加入量为阳离子交换容量的20% 200%，并在40 80°C下恒温搅拌反应0 15 h0所述的脂肪酶粉末加入后的质量浓度为1 20mg/ml。(脂肪酶粉购自 Sigma-Aldrich 公司)。所述的脂肪酶溶液加入前调节温度至0 50°C，加入后要搅拌反应2_4h。所述的固定化反应时间为1 10 h，转速为0 500 rpm。所述的真空干燥温度为10 50°C，真空度为彡0. 1 MPa0本发明的有益效果为本发明利用氯化钠溶液对原土进行预处理后负载游离脂肪酶，在pH3 9的缓冲溶液中，通过加入不同的有机阳离子表面活性剂(如十六烷基三甲基溴化铵等)对载体的表面结构和疏水性能进行调节。反应一段时间后，反应液未经任何处理再加入一定量的游离脂肪酶，使载体修饰和酶蛋白负载连续化进行。最后弃去未固定的酶蛋白，经真空干燥、研磨后得到固定化脂肪酶。本发明创造性的将载体修饰和脂肪酶固定化相耦合，在同一反应器中连续进行，大大节省了后处理步骤和时间。将本发明制得的固定化脂肪酶用于有机相-水相的两相催化水解反应后，实验结果表明其催化活力相比游离酶均有不同程度的提高，且最高值达到130%以上；热稳定性和PH稳定性也有较大的提高；固定化脂肪酶经多次反复利用后，酶催化活力依旧保持较高水平，操作稳定性有了很大的提高。相比传统的固定化方法，利用本发明制备的固定化酶有如下优点
1)脂肪酶催化活力高。膨润土特有的层状结构和较大的比表面积使脂肪酶分子在载体上得到很好的发散，避免了酶分子在载体的团聚而使底物分子无法充分接触。膨润土具有结构与功能可调的特性，经有机表面活性剂修饰后形成的疏水性表面有利于脂肪酶蛋白活性中心构象的正确折叠，而且有机改性膨润土表面丰富的活性基团通过疏水作用力、氢键以及范德华力等作用力与酶蛋白分子充分固定，显著增强酶活性中心的刚性，减少了反应过程中酶蛋白构象的变化。疏水性载体表面也有利于疏水性酯类底物与酶活性中心的充分接触和富集，减少了反应过程中的传质阻力，从而使酶催化活力得到显著增强。2)固定化脂肪酶的稳定性高。由于膨润土特有的刚性层状结构使得固定化载体在重复利用过程中被溶解的可能性大大降低，避免了载体的破坏而造成酶的泄露，提高了固定化脂肪酶的重复使用性能。拥有较强刚性的酶蛋白结构使固定化酶在反应过程中抵御酸、碱和热的能力增强，有利于稳定酶的活性中心构象，从而使固定化脂肪酶的稳定性得到提尚。3)固定化效率高。利用膨润土强大的吸附能力，以及修饰后形成的载体表面与脂肪酶之间的疏水作用力，使得大部分的游离脂肪酶能牢固的吸附在载体表面。相比未经修饰的膨润土，其固定化效率得到提高。4)所用载体膨润土在我国储藏丰富，廉价易得，有利于降低固定化脂肪酶的生产成本。5)将载体修饰与脂肪酶负载相耦合的固定化方法简单，条件温和，不需要特殊的设备，后处理工艺简单，适合于工业上大规模生产。
图1为本发明制得的固定化脂肪酶与未修饰膨润土土固定化脂肪酶催化活力的对比图2为本发明制得的固定化脂肪酶与未修饰膨润土土固定化脂肪酶的稳定性对比图。
具体实施例方式下面结合具体详细实例对本发明所采用的固定化方法及其带来的技术效果作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此
实施例1
十六烷基三甲基溴化铵修饰膨润土固定化脂肪酶的制备及酶活测定 1)称取5g钙基膨润土加入到50 mL浓度为0. 1 mol/L的NaCl溶液中，先搅拌2 h，然后静置36 h，期间更换三次新鲜的NaCl溶液。离心倾去上清液，得到的膨润土用200mL蒸馏水洗涤，抽滤得到载体。2)取25g步骤1)得到的载体加入到100 mL pH 6的磷酸盐缓冲液中，加入一定量的十六烷基三甲基溴化铵(加入量相当于阳离子交换容量的100%，阳离子交换容量为8. 25 mmol/100g湿膨润土)，60°C下恒温振荡反应12h，对膨润土载体进行改性。然后将温度调至 25°C，直接加入脂肪酶粉末使其质量浓度为5 mg/mL，使载体表面改性和固定化反应在同一反应体系中连续进行。200rpm下振荡反应4 h后，溶液在15000 rpm下离心15 min，得到固体沉淀。该沉淀用100 mL蒸馏水洗涤5次，30°C、0.08 MI^a条件下真空干燥3天，研磨成粉得到固定化脂肪酶。3)固定化脂肪酶酶活测定
将一定体积的橄榄油与4%的聚乙烯醇溶液混合(体积比为1 3)，用磁力搅拌机混合搅拌两次，每次3 min，中间间隔5 min，制成橄榄油乳化液。将该橄榄油乳化液与磷酸盐缓冲液(pH 7. 0,20 mM)混合，取10 mL该混合液在30°C水浴中保温10 min，加入步骤2)制得的固定化脂肪酶0.15 g，180 rpm下恒温振动反应20 min后，加入15 mL 95%的乙醇溶液终止反应。将该反应液用0.02 mol/L的NaOH溶液滴定，空白溶液为10 mL未加入脂肪酶的底物溶液，同样条件下反应20 min，同样加入15 mL 95%的乙醇溶液。根据两者消耗碱液的量的差值计算脂肪酶的催化活力。脂肪酶催化活力定义为30°C，pH7.0条件下，每 min产生1 μ mol脂肪酶所需要的酶量为1个酶活力单位，记为U/g。实验结果如下表1所示，表1为十六烷基三甲基溴化铵修饰膨润土固定化脂肪酶与游离脂肪酶的催化活力比较表。从下表1可以看出，该固定化脂肪酶的催化活力相比同样量的游离酶提高了 35%以上。
实施例2
十六烷基三甲基氯化铵修饰膨润土固定化脂肪酶的制备及酶活测定 1)称取5g钙基膨润土加入到25 mL浓度为0. 1 mol/L的NaCl溶液中，先搅拌2 h，然后静置36 h，期间更换三次新鲜的NaCl溶液。离心倾去上清液，得到的膨润土用200mL蒸馏水洗涤，抽滤得到载体。2)取30 g步骤1)得到的载体加入到200 mL pH 7的磷酸盐缓冲液中，加入一定量的十六烷基三甲基氯化铵(加入量相当于阳离子交换容量的50%)，在80°C下恒温振荡反应15 h，对膨润土载体进行改性。然后将温度调至25°C，直接加入脂肪酶粉末使其质量浓度为10 mg/mL，使载体表面改性和固定化反应在同一反应体系中连续进行。200rpm下振荡反应3 h后，15000 rpm下离心15 min，得到固体沉淀。该沉淀用100 mL蒸馏水洗涤5次， 30°C、0. 08 MPa条件下真空干燥3天，研磨成粉得到固定化脂肪酶。3)固定化酶酶活测定
酶活测定方法与实施例1中步骤3)相同。实验结果如下表2所示，表2为十六烷基三甲基氯化铵修饰膨润土固定化脂肪酶与游离脂肪酶的催化活力比较表。从下表2可以看出，该固定化脂肪酶的催化活力相比同样量的游离酶提高了 10%以上。实施例3
十八烷基三甲基溴化铵修饰膨润土固定化脂肪酶的制备及酶活测定 1)称取5g钙基膨润土加入到75 mL浓度为0. 1 mol/L的NaCl溶液中，先搅拌2 h，然后静置36 h，期间更换三次新鲜的NaCl溶液。离心倾去上清液，得到的膨润土用200mL蒸馏水洗涤，抽滤得到载体。2)取20 g步骤1)得到的载体加入到100 mL pH 6的磷酸盐缓冲液中，加入一定量的十八烷基三甲基溴化铵(加入量相当于阳离子交换容量的80%)，在60°C下恒温振荡反应14 h，对膨润土载体进行改性。然后将温度调至25°C，直接加入脂肪酶粉末使其质量浓度为15 mg/mL，使载体表面改性和固定化反应在同一反应体系中连续进行。200rpm下振荡反应4 h后，溶液在15000 rpm下离心15 min，得到固体沉淀。该沉淀用100 mL蒸馏水洗涤5次，30°C、0. 08 MPa条件下真空干燥3天，研磨成粉得到固定化脂肪酶。3)固定化脂肪酶酶活测定
酶活测定方法与实施例1中步骤3)相同。实验结果如下表3所示，表3为十八烷基三甲基溴化铵修饰膨润土固定化脂肪酶与游离脂肪酶的催化活力比较表。从下表3可以看出，该固定化脂肪酶的催化活力相比同样量的游离酶提高了 20%以上。实施例4
十八烷基三甲基氯化铵修饰膨润土固定化脂肪酶的制备及酶活测定 1) 1)称取5g钙基膨润土加入到250 mL浓度为0. 1 mol/L的NaCl溶液中，先搅拌2 h，然后静置36 h，期间更换三次新鲜的NaCl溶液。离心倾去上清液，得到的膨润土用200mL 蒸馏水洗涤，抽滤得到载体。2)取25 g步骤1)得到的载体加入到200 mL pH 4的醋酸盐缓冲液中，加入一定量的十八烷基三甲基氯化铵(加入量相当于阳离子交换容量的150%)，在80°C下恒温振荡反应15 h，对膨润土载体进行改性。然后将温度调至25°C，直接加入脂肪酶粉末使其质量浓度为8 mg/mL，使载体表面改性和固定化反应在同一反应体系中连续进行。200rpm下振荡反应2 h后，15000 rpm下离心15 min，得到固体沉淀。该沉淀用200 mL蒸馏水洗涤5 次，30°C、0. 08 MPa条件下真空干燥3天，研磨成粉得到固定化脂肪酶。3)固定化脂肪酶酶活测定
酶活测定方法与实施例1中步骤3)相同。实验结果如下表4所示，表4为十八烷基三甲基溴化铵修饰膨润土固定化脂肪酶与游离脂肪酶的催化活力比较表。可以看出，该固定化脂肪酶的催化活力相比同样量的游离酶提高了 25%以上。上述实施例中所使用的脂肪酶溶液，也可以替换成胞外产脂肪酶、细胞破壁发酵液中的一种，可以达到同样的效果。下面通过对比实施例来说明本发明较未修饰膨润土固定化脂肪酶的优势对比实施例1
本发明实施例1制得的固定化脂肪酶与未修饰膨润土固定化脂肪酶催化活力的比较 1)本发明制得的固定化脂肪酶按照实施例1的方法制得。原土固定化脂肪酶的制备方法也按照实施例1的方法进行，但方法中未加入十六烷基三甲基溴化铵以及未进行修饰反应步骤。2)按照实施例1中步骤3)中的方法进行酶活测定。本发明制得的固定化脂肪酶与原土固定化脂肪酶催化活力的比较结果如图1所示。可见经有机表面活性剂修饰后的膨润土固定化脂肪酶的催化活力明显高于未修饰膨润土固定化脂肪酶，该结果进一步证明了在载体上引入疏水界面有利于脂肪酶蛋白活性中心结构的正确折叠，有利于疏水性底物与酶活性中心的充分接触，避免了脂肪酶经固定化后出现酶活下降的情况。
对比实施例2
本发明实施例1制得的固定化脂肪酶与未修饰膨润土土固定化脂肪酶的稳定性比较 1)按照比较实施例1中的方法分别制得有机修饰膨润土固定化脂肪酶和未修饰膨润土土固定化脂肪。3)将步骤1)制得的两种固定化脂肪酶按照实施例1步骤3)的方法进行批次反应。前一批反应结束后，将固定化脂肪酶投入到新鲜的底物溶液中进行下一批反应。每批反应结束后，按照实施例1步骤3)的方法进行参与酶活的测定。实验结果如图2所示。可见本发明制得的固定化脂肪酶的催化稳定性要明显高于未修饰膨润土固定化脂肪酶，该结果进一步证明了固定化载体的疏水作用力有利于稳定脂肪酶活性中心的构象，从而使其稳定性得到提高。以上实施例公开了利用十六烷基三甲基溴化铵等有机表面活性剂修饰与脂肪酶负载相耦合的固定化方法。该载体修饰方法同样也适合于其他有机表面活性剂，如十二烷
基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基溴化铵以及三甲基氯硅烷等，在此不再一一累述。
权利要求
1.一种膨润土固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤将一定量的钙基膨润土浸渍于NaCl溶液中，将处理后的膨润土溶于PH 3 9的缓冲溶液中，并加入一定量的有机表面活性剂对膨润土载体进行改性；然后直接加入一定量的脂肪酶粉末进行固定化反应，使载体表面改性和固定化反应在同一反应体系中连续进行；离心弃去上清液，得到的载体，置于真空干燥箱内干燥，研磨成粉后即得。
2.如权利要求1所述的一种膨润土固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于所述的 NaCl溶液浓度为0. 1 mol/L，且钙基膨润土与NaCl溶液的质量体积比为1 5 1 20， 并搅拌0 5 h，静置36 h后，固体沉淀用蒸馏水洗涤3 6次。
3.如权利要求1所述的一种膨润土固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于所述的处理后的膨润土与缓冲溶液的质量体积比为1 2 1 10。
4.如权利要求3所述的一种膨润土固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于所述的缓冲溶液采用磷酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液中的一种。
5.如权利要求1所述的一种膨润土固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于所述的有机表面活性剂采用十六烷基三甲基溴化铵，十六烷基三甲基氯化铵，十八烷基三甲基溴化铵，十八烷基三甲基氯化铵中的一种；加入量为阳离子交换容量的20% 200%，并在40 80°C下恒温搅拌反应0 15 h。
6.如权利要求1所述的一种膨润土固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于所述的脂肪酶粉末加入后的质量浓度为1 20mg/ml。
7.如权利要求6所述的一种膨润土固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于所述的脂肪酶溶液加入前调节温度至0 50°C，加入后要搅拌反应2-4h。
8.如权利要求1所述的一种膨润土固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于所述的固定化反应时间为1 10 h，转速为0 500 rpm。
9.如权利要求1所述的一种膨润土固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于所述的真空干燥温度为10 50°C，真空度为彡0. 1 MPa0
全文摘要
本发明公开了一种膨润土固定化脂肪酶的制备方法，包括以下步骤将一定量的钙基膨润土浸渍于NaCl溶液中，将处理后的膨润土溶于pH3～9的缓冲溶液中，并加入一定量的有机表面活性剂对膨润土载体进行改性；然后直接加入一定量的脂肪酶粉末进行固定化反应，使载体表面改性和固定化反应在同一反应体系中连续进行；离心弃去上清液，得到的载体，置于真空干燥箱内干燥，研磨成粉后即得。本发明制得的固定化脂肪酶不仅稳定性好、重复性能佳，同时又具有比游离脂肪酶更好的催化活性。
文档编号C12N11/14GK102250871SQ20111018451
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月4日 优先权日2011年7月4日
发明者李建法, 李益民, 王巧映, 胡六江, 董华平, 金红娣, 骆栋平 申请人:绍兴文理学院