专利名称：一种口蹄疫基因工程多肽疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属遗传工程领域，具体涉及一种以易感动物自体免疫球蛋白IgG重链恒定区或β-半乳糖苷酶为载体蛋白的口蹄疫基因工程多肽疫苗及其制备方法。
与口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)免疫原性密切相关的是其外壳蛋白VP1基因，该蛋白中含有口蹄疫病毒主要抗原表位。目前较为成熟的口蹄疫毒基因工程疫苗为重组多肽疫苗，即将口蹄疫病毒主要抗原表位与一大分子载体蛋白相连，构成一融合蛋白，进而有效地诱发动物产生免疫应答。
发明内容
本发明的目的是提出以自体IgG或β-半乳糖苷酶作为载体、制备安全可靠的口蹄疫多肽疫苗及其制备方法。
本发明提出的口蹄疫多肽疫苗，是以家畜自体免疫球蛋白IgG重链恒定区或β-半乳糖苷酶为载体蛋白，口蹄疫病毒抗原多肽连接在载体蛋白的适当位置(如N端、C端或在中间位置)，构成融合蛋白。其中口蹄疫病毒抗原多肽采用口蹄疫病毒VP1蛋白中具有抗原性的氨基酸肽段，并将其组成多拷贝的串联结构，在肽段连接处加入氨基酸多肽作为接头。
为了保证融合蛋白能够更好地被动物机体免疫系统识别和递呈，作为该融合蛋白的载体蛋白可以是家畜自体IgG重链恒定区或者β-半乳糖苷酶的部分区段或全长序列，并且可以是家畜IgG重链恒定区全长氨基酸序列的同源序列、IgG重链恒定区第30位至328位共299个氨基酸肽段的同源序列、或者是β-半乳糖苷酶从第1位至第583位共583个氨基酸肽段的同源序列。家畜自体IgG重链恒定区全长329个氨基酸，不同偶蹄类动物来源的IgG重链恒定区核苷酸同源性大于85％，氨基酸同源性大于90％；而β-半乳糖苷酶全长1024个氨基酸，不同大肠杆菌的β-半乳糖苷酶核苷酸同源性大于90％，氨基酸同源性大于95％。为了保证插入的抗原多肽的免疫原性，可选取不同的抗原插入位点，将具有串联结构的口蹄疫病毒抗原多肽插入其中。而抗原多肽可以连接在载体蛋白的适当位置，如N端、C端或者在中间位置插入。
本发明中，抗原多肽采用口蹄疫病毒VP1蛋白中具有抗原性的氨基酸肽段，同时采用多拷贝串联结构。对于具有抗原性的氨基酸肽段，如O型口蹄疫病毒VP1蛋白21ヘ40、141ヘ160、200ヘ213位氨基酸肽段，并且可以前后浮动适当个数的氨基酸残基，如可以采用35ヘ53、134ヘ1 58、141ヘ158、135ヘ144、188ヘ209位等氨基酸肽段；口蹄疫病毒抗原表位中的氨基酸序列部分具有保守性，如141ヘ160AA中的RGD位点，而非保守部分以流行毒株基因序列为依据；通常如21ヘ40AA中有1-4个氨基酸可被置换，141ヘ160AA中有1-5个氨基酸可被置换，200ヘ213AA中有1-2个氨基酸可被置换，其原则是这些氨基酸肽段均具有抗原性。而对于抗原多肽的串联结构，如141ヘ160AA-21ヘ40AA(或200ヘ213AA)-141ヘ160AA的三拷贝串联结构，也可以采用其他多拷贝(如二拷贝、四拷贝等)的串联结构；串联结构中，具有抗原性的某一氨基酸肽段可以重复使用，所处的位置可以各异。具有抗原性的氨基酸肽段连接形成串联结构时，在肽段连接处加入适当氨基酸多肽作为接头，接头中的氨基酸种类和数目可以根据需要进行改变，其原则是与IgG重链恒定区形成融合蛋白后能表现足够的抗原性。
实施例中将口蹄疫病毒抗原多肽连接在载体蛋白的C端，构成融合蛋白，其结构示意如下 为了使抗原多肽表达成融合蛋白后能够更好地体现抗原性，我们适当选取了IgG重链恒定区和β-半乳糖苷酶中的某一区段作为载体蛋白，如后述实施例中分别采用猪IgG重链恒定区第30位至328位共299个氨基酸肽段和大肠杆菌β-半乳糖苷酶从第1位至第583位共583个氨基酸肽段作为载体蛋白；FMDV抗原多肽则采用O型口蹄疫病毒VP1蛋白中3个主要抗原表位，即21ヘ40、141ヘ160、200ヘ213三个氨基酸肽段，并将其组成141ヘ160AA-21ヘ40AA(或200ヘ213AA)-141ヘ160AA的串联结构，在肽段连接处加入适当氨基酸多肽作为接头，如后述实施例中采用141ヘ160AA(“Y”)-Pro-Gly(“M”)-21ヘ40AA(“X”)-Gln-Phe-Glu-Leu-Glu-Phe-Met-Val-Pro-Ser-Arg(“N”)-141ヘ160AA(“Y”)的抗原多肽结构，前后两个接头分别是2个和11个氨基酸。
本发明在实施例中，采用具有串联结构的FMDV抗原基因序列是SEQ ID NO.1，其编码的抗原多肽氨基酸序列为SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3，其编码的抗原多肽氨基酸序列为SEQ ID NO.4；SEQ ID NO.5，其编码的抗原多肽氨基酸序列为SEQID NO.6。其结构特征如下抗原基因的两端各有一个拷贝的编码141ヘ160位氨基酸的DNA序列，中间是一个拷贝的编码21ヘ40位或者200ヘ213位氨基酸的DNA序列；连接这些序列的两个接头分别是2个和11个氨基酸。
在基因水平上将SEQ ID NO.1连接在IgG重链恒定区的C末端，形成融合基因，表达获得融合蛋白。该融合蛋白具有下列特点(1)在基因水平上，载体蛋白基因大小约为900bp，抗原肽基因大小约为240bp，整个融合基因大小约为1.2kb。(2)在蛋白水平上，载体蛋白只包含猪IgG重链恒定区第30位到第328位氨基酸肽段，即299个氨基酸；抗原多肽为上述的串联肽段，其中21ヘ40位氨基酸肽段是一T细胞表位，141ヘ160位氨基酸肽段一B细胞表位。整个融合蛋白分子量约为50kDa。
在基因水平上将SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5连接在β-半乳糖苷酶的C末端，形成融合基因，表达获得融合蛋白。该融合蛋白具有下列特点(1)在基因水平上，载体蛋白基因大小约为1.8kb，抗原肽基因大小约为200-240bp，整个融合基因大小约为2kb。(2)在蛋白水平上，载体蛋白只包含β-半乳糖苷酶从第1位至第583位共583个氨基酸肽段；抗原蛋白为上述的串联多肽，整个融合蛋白分子量约为72kDa。
本发明还提出了上述口蹄疫基因工程多肽疫苗的制备方法，包括基因制备、重组和融合蛋白的表达等，其步骤如下用RT-PCR方法从动物脾脏中扩增出IgG重链恒定区基因，β-半乳糖苷酶基因采用表达载体中的自带基因。用化学合成方法合成编码VP1蛋白中具有抗原性的氨基酸肽段的DNA序列，在DNA水平上连接成完整抗原基因，将此基因与上述载体蛋白基因相连，构成融合基因；然后将上述融合基因插入表达质粒载体，并转入大肠杆菌菌株。将菌株置于细菌培养基中，培养温度在30℃到37℃之间，培养时间8到25小时，然后收集菌体；将菌体破碎，收集融合蛋白，将融合蛋白配成油乳剂，即可获得新型口蹄疫多肽疫苗。
本发明提出的新型疫苗用于免疫易感动物，预防口蹄疫的发生。考虑到使疫苗发挥最大的免疫效应以及保持最长的效应持久性，我们提出以某种动物的IgG重链恒定区为载体蛋白的口蹄疫多肽疫苗最适用于预防该种动物口蹄疫。如以猪的IgG重链恒定区为载体蛋白的口蹄疫多肽疫苗最适用于预防猪口蹄疫；而以牛的IgG重链恒定区为载体蛋白的口蹄疫多肽疫苗最适用于预防牛口蹄疫。同时亦可交叉应用，即以一类动物的IgG重链恒定区为载体蛋白的口蹄疫多肽疫苗也适用于免疫他类动物预防口蹄疫。
该新型疫苗根据构建的抗原基因(或多肽)序列不同用于预防不同类型的口蹄疫。同样考虑疫苗的免疫效应，我们提出以O型FMDV基因序列为依据构建的疫苗最适用于预防O型口蹄疫；以A型FMDV基因序列为依据构建的疫苗最适用于预防A型口蹄疫；同理，以AsiaI等各型FMDV基因序列为依据构建的疫苗最适用于预防各自类型的口蹄疫。
该新型疫苗的又一特征是具有交叉免疫力。即以某一型内某一毒株的FMDV基因序列为依据构建的疫苗广泛适用于在各种易感动物中预防同型口蹄疫病毒不同毒株的感染。
本发明提出的疫苗在制备和检验过程中，采用了PCR、基因克隆与序列测定、序列分析、基因重组等基因工程技术与方法。并用SDS-PAGE蛋白检测方法，Western blotting、T细胞增殖实验、豚鼠及猪、牛抗病毒能力检测等免疫学方法检测了该疫苗的功效。
实施例(一)中，以IgG为载体蛋白构建猪口蹄疫O型多肽疫苗pXZ860。其结果如下SDS-PAGE电泳检测证明表达获得的融合蛋白分子量与预期一致(见
图1)。图中“1”是蛋白质分子量marker；“2、3、4”分别是空白受体菌Top10、空白质粒pTrcHis转化Top10和重组质粒pXZ860转化Top10的蛋白表达条带。在条带“4”中可见分子量与预期一致的融合蛋白。
Westem blotting检测证明该融合蛋白具有很强的抗原性，能与标准抗体发生特异的抗原抗体反应(见图2)。图2中“1、2、3、4”是与“图1”中的“1、2、3、4”相对应。其中条带“4”中可见特异的免疫印迹。
用该疫苗免疫豚鼠，检测T细胞增殖。结果证明该疫苗能有效地诱导动物T细胞增殖，进而诱导细胞免疫和体液免疫(见图3)。图中的横坐标表示标准抗原稀释倍数X，纵坐标表示刺激指数SI(注刺激指数以实验组的cpm值与不加抗原的阴性对照组cpm值的比值表示；cpm是用液闪计数仪测定的每分钟脉冲数)。可见将标准抗原稀释160倍就能刺激经疫苗免疫过的豚鼠T细胞增殖(SI＞2表示阳性反应)。
用该疫苗免疫豚鼠，一定时间后以O型口蹄疫病毒进行攻击。结果证明该疫苗对豚鼠具有很好的保护效果，保护率达100％(见表1)。
用该疫苗免疫猪，一定时间后以O型口蹄疫病毒进行攻击。结果同样证明该疫苗对猪具有很好的保护效果，保护率达100％(见表2)。
表1 pXZ860苗对豚鼠的免疫保护效果疫苗疫苗免疫剂量病毒攻击剂量实验豚鼠数发病豚鼠数保护率免疫组 400ug 50ID50/0.1ml6 0100％对照组 0 50ID50/0.1ml6 60表2 pXZ860苗对猪的免疫保护效果疫苗疫苗免疫剂量病毒攻击剂量攻击猪头数发病猪头数保护率免疫组 7mg 100ID50/2ml 5 0100％对照组 0 100ID50/2ml 5 50实施例(二)中，以β-半乳糖苷酶为载体蛋白构建牛口蹄疫0型多肽疫苗pXZ880。其结果如下SDS-PAGE电泳检测证明表达获得的融合蛋白分子量与预期一致(见图4)。图中“1、1’”是蛋白质分子量marker；“2、3、4”分别是重组质粒pXZ880和空白质粒pWR590转化大肠杆菌JM101，以及空白受体菌JM 101的蛋白表达条带，在条带“2”中箭头所示可见分子量与预期一致的融合蛋白。“2’”是包含体电泳条带；“3’”为融合蛋白纯化条带，该融合蛋白经纯化后纯度大于95％。
Western blotting检测证明该融合蛋白具有很强的抗原性，能与标准抗体发生特异的抗原抗体反应(见图4)。图中“5、6、7”是与“2、3、4”相对应的Western blotting反应条带；“4’、5’、6’”是与“3’、3、4”对应的Western blotting反应条带。其中条带“5”和“4’”中可见特异的免疫印迹。
用该疫苗免疫豚鼠，检测T细胞增殖。结果证明该疫苗能有效地诱导动物T细胞增殖，进而诱导细胞免疫和体液免疫(见图5)。图中的横坐标表示标准抗原稀释倍数X，纵坐标表示刺激指数SI(注刺激指数以实验组的cpm值与不加抗原的阴性对照组cpm值的比值表示；cpm是用液闪计数仪测定的每分钟脉冲数)。可见将标准抗原稀释160倍就能刺激经疫苗免疫过的豚鼠T细胞增殖(SI＞2表示阳性反应)。
用纯化的融合蛋白配制疫苗，并用该疫苗免疫豚鼠，一定时间后以O型口蹄疫病毒进行攻击。结果证明含100ug融合蛋白剂量的疫苗对豚鼠的保护率就可达80％(见表3)。
用包含体直接配制疫苗，并用一定剂量该疫苗免疫牛，一定时间后以牛源O型口蹄疫病毒进行攻击。结果同样证明该疫苗对牛具有较好的保护效果，保护率达66.7％(见表4)。
表3 pXZ880苗对豚鼠的免疫保护作用疫苗疫苗免疫剂量病毒攻击剂量攻击豚鼠头数发病豚鼠头数保护率免疫组 100ug 50ID50/0.2ml 5 1 80％对照组 0 50ID50/0.2ml 5 5 0表4 pXZ880苗对牛的免疫保护作用疫苗疫苗免疫剂量病毒攻击剂量攻击牛头数发病牛头数保护率免疫组 10mg100ID50/2ml3 1 66.7％对照组 0 100ID50/2ml2 2 0实施例(三)中，以β-半乳糖苷酶为载体蛋白构建猪口蹄疫O型多肽疫苗pXZ870。其结果如下SDS-PAGE电泳检测证明表达获得的融合蛋白分子量与预期一致(见图6)。图中“1”是蛋白质分子量marker；“2、3、4”分别是重组质粒pXZ870和空白质粒pWR590转化大肠杆菌JM101，以及空白受体菌JM 101的蛋白表达条带，在条带“2”中箭头所示可见分子量与预期一致的融合蛋白。
Westem blotting检测证明该融合蛋白具有较强的抗原性，能与标准抗体发生特异的抗原抗体反应(见图6)。图中“5、6、7”是与“2、3、4”相对应的Western blotting反应条带，其中条带“5”中可见特异的免疫印迹。
用包含体直接配制疫苗，并用一定剂量该疫苗免疫猪，一定时间后以猪源O型口蹄疫病毒进行攻击。结果显示，该疫苗对猪具有很好的保护效果，保护率达100％(见表5)。
表5 pXZ870苗对猪的免疫保护效果疫苗疫苗免疫剂量病毒攻击剂量攻击猪头数发病猪头数保护率免疫组 7mg 100ID50/2ml5 0 100％对照组 0 100ID50/2ml5 5 0
图2为多肽疫苗pXZ860的Western blotting检测图示。
图3为多肽疫苗pXZ860免疫豚鼠后检测T细胞图示。
图4中图4(a)为多肽疫苗pXZ860的SDS-PAGE电泳检测图示，图4(b)为该疫苗的Western blotting检测图示。
图5为多肽疫苗pXZ860免疫豚鼠后检测T细胞图示。
图6为多肽疫苗pX870的SDS-PAGE电泳和Western blotting检测图示。
用RT-PCR一步法从猪脾脏中扩增IgG重链恒定区基因。
化学合成猪O型口蹄疫病毒VP1基因中编码21ヘ40、141ヘ160位氨基酸肽段的DNA序列以及接头氨基酸肽段的DNA序列，串联成为141ヘ160AA-21ヘ40AA-141ヘ160AA的一级结构(SEQ ID NO.1)。将质粒载体pTrcHis以限制性内切酶酶切，将该片段与上述IgG重链恒定区基因以及串联抗原基因混合，在T4 ligase等作用下发生连接反应。获得的重组DNA，转化大肠杆菌Top10菌株的感受态细胞，培养于氨苄青霉素平板中，37℃倒置过夜。随意挑取转化子，分别以酶切鉴定，DNA测序分析鉴定转化子，从而获得阳性克隆。序列分析证明插入的基因序列与设计相符。将此克隆命名为pXZ860。
将pXZ860以含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养液为发酵液，37℃搅拌速度6000rpm通气培养2小时，加入IPTG诱导10小时后收集菌体。再将菌体悬浮于破壁液中，用95W功率的超声仪破壁5分钟。超声后5000rpm离心20分钟收集包涵体。并将包含体配成油乳剂，即可获得一种新型的猪口蹄疫O型基因工程多肽疫苗。
该疫苗所涉及的融合蛋白SDS-PAGE电泳检测结果见附图1所示；Western blotting检测结果见附图2所示；该疫苗免疫豚鼠后检测T细胞增殖实验，结果见附图3所示；抗病毒能力检测结果见表1和表2。
实施例(二)以抗牛口蹄疫O型多肽疫苗pXZ880为例进一步描述本发明。
用化学方法合成VP1基因中编码21ヘ40、141ヘ160位氨基酸片段的DNA序列以及接头DNA序列，串联成为141ヘ160AA-21ヘ40AA-141ヘ160AA的一级结构(SEQ IDNO.3)，将其插入表达载体pWR590。取1ug pWR590用EcoR I和BamH I双酶切，于37℃反应两小时，电泳割胶回收大片段。将此大片段DNA与上述串联片段混合，在T4 ligase等作用下发生连接反应。获得的重组DNA转化大肠杆菌感受态细胞，培养于氨苄青霉素平板中，37℃倒置过夜。挑取白色转化子，以BstEII单酶切、EcoR I和BamH I双酶切、PCR扩增、DNA测序分析鉴定转化子，从而获得阳性克隆。序列分析证明插入的基因序列与设计序列相符。将此克隆命名为pXZ880。
将pXZ880以含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养液为发酵液，37℃搅拌速度6000rpm通气培养2小时，加入IPTG诱导10小时后收集菌体。再将菌体悬浮于破壁液中，用95W功率的超声仪破壁5分钟。超声后5000rpm离心20分钟收集包涵体。将包涵体裂解，经Sepharose层析柱进行纯化。最后将包含体或纯化的融合蛋白配成油乳剂即可获得新型的牛口蹄疫O型基因工程多肽疫苗。
实施例(三)以抗猪口蹄疫O型多肽疫苗pXZ870为例进一步描述本发明。
用化学方法合成VP1基因中编码200ヘ213、141ヘ160位氨基酸片段的DNA序列以及接头DNA序列，串联成为141ヘ160AA-200ヘ213AA-141ヘ160AA的一级结构(SEQID NO.5)，将其插入表达载体pWR590。与实施例(二)类似的方法构建和筛选阳性克隆。序列分析证明插入的基因序列与设计序列相符。将此克隆命名为pXZ870。
将pXZ870以含50ug/ml氨苄青霉素的LB培养液为发酵液，37℃搅拌速度6000rpm通气培养2小时，加入IPTG诱导10小时后收集菌体。再将菌体悬浮于破壁液中，用95W功率的超声仪破壁5分钟。超声后5000rpm离心20分钟收集包涵体。将包涵体配成油乳剂，即可获得一种新型的猪口蹄疫O型基因工程多肽疫苗。
本发明涉及的序列如下SEQ ID NO.1GTG AGC AAC GTG AGG GGT GAC CTT CAA GTG TTG GCT CAG AAG GCA GAA AGA GTTCAC TCG TTG CAC TCC CCA CTG GAA GTT CAC AAC CGA GTC TTC CGT CTT TCT CAACTG CCC CCC GGT GAG ACA CAG GTC CAG AGA CGC CAG CAC ACG GAT ATC TCG TTTGAC GGG GGG CCA CTC TGT GTC CAG GTC TCT GCG GTC GTG TGC CTA TAG AGC AAAATA CTA GAC AGA TTT GTG CAG TTT GAG CTG GAG TTT ATG GTG CCC AGC AGG GTGTAT GAT CTG TCT AAA CAC GTC AAA CTC GAC CTC AAA TAC CAC GGG TCG TCC CACAGC AAC GTG AGG GGT GAC CTT CAA GTG TTG GCT CAG AAG GCA GAA AGA GTT CTGTCG TTG CAC TCC CCA CTG GAA GTT CAC AAC CGA GTC TTC CGT CTT TCT CAA GACCCCGGGSEQ ID NO.2VSNVRGDLQVLAQKAERVLPPGETQVQRRQHTDISFILDRFVQFELEFMVPSRVSNVRGDLQVLAQKAERVLPSEQ ID NO.3GTT ACC AAC GTT CGT GGT GAC CTG CAG GTT CTG GCT CAG AAA GCT GCTCAA TGG TTG CAA GCA CCA CTG GAC GTC CAA GAC CGA GTC TTT CGA CGACGT ACC CTG CCG CCG GGT GAA ACC CAG GTT CAG CGT CGT CAG CAC ACCGCA TGG GAC GGC GGC CCA CTT TGG GTC CAA GTC GCA GCA GTC GTG TGGGAC GTT TCT TTC ATC CTG GAC CGT TTC GTT CAG TTC GAA CTG GAG TTCCTG CAA AGA AAG TAG GAC CTG GCA AAG CAA GTC AAG CTT GAC CTC AAGATG GTT CCG TCT CGT GTT ACC AAC GTT CGT GGT GAC CTG CAG GTT CTGTAC CAA GGC AGA GCA CAA TGG TTG CAA GCA CCA CTG GAC GTC CAA GACGCT CAG AAA GCT GCT CGT ACC CTG CCGCGA GTC TTT CGA CGA GCA TGG TAC GGCSEQ ID NO.4VTNVRGDLQVLAQKAARTLPPGETQVQRRQHTDVSFILDRFVQFELEFMVPSRVTNVRGDLQVLAQKAARTLPSEQ ID NO.5GTA TCT AAC AAA CGT GGT GAC CTG CAG GTA CTT GCT CAG AAA GCT GAA CGT GCTCAT AGA TTG TTT GCA CCA CTG GAC GTC CAT GAA CGA GTC TTT CGA CTT GCA CGACTG CCG CCC GGT CGT CAC AAA CAG AAA ATC GTA GCT CCG GCT AAA CAG CTG CTGGAC GGC GGG CCA GCA GTG TTT GTC TTT TAG CAT CGA GGC CGA TTT GTC GAC GACCAA TTC GAG CTG GAA TTC ATG GTA CCC TCT CGT GTA TCT AAC AAA CGT GGT GACGTT AAG CTC GAC CTT AAG TAC CAT GGG AGA GCA CAT AGA TTG TTT GCA CCA CTGCTG CAG GTA CTT GCT CAG AAA GCT GAA CGT GCT CTG CCGGAC GTC CAT GAA CGA GTC TTT CGA CTT GCA CGA GAC GGCSEQ ID NO.6VSNKRGDLQVLAQKAERALPPGRHKQKIVAPAKQLLQFELEFMVPSRVSNKRGDLQVLAQKAERALP
权利要求
1.新型口蹄疫基因工程多肽疫苗，其特征在于以家畜自体IgG或细菌的β-半乳糖苷酶为载体蛋白，口蹄疫病毒抗原多肽连接在载体蛋白的末端，构成一融合蛋白，其中抗原多肽采用口蹄疫病毒VP1蛋白中具有抗原性的氨基酸肽段，并将其组成多拷贝的串联结构，在肽段连接处加入氨基酸多肽作为接头。
2.根据权利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于融合蛋白的载体蛋白是家畜IgG重链恒定区329个氨基酸全长序列，或第30位至328位共299个氨基酸肽段。
3.根据权利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于融合蛋白的载体蛋白是β-半乳糖苷酶从第1位至第583位共583个氨基酸肽段。
4.根据权利要求2和3所述的多肽疫苗，其特征在于融合蛋白的载体蛋白可以是家畜IgG重链恒定区全长氨基酸序列的同源序列、IgG重链恒定区第30位至328位共299个氨基酸肽段的同源序列，或者是β-半乳糖苷酶从第1位至第583位共583个氨基酸肽段的同源序列。
5.根据权利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于抗原多肽采用如下串联结构Y-M-X-N-Y或者Y-M-Z-N-Y，其中，同一个串联结构的“X”、“Y”、“Z”肽段来源于同一型口蹄疫病毒VP1蛋白序列，并且“X”、“Y”、“Z”肽段分别代表口蹄疫O型病毒VP1蛋白21ヘ40、141ヘ160、200ヘ213位氨基酸肽段，或者口蹄疫A、AsiaI型病毒表面蛋白的相应氨基酸肽段，“M”是“Pro-Gly”二肽接头，“N”是“Gln-Phe-Glu-Leu-Glu-Phe-Met-Val-Pro-Ser-Arg”十一肽接头。
6.根据权利要求5所述的多肽疫苗，其特征在于“X”、“Y”、“Z”肽段可以前后浮动适当个数的氨基酸残基采用35ヘ53、134ヘ158、141ヘ158、135ヘ144、188ヘ209位氨基酸肽段。
7.根据权利要求5或6所述的多肽疫苗，其特征在于“X”、“Y”、“Z”肽段中的氨基酸可因预防不同的口蹄疫变异毒株的需要进行调整“X”肽段中有1-4个氨基酸可被置换，“Y”肽段中有1-5个氨基酸可被置换，“Z”肽段中有1-2个氨基酸可被置换。
8.根据权利要求1-3之一所述的多肽疫苗，其特征在于抗原多肽连接在载体蛋白的C端。
9.根据权利要求1所述的多肽疫苗，其特征在于抗原多肽基因序列为SEQ IDNO.1，其编码的抗原多肽氨基酸序列为SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，其编码的抗原多肽氨基酸序列为SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5，其编码的抗原多肽氨基酸序列为SEQ ID NO.6。
10.如权利要求1所述的多肽疫苗的应用，其特征在于以某种易感动物的IgG重链恒定区为载体蛋白的口蹄疫病毒多肽疫苗适用于预防该种动物口蹄疫；亦可交叉应用以一类易感动物的IgG重链恒定区为载体蛋白的口蹄疫病毒多肽疫苗也适用于免疫他类易感动物预防口蹄疫。
11.如权利要求1所述的多肽疫苗的应用，其特征在于以某一型口蹄疫病毒基因序列为依据构建的疫苗最适用于预防该型口蹄疫；而且具有交叉保护作用以某一型某一毒株的口蹄疫病毒基因序列为依据构建的疫苗广泛适用于各种易感动物预防同型口蹄疫病毒不同毒株的感染。
12.如权利要求1所述的口蹄疫基因工程多肽疫苗的制备方法，包括基因制备、重组及融合蛋白的表达，其特征在于具体步骤如下(1)用RT-PCR方法从动物脾脏中扩增出IgG重链恒定区基因。用化学合成方法合成编码VP1蛋白具有抗原性的氨基酸肽段的DNA序列，在DNA水平上连接成完整抗原基因，将此基因与上述IgG重链恒定区基因或者β-半乳糖苷酶基因相连，构成融合基因；(2)将上述融合基因插入表达质粒载体，并转入大肠杆菌菌株；(3)将阳性菌株在30℃到37℃之间培养8到25小时，然后收集菌体；(4)将菌体破碎收集表达的融合蛋白；(5)将融合蛋白纯化，并乳化配制成本发明有关的多肽疫苗。
全文摘要
本发明是一种口蹄疫基因工程多肽疫苗的设计、构建及其制备方法。本发明采用家畜IgG重链恒定区或β－半乳糖苷酶作为载体蛋白，将其与口蹄疫病毒抗原多肽相连，制备出新型口蹄疫基因工程多肽疫苗。用PCR方法扩增出家畜IgG重链恒定区基因，用化学合成法合成编码口蹄疫病毒VP1蛋白中具有抗原性的氨基酸肽段基因，并将这些基因以多拷贝的方式串联，再与IgG重链恒定区基因或β－半乳糖苷酶基因连接形成融合基因。将此融合基因插入表达载体，经发酵制备成疫苗。该疫苗安全性好，效果显著，对家畜有理想的保护效果。
文档编号C12N15/62GK1408349SQ0213701
公开日2003年4月9日 申请日期2002年9月16日 优先权日2002年9月16日
发明者郑兆鑫, 严维耀, 李光金, 陈维灶, 赵凯, 刘明秋, 张青, 易建中, 徐泉兴, 盛祖恬, 郭杰炎 申请人:复旦大学