专利名称：人γ-干扰素在毕赤酵母菌中的高效表达、发酵和纯化的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，更具体地说是涉及一种用DNA重组技术合成人γ-干扰素、含有该基因的重组载体、用该载体转化的宿主、以及利用转化体产生人γ-干扰素的发酵和纯化方法。
背景技术：
γ-干扰素(IFN-γ)是wheelock在1965年发现的，又称免疫型干扰素。它具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等生理作用，在临床上有着广泛的应用。天然人IFN-γ是由丝裂原、内毒素或外来抗原刺激T淋巴细胞产生的，含量很低且提纯困难，难以满足临床需要。目前临床上应用的人IFN-γ大都是采用DNA重组技术生产的。
重组人γ-干扰素现有技术是由大肠杆菌(Escherichia coli.)作宿主菌用原核表达系统表达的。中国科学院上海生物化学研究所刘新垣等1994年用合成的人γ-干扰素cDNA在大肠杆菌中表达人γ-干扰素(见中国科学(B辑)，24(10)，1076-1084，1994；和中国专利94112091)。中国预防医学科学院病毒学研究所侯云德和卫生部上海生物制品研究所亦采用带有人γ-干扰素基因的杂交质粒pBV220转染大肠杆菌DH5α株，组建成表达工程菌(病毒学报，4，97，1988)。上述两表达菌株表达的人γ-干扰素最初皆是以包涵体形式存在，即表达产品不溶于水，人γ-干扰素蛋白为非天然折叠构象，需经包涵体复性等复杂步骤纯化处理(病毒学报，13，134-139，1997；微生物学报，33(4)，248-254，1993；生物工程学报，14(2)，203-207，1998)。由于原核表达体系的局限性和包涵体复性及纯化处理的复杂性，有时会造成表达的人γ-干扰素C端不均一缺失，分别丢失13、15、18个氨基酸残基，使基因工程表达的人γ-干扰素一级结构与天然的人γ-干扰素一级结构有很大差别(生物工程学报，10(1)，50-55，1994)。为克服现有技术存在之不足，设计寻找一种以毕赤酵母(Pichiapastoris)为宿主高效表达人γ-干扰素并进行发酵和纯化的新技术方法，具有一定的理论意义和十分重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是寻找一种人γ-干扰素基因在毕赤酵母菌(P.pastoris)中高效表达、发酵及纯化的新技术方法，以克服现有技术存在的不足。目前国内外市场上的人γ-干扰素工业化生产菌株皆采用大肠杆菌作为宿主表达。本发明采用甲醇诱导型酵母菌作为人γ-干扰素的工业化生产菌株。由于是真核酵母细胞的胞内表达，故表达获得的人γ-干扰素蛋白的一级结构和二级结构与人体内天然产生的γ-干扰素完全一致，表达的γ-干扰素完全水溶，不含内毒素。
本发明中构建的生产用表达人γ-干扰素的毕赤酵母菌的菌种[Pichiapastoris SMD1163(pPIC3.5K-ifn，his4 pep4 △prb1)-181]保藏号为CGMCCNO.0758，保存日期2002年07月03日，地址北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，邮编100080。
在设计人γ-干扰素基因时，将某些氨基酸的三联体密码子的第三个碱基加以更换，使其为甲醇酵母所喜欢的密码子。这样不会改变人γ-干扰素蛋白质的氨基酸顺序，但可提高γ-干扰素在甲醇酵母中的表达效率。Pichia pastoris的密码子偏爱性统计已经有相关的报道，根据这种密码偏爱性统计表对已知序列中存在的少量稀有密码进行点突变以实现基因的高表达，是一种行之有效的实现高表达的方法。但是当存在较多稀有密码而需要全合成基因时，仅仅采用偏爱密码将可能使合成基因出现G+C％失调、非期望的二级结构和氨酰tRNA拥挤等现象，最终结果可能反而得不到更高的表达量。在本发明中我们以剔除基因中的稀有密码子为主，按照以下方法来设计合成IFN-γ基因1.通过网上数据检索，从Http//www.kazusa.or.jp/codon处获得P.pastoris的密码子使用频率表。这个表共统计了P.pastoris中39个蛋白质的氨基酸密码子使用情况(表略)。
2.将以上获得的P.pastoris密码子使用频率表适当修改后作为参数输入CODOP生物软件，并以人γ-干扰素氨基酸序列(图1)为基础，对天然人γ-干扰素基因序列进行重新设计。其中密码子有效数(Effective number ofcodons，Nc)的阀值设定为0.7，并以此值来判定稀有密码(注CODOP生物软件的主要功能是自动将稀有密码按比例随机替换成编码同一个氨基酸的非稀有密码)。
3.采用Biosuite VectorNTI生物软件制作初步设计基因的限制性内切酶谱，并手工去除内部可能存在的Sac I、PshA I、Sal I、Bgl II、BamH I、Avr II、Xho I、Xba I酶切位点，以方便后续的基因操作。
4.根据(G+C)％、基因内部的重复序列和是否存在mRNA拼接位点(图3)等，结合密码子使用表，进一步手工修改设计的基因序列。
5.根据确定的PCR法全合成方案得出所需合成的24条引物序列(见图2)，通过基因序列的修改使所有引物的熔点都在50℃以上。
6.在设计的基因序列两端根据需要加入适当的酶切位点以方便基因操作。
7.对设计的γ-干扰素基因经计算机检查，排除不必要的二级结构，尤其要排除5’端的二级结构，以免影响mRNA的翻译功能。
根据以上原则重新设计得到的IFN-γ基因(G+C)％为40.37；基因内部潜在的mRNA拼接模型和重复序列已经去除；密码子使用得到合理平衡；排除了影响mRNA的翻译功能的二级结构，尤其是排除了5’端的二级结构。所需合成24条引物(见图2)的熔点用[4×C+G+2×A+T]计算都在52-60℃间，采用[81.5+0.41×(G+C/(A+C+G+T)×100)-675/(A+C+G+T)]算法则都在60-70℃间。
参考DNA混洗的方法，我们通过一步PCR装配和扩增最终得到了500bp左右的DNA片段(图4)。由于采用了pfu聚合酶反应，得到的DNA片段为平端产物，可以直接将获得的PCR产物装入经Sma I酶解的pUC18克隆载体中。X-Gal/IPTG蓝白斑筛选后，挑取一个克隆送交赛百胜公司测序，结果与理论设计的IFN-γ基因序列完全一致。
对测序验证过的pUC18-ifn质粒经扩增、抽提后，用Avr II、EcoR I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收pUC18-ifn基因片段，而后与同样用Avr II、EcoRI双酶切并经琼脂糖凝胶电泳回收的pPIC3.5K的载体相连接，用氨苄抗性筛选得到pPIC3.5K-ifn表达载体.此pPIC3.5K-ifn质粒DNA用Bgl II酶切线性化后琼脂糖凝胶电泳分离并回收其中含人γ-干扰素基因表达盒的片段，将此表达盒片段用于电击转化。同时用Bgl II酶切线性化的pPIC3.5K空质粒作为电击转化对照。
电击转化及克隆筛选方法参照Invitrogen毕赤酵母实验手册，其中宿主细胞采用蛋白酶双缺菌株Pichia pastoris SMD1163(his4 pep4 prb1)。电击转化后的细胞涂布4块RDB平板，宿主细胞SMD1163为组氨酸缺陷，表达载体含编码组氨酸的基因，利用其互补效应筛选出组氨酸阳性克隆。各加2ml无菌蒸馏水至4块RDB平板中，洗出组氨酸阳性克隆并合并之，各吸取200μl菌体液分别涂布于含1、2、4、6mg/ml的G418 YPD平板上，挑选G418浓度4和6mg/ml两平板上的G418抗性多拷贝克隆。
上述多拷贝克隆分别进行小量发酵表达，其方法如下用灭菌牙签挑取单克隆株，接种子含适量YPD的试管中，30℃震荡培养过夜。取适量菌体接种至含BMGY的50ml离心管中，28-30℃培养震荡16小时；离心收集菌体。在超净台中重新加入少量BMMY，并将离心盖换成4层无菌纱布。继续于28-30℃震荡培养24小时后加纯甲醇诱导；再培养24小时后补加适量纯甲醇；又继续培养24小时后，离心收集菌体和上清，分别进行SDS-PAGE电泳检测胞内和发酵液上清中蛋白表达情况，结果发现胞内存在17KD左右的特异性蛋白条带，而发酵液上清几乎没有特异性蛋白条带出现。这说明筛选得到的细胞株为胞内表达。
挑选上述G418浓度4和6mg/ml两平板上的高拷贝克隆共511株分别按上述小量发酵方法进行发酵表达并离心收集菌体；菌体用Zymolase酶消化后再进行超声破碎，离心后的上清液直接点样至硝酸纤维膜上进行免疫印迹和SDS-PAGE电泳实验，检测胞内表达蛋白其中编号为pPIC3.5K-ifn-181的菌株能胞内均一表达17KD的IFN-γ目的蛋白，而且表达量占酵母菌体蛋白的25％左右。将pPIC3.5K-ifn-181菌株保存备用。
将上述编号为pPIC3.5K-ifn-181的菌株命名为Pichia pastoris SMD1163(pPIC3.5K-ifn，his4 pep4 △prb1)-181，并进行工业化规模的大罐发酵，其方法如下将种子液接种于YPB培养基中30℃培养生长。将含一定量的(NH4)2SO4，、KCl、MgSO4、CaSO4、NaCl溶液加入发酵罐中，高压灭菌。待冷却至29℃时加入一定量的葡萄糖、六甲基磷酸酯钠盐和微量元素母液，用氨水和磷酸调节发酵液pH至5。将种子液接种至发酵罐中，在29-30℃温度、300-800rpm转速和30％的溶氧条件下培养24-36小时。随后补加葡萄糖和(NH4)2SO4溶液及微量元素，此阶段共培养24小时；最后补加葡萄糖和纯甲醇，此阶段共培养3648小时。停止培养，离心收集菌体。
本发明所用的酵母菌种合成γ-干扰素是由该酵母菌所携带的甲醇利用型基因AOX1基因所调控，由于此基因产物受甲醇的浓度而影响，所以可以利用甲醇的浓度来控制γ-干扰素的合成，可先在30℃进行第一阶段的生长培养，然后再在含一定浓度甲醇的培养基中进行第二阶段的表达培养，采用两个阶段的培养策略，容易获得人γ-干扰素的高效表达。发酵后离心，收集菌体；经过加蒸馏水悬浮后离心的操作步骤，水洗菌体二次。加入酸洗玻璃珠混匀后超声破菌，离心取上清液，此上清液通过Sepharose DEAE阴离子交换树脂，表达的γ-干扰素蛋白被吸附在树脂上，用缓冲液(0.8M NaCl，0.1M PB，pH8)将被吸附的γ-干扰素粗品洗脱下来。洗脱获得的γ-干扰素样品经透析除盐，用Sephacryl S-200进行分子筛凝胶过滤层析，用缓冲液(0.1M NH4Ac，0.05％Tween，pH7.0)作流动相分离得2个峰的样品洗脱图，第二个峰为γ-干扰素样品峰，收集之。将收集的样品进行DEAE Sepharose阴离子层析，流动相为0.1M NH4Ac，2.5％蔗糖，pH7.0的缓冲液。在此条件下，γ-干扰素样品不被保留，杂质被吸附保留。再用CM Sepharose树脂进行阳离子交换层析。流动相由A液(20mM NH4Ac，5％蔗糖，pH8)和B液(20mM NH4Ac、5％蔗糖、0.7M NaCl、pH8)组成，用离子强度递增法洗脱，收集第三个样品峰，得纯γ-干扰素纯品。得到的纯品进行效价测定、蛋白定量、SDS-PAGE电泳、高压液相色谱分析、残余DNA含量测定、等电点测定、紫外扫描、肽图分析、N-端氨基酸测定和免疫印渍试验，最后再用鉴别试验证明纯化的产物即为人γ-干扰素。
图1.适合在毕赤酵母菌(Pichia pastoris)中高效表达的合成人γ-干扰素基因序列及其相应的氨基酸序列。图2.合成的24条寡核苷酸引物序列。图3.毕赤酵母菌(P.pastoris)中pre-mRNA的剪切内含子示意式。图4.PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳分析。
PCR混合物中含20ng/μL引物混合物(24条寡核苷酸引物)，5单位pfuDNA聚合酶和300μnol/L的dNTP组成；1和2为γ-干扰素PCR合成产物；3为DL 2000 DNA标准分子量。图5.在毕赤酵母菌(P.pastoris)中表达γ-干扰素的表达载体pPIC 3.5K-ifn的构建。图6.γ-干扰素胞内表达产物的硝酸纤维膜免疫印迹分析(筛选含多拷贝pPIC3.5K-ifn的毕赤酵母菌株)。
1-3为阳性对照；4和5为阴性对照；其余的为pPIC 3.5K-ifn阳性的SMD1163株。图7.甲醇酵母菌Pichia pastoris SMD1163(pPIC 3.5K-ifn，his4 pep4 △prb1)-181发酵胞内表达γ-干扰素产物SDS-PAGE分析。
1-3分别为诱导前发酵培养24，36，48小时后破菌样品上清；4-8分别为甲醇诱导后发酵培养8，16，24，36，48小时后破菌样品上清；9为标准分子量蛋白。图8.不同批次的甲醇酵母菌Pichia pastoris SMD1163(pPIC 3.5K-ifn，his4 pep4Δprb1)-181发酵胞内表达γ-干扰素产物SDS-PAGE分析。
1，2为未诱导对照；3-6为1％甲醇诱导后发酵培养36-48小时后破菌样品上清；7为蛋白标准分子量。图9.纯化后的γ-干扰素样品SDS-PAGE分析(银染)。
A为蛋白标准分子量；B，D，F为还原剂巯基乙醇处理过的γ-干扰素样品，C，E，G为未还原处理的γ-干扰素样品。图10.纯化后的γ-干扰素样品分子量测定。图11.纯化后的γ-干扰素样品HPLC纯度分析。图12.纯化后的γ-干扰素样品中DNA残留量分析。
A，B，E为γ-干扰素样品；C为阳性对照；D为阴性对照。图13.纯化后的γ-干扰素样品等电聚焦分析。
A，B，C为γ-干扰素；D为已知等电点的标准品。图14.纯化后的γ-干扰素样品紫外吸收图谱。图15.纯化后的γ-干扰素样品肽图电泳分析图谱。
A为标准肽分子量；B-D为γ-干扰素。图16.纯化后的γ-干扰素样品肽图HPLC分析图谱。图17.纯化后的γ-干扰素N末端分析序列。图18.纯化后的γ-干扰素样品免疫印迹分析。
1-3皆为γ-干扰素。图19.纯化后的γ-干扰素样品单克隆抗体中和作用关系图。图20.纯化后的γ-干扰素样品单克隆抗体中和作用96孔板原始结果。本发明具有下列优点1.设计的γ-干扰素的基因序列(图1)特别适合于毕赤酵母菌(P.pastoris)中表达，构建的载体(图5)整合至毕赤酵母菌的基因组中，十分稳定，不易丢失。2.采用蛋白酶缺陷的SMD1163毕赤酵母菌(Pichia pastoris SMD1163(his4pep4△prb1)为宿主菌，采用胞内表达的载体pPIC 3.5K-ifn作表达载体(图5)，使大量表达的γ-干扰素蛋白存在于胞内而不易降解。3.用G418抗性浓度递增法筛选多拷贝克隆，使人γ-干扰素蛋白的表达量占总菌体蛋白的25％(图8)。4.发酵培养初期采用不含甲醇的培养基培养，培养后期采用1％甲醇的诱导培养基培养，使酵母菌的生长和蛋白表达有效地分开，γ-干扰素表达量可维持在较高水平，而且不易降解。5.纯化步骤简洁高效，终产品内毒素含量极低，有利于临床使用。
具体实施方法通过下列实施例对本发明的技术特征作详细描述，但不限制本发明。实施例1人γ-干扰素生产用酵母菌种的构建一材料和方法(一)实验材料酵母菌Pichia pastoris SMD1163(his4 pep4 prb1)、表达质粒pPIC3.5K和G418均为Invitrogen公司产品。克隆载体pUC18为本公司保存。
限制性内切酶EcoR I、Xho I、Xba I、Avr II、Bgl II、Sma I和PshA I均为TakaRa公司产品；质粒抽提试剂盒WizardTMPlus Minipreps DNAPurification System和PCR产物回收试剂盒WizardTMPlus Minipreps PCRPurification System购自Promega公司；胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。
酵母培养基YPD、BMGY、BMMY、RD、RDH、RDB、RDHB、YPD/G418、MD、MDH、MM和MMH，成份均同Invitrogen毕赤酵母实验手册。兔抗人γ-干扰素多抗为自制产品。
计算机生物软件CODOP由英国Liz Carpenter博士(National Institute forMedical Research)惠赠。(二)实验方法1 常规基因操作常规操作基本参考有关文献。质粒抽提和PCR产物回收采用Promega相关试剂盒；胶回收按照上海华舜产品说明书。2 IFN-γ基因全合成方法针对巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)优化设计的序列分24条引物，委托北京赛百胜公司合成，合成的24条引物见图2。
其中Oligo 1、12和13含有的EcoR I、Xho I、Avr II或Xba I酶切位点用于克隆操作。除Oligo 13外，其它23条DNA片段全为40bp。Oligo 1中下划线所示为IFN-γ基因编码序列的开始，Oligo 12中加框的TAG为终止序列。参考DNA shuffling方法，按照以下步骤PCR扩增IFN-γ的全长基因序列(图1)将等量的24条寡核苷酸片段混合，形成引物池。接着按照以下比例混合成为PCR反应液引物池1.56μl(DNA终浓度约20ng/μl)；10×pfu缓冲液5μl；pfu聚合酶1μl；dNTP(10mmol/L each)1.5μl；H2O 40.9μl。此反应液在Hybaid PCR Sprint扩增仪上先于94℃变性5min；而后94℃ 30sec，55℃ 45sec，72℃ 30sec+3sec/循环；共进行45个PCR扩增循环。最后在72℃延伸10min得到全长的IFN-γ基因(图1)。3 pPIC3.5K-ifn的构建将含有合成IFN-γ基因的克隆质粒pUC18-ifn用EcoR I和Avr II双酶切，1％琼脂糖胶电泳并回收含IFN-γ基因的片段，而后与用相同内切酶双酶解并回收的pPIC3.5K相连接，氨苄抗性筛选得到pPIC3.5K-ifn(图5)。4 表达质粒转化P.pastoris细胞电击转化及克隆筛选方法参照Invitrogen毕赤酵母实验手册，其中宿主细胞采用蛋白酶双缺菌株P.pastoris SMD1163(his4 pep4 prb1)。pPIC3.5K-ifn质粒DNA用Bgl II先酶切线性化并回收含IFN-γ基因表达盒片段，此回收的表达盒片段用于电击转化。同时用Bgl II酶解的pPIC3.5K空质粒作为电击转化对照。5 IFN-γ表达方法用pPIC3.5K-ifn质粒电击转化后获得的重组克隆，进行IFN-γ表达；其表达方法参照Invitrogen毕赤酵母实验手册。6 免疫印迹法和SDS-PAGE检测方法免疫印迹法基本同Western-blot方法，仅样品直接点加到硝酸纤维膜上，烘干后再后续处理。其中γ-干扰素抗体采用兔抗人多抗；二抗偶联为辣根过氧化物氧化酶；显色底物为邻苯二胺。7 P.pastoris基因组DNA抽提方法P.pastoris重组细胞接种3ml YPD，30℃摇床培养到OD600约5-8之间；室温离心收集菌体于1.5ml Eppendorf管中；用灭菌水洗涤一次后再用0.5ml的SCED溶液悬浮菌体，并添加40μl浓度为1mg/ml的Zymolase和10μl 2-巯基乙醇；37℃ 200r/min震荡处理1h后离心去上清，沉淀的菌体用0.5mlTris/EDTA(含50mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA)重新悬浮并添加50μl10％SDS；65℃处理20min后溶液变得粘稠，此时加入200μl 5M的KAc，倒置混匀后放冰上30-60min；而后室温离心并将上清转移到一新的Eppendorf管中，加入约1ml的无水乙醇(可见丝状DNA沉淀)；室温离心10秒，倒去上清后倒置滤干DNA沉淀。所得的DNA用300μl TE重新溶解并加入50μlRAase A。37℃保温1h以降解其中的RNA。最后加入0.5ml异丙醇，DNA沉淀析出后用灭菌的牙签挑出并置入一新的Eppendorf管中，加入100μl TE溶解后，用于PCR扩增IFN-γ表达盒。二实验结果(一)IFN-γ基因设计在设计γ-干扰素基因时，将某些氨基酸的三联体密码子的第三个碱基加以更换，使其为酵母所偏爱的(即甲醇酵母菌中使用频率高的)密码子。这样不会改变蛋白质的氨基酸顺序，但可提高γ-干扰素在甲醇酵母中的表达效率。改变的主要目的，是为了提高表达效率。改变三联体密码子第三个碱基的另一目的是希望能增加一些酶切位点，以便将来易于切出某些片段，加以修改，进行蛋白质工程改造，以研究γ-干扰素的结构与功能关系。人工合成γ-干扰素基因(图1)的限制性酶切位点如表1。
设计好的γ-干扰素基因还要用计算机检查，排除不必要的二级结构，尤其要排除5’端的二级结构，以免影响mRNA的翻译功能。P.pastoris的密码子偏爱性统计已经有相关的报道，根据这种密码偏爱表对已知序列中存在的少量稀有密码进行点突变以实现基因的高表达，这是一种可行的方法。但是当存在较多稀有密码而需要全合成基因时，仅仅采用偏爱密码将可能使合成基因出现G+C％失调、非期望的二级结构和氨酰tRNA拥挤等现象，最终结果可能反而得不到更高的表达量。在本实验中我们以剔除基因中的稀有密码子为主，按照以下方法来设计合成IFN-γ基因1.通过网上数据检索，从Http//www.kazusa.or.jp/codon处获得P.pastoris的密码子使用频率表。这个表共统计了P.pastoris中39个蛋白质的氨基酸密码子使用情况(表略)。经分析表明，这个密码子使用频率表与已经报道的密码子偏爱性表存在很大的相关性。
2.将以上获得的P.pastoris密码子使用频率表适当修改后作为参数输入CODOP生物软件，并以人γ-干扰素氨基酸序列(图1)为基础，对原γ-干扰素基因序列进行重新设计。其中密码子有效数(Effective number of codons，Nc)的阀值设定为0.7来判定稀有密码。(注CODOP生物软件的主要功能是自动将稀有密码按比例随机替换成编码同一个氨基酸的非稀有密码)
表1 人工合成γ-干扰素基因的限制性内切酶位点Xho I EcoR I Alu I(194) Bbv I(383)Pae R7 I(6)Fok I(210) Alu I(396)Ava I(6) Sau 3A I(215) Pvu II(396)Taq I(7) Nde I(215) Msp A1I(396)Alu I(27) Mbo I(215) Ita I(397)Drd I(39) Dpn II(215)Fnu 4H I(397)Eco 57 I(43) Bcl I(215) Bsa W I(405)Ssp I(69) Dpn I(217) Msp I(406)Tru 9 I(73)Bsm A I(234) Hpa II(406)Mse I(73) Tru 9 I(274) Bsm A I(427)Ksp 632 I(136) Mse I(274) Bsa I(427)Ear I(136) Hind II(313) Bpu A I(449)Bsr I(138) Hinc II(313) Bbs I(449)Hinf I(144)Tsp 509 I(317) Sty I(462)Ple I(152) Dde I(323) Bsa J I(462)Sau.3A I(172) Mae III(326) Bln I(462)Nde II(172)Drd I(339) Avr II(462)Mbo I(172) Bsl I(350) Mae I(463)Dpn II(172)Bsi Y I(350) Bfa I(463)Dpn I(174) Alu I(365) Xba I(475)Bsm A I(182) Hinf I(368)Mae I(476)Esp 3 I(182) Tfi I(368) Bfa I(476)Hind III(192) Bpm I(376) Sfa N I(476)3.采用Biosuite VectorNTI生物软件制作初步设计基因的限制性内切酶谱，并手工去除内部可能存在的Sac I、PshA I、Sal I、Bgl II、BamH I、Avr II、Xho I、Xba I、EcoR I酶切位点，以方便后续的基因操作。
4.根据(G+C)％、基因内部的重复序列和是否存在mRNA拼接位点(图3)等，结合密码子使用表，进一步手工修改设计的基因序列。
5.根据确定的PCR法全合成方案得出所需合成的24条引物序列(图2)，通过基因序列的修改使所有引物的熔点都在50℃以上。
6.在设计的基因序列两端根据需要加入适当的酶切位点以方便基因操作。
根据以上原则重新设计得到的IFN-γ基因(G+C)％为40.37；基因内部潜在的mRNA拼接模型和重复序列已经去除；合成序列和原序列的密码子使用情况如表2所示，其中密码子有效数Nc为(某一氨基酸的某一密码子在该氨基酸的所有密码子中占有的比例％/100)×该氨基酸的密码子数；突出显示的是本设计中依据Nc判定的稀有密码；所需合成24条引物(图2)的熔点用[4×C+G+2×A+T]计算都在52-60℃间，采用[81.5+0.41×(Gr+C/(A+C+G+T)×100)-675/(A+C+G+T)]算法则都在60-70℃间。
表2.The codon usage of synthetic IFN-γ gene and original IFN-γgene
aCodon usage of the original IFN-γ gene；bCodon usage of the synthetic IFN-γgene.(二)IFN-γ表达载体构建参考DNA混洗的方法，我们通过一步PCR装配和扩增即最终得到了500bp左右的DNA片段(图4)。由于采用了pfu聚合酶反应，得到的DNA片段为平端产物，可以直接将获得的PCR产物装入经Sma I酶解的pUC18克隆载体中。X-Gal/IPTG蓝白斑筛选后，挑取一个克隆送交赛百胜公司测序，结果与理论设计的IFN-γ基因序列完全一致。
经测序验证的pUC18-ifn质粒扩增后，按照前述方法构建获得IFN-γ的P.pastoris表达质粒pPIC3.5K-ifn(图5)。(三)重组细胞的表达在本实验优化序列表达中，我们使用P.pastoris SMD 1163作为宿主细胞。pPIC3.5K-ifn电击转化SMD 1163后，用G418浓度递增法筛选含多拷贝表达载体的重组克隆，并对获得的重组克隆进行小量发酵表达。
电击转化后的细胞涂布4块RDB平板，宿主细胞SMD 1163为组氨酸缺陷，表达载体含编码组氨酸的基因，利用其互补效应筛选出组氨酸阳性克隆。各加2ml无菌蒸馏水至4块平板中，洗出组氨酸阳性克隆并合并之，吸取200μl菌体液涂布于含1、2、4、6mg/ml的G418 YPD平板上，挑选出G418浓度4和6mg/ml两平板上的G418阳性克隆共511株。
将上述多拷贝克隆分别进行小量发酵表达。用灭菌牙签挑取单克隆株，接种于含3ml YPD的试管中，30℃ 300rpm培养过夜。取150μl菌体接种至含15ml BMGY的50ml离心管中，28-30℃ 300rpm培养16小时；在离心机上以4000rpm的速度离心收集菌体。在超净台中加5ml BMMY，并将离心盖换成4层无菌纱布。继续于28-30℃ 300rpm培养24小时后加50μl纯甲醇；再培养24小时后补加50μl纯甲醇；又继续培养24小时后5000rpm离心收集菌体，用Zymolase酶消化后再进行超声破碎，离心后的上清液直接点硝酸纤维膜进行免疫印迹实验。我们筛选到很多的呈现明显的阳性反应SMD1163/pPIC3.5K-ifn重组克隆(图6)。离心收集菌体和上清，分别进行SDS-PAGE电泳检测胞内蛋白和发酵液分泌蛋白，结果发现胞内存在17kD左右的特异性蛋白条带，而发酵液上清几乎没有特异性蛋白条带出现。这说明筛选得到的细胞株为胞内表达。同时抽提重组细胞SMD 1163/pPIC3.5K-ifn的总DNA，使用合成DNA片段Oligo 1和Oligo 13作为引物进行PCR扩增，结果都能得到约500bp的特异性条带(图略)，表明重组细胞中整合有合成的IFN-γ基因表达盒。将阳性克隆用含5-15mg/ml G418的YPD平板反复筛选多拷贝克隆，并进行小量发酵表达；离心后收集菌体并破菌；破菌液离心后上清直接点硝酸纤维膜进行免疫印迹实验和SDS-PAGE电泳，检测胞内表达蛋白；其中编号为pPIC3.5K-ifn-181的菌株能胞内均一表达17KD的IFN-γ目的蛋白，而且表达量占酵母菌体蛋白的25％左右。将pPIC3.5K-ifn-181菌株命名为Pichia pastoris SMD1163(pPIC 3.5K-ifn，his4 pep4 △prb1)-181并保存备用。实施例2人γ-干扰素生产用酵母菌种的工业化发酵一、实验材料和仪器1.菌种甲醇酵母菌Pichia pastoris SMD1163(pPIC 3.5K-ifn，his4 pep4 △prb1)-181。
2.发酵罐德国B.Bruan公司的Biostate E 5升发酵罐。
3.电泳仪Pharmacia公司的Phast System电泳系统。
4 分光光度计Beckman公司的DU-68型分光光度计。
5.培养基及培养基配制用试剂(1)YPD，YPB；(2)富营养培养基YPD中按100ug/ml添加腺嘌呤，亮氨酸，尿嘧啶；(3)贫营养培养基；(4)1％甲醇(W/V)贫营养培养基；(5)培养基配制用其它试剂皆为分析纯或生化级试剂。二、培养发酵方法将酵母菌接种于25ml YPB培养基中于30℃培养生长。将含57.8克(NH4)2SO4，46.6克KCl，30.8克MgSO4·7H2O，8.6克CaSO4·2H2O和2.0克NaCl的2.5升溶液加入发酵罐中，高压灭菌。冷却至29℃，加入350ml 50％葡萄糖，210ml 30％六甲基磷酸酯钠盐溶液和250ml 10倍浓度的微量元素溶液。10倍浓度的微量元素浓度为每升含27.8克FeSO4·7H2O，0.5克CuSO4·5H2O，1.09克ZnCl2，1.35克MnSO4·H2O，0.48克CoCl2·6H2O，0.24克Na2MoO4·2H2O，0.5克H3BO3，0.08克KI，5毫克生物素，0.5克维生素B1，2.5毫升硫酸，用10％ NH4OH和10％ H3PO4将发酵液pH调至5，调节无菌压缩空气，流速为50升/分，转子转速为300rpm；调节溶氧至30％，搅拌速度300-800rpm，搅拌速大于800rpm时，将自动供应纯氧。培养24-36小时后，以60ml/h速度补加补加液(补加液由50％葡萄糖，300mM(NH4)2SO4和1倍浓度的微量元素组成)，此阶段共培养24小时；以20ml/h速度加50％萄葡糖，以25ml/h速度加入纯甲醇，此阶段共培养36-48小时，此阶段为诱导AOX1启动子启动，进行γ-干扰素合成。停止培养，收集发酵液。三发酵结果本发明所用菌种的γ-干扰素生物合成，是由该酵母菌所带表达载体上的AOX1基因所调控，由于此基因产物是受甲醇浓度控制的，所以可利用甲醇来控制γ-干扰素的合成。研究发现，该菌先在30℃培养48个小时，然后在1％甲醇中培养48小时，使干扰素基因有较高表达。表3是三批连续发酵的结果。图7-8是三批连续发酵SDS-PAGE电泳图。
表3酵母发酵与γ-干扰素产量培养体菌体 γ-干扰素 总蛋白 干扰素 干扰素占总批号积(升)量(克)总活性(IU)(mg) 粗品(mg)蛋白比例(％)2001-1 3.23 194 8.7×101012554 3326.9 26.52001-2 3.05 213 8.3×101012688 3172.0 25.02001-3 3.58 232 9.3×101015066 3615.8 24.0实施例3人γ-干扰素的纯化一材料和仪器1.液相色谱仪Waters公司的650E高效液相色谱仪。
2.Waters公司的510高效液相色谱仪。
3.Pharmacia公司的Biopilot层析系统。
4.电泳仪Pharmacia公司的Phast System电泳系统。
3.Pharmacia公司的Biopilot层析系统。
4.电泳仪Pharmacia公司的Phast System电泳系统。
5.分光光度计Beckman公司的DU-68型分光光度计。二纯化方法分四步进行。
第一步 阴离子树脂吸附将发酵液离心，收集酵母菌。将此酵母菌通过蒸溜水悬浮-离心操作步骤水洗2次。加入相当于菌体体积量的缓冲液[20mmol/L Tris·Cl，pH7.9；10mmol/L MgCl2；1mmol/L EDTA；5％(v/v)甘油；1mmol/L DTT；0.3mol/L (NH4)2SO4；1×蛋白酶抑制剂混合物]，和相当于菌体体积量的酸洗玻璃珠(450-500μm)，于1-4℃超声破菌；12000rpm(10min)离心取上清液，上清液通过Sepharose DEAE(Fast Flow)树脂，最后用缓冲液(0.8M NaCl，0.1M PB，pH8)洗脱被吸附的γ-干扰素粗品。
第二步凝胶过滤层析将上述干扰素溶液透析除盐后上样，然后以缓冲液(0.1M NH4Ac，0.05％Tween，pH7.0)洗脱，流速为8ml/分，出现两个峰，第二个峰为活性峰，收集之。
第三步阴离子交换柱层析用Pharmacia公司的DEAE Sepharose(FastFlow)装柱，用0.1M NH4Ac，2.5％蔗糖，pH7.0的溶液平衡柱；将上述层析步骤中收集的第二个峰样品上样，在此条件下γ-干扰素不被保留，杂质被保留，收集流出液。
第四步阳离子交换柱层析用Pharmacia公司的CM Sepharose(FastFlow)装柱，将上述收集的流出液上样，γ-干扰素吸附于柱上，然后以A液(20mM NH4Ac，5％蔗糖，pH8)和B液(20mM NH4Ac，5％蔗糖，0.7M NaCl，pH8)组成的离子强度递增溶液洗脱，收集第三个峰，得γ-干扰素纯品。三纯化结果连续三批纯化结果列于表4。
表4从P.pastoris菌体中提取、纯化γ-干扰素的结果纯化步骤批号测定项目 酵母 DEAE Sephacryl DEAECM表达 吸附 S-200 Sepharose Sepharose2001-1 总蛋白(mg)12554 4629 2375 996 524总活性(IU)8.7×10106.8×10104.42×10102.79×10102×1010比活 0.69×1071.47×1072.1×1072.8×1073.82×107纯化倍数 1 2.1 1.4 1.3 1.4得率(％) 100 786563 72总得率％23.02001-2 总蛋白(mg)12688 4433 2095 929 526总活性(IU)8.31×10106.65×10104.19×10102.76×10101.94×1010比活 0.65×1071.50×1072.00×1072.93×1073.69×107纯化倍数 1 2.3 1.3 1.5 1.3得率(％) 100 806366 70总得率％23.32001-3 总蛋白(mg)15066 4685 2457 1010527总活性(IU)9.3×10106.98×10104.67×10102.89×10101.97×1010比活 0.62×1071.49×1071.90×1072.86×1073.74×107纯化倍数 1 2.4 1.3 1.5 1.3得率(％) 100 756762 68总得率％21.2实施例4纯化的人γ-干扰素的检定1.效价测定用微量细胞病变抑制法测定。人羊膜异倍细胞(WISH)为测定细胞，水疱性口炎病毒(VSV)为攻击病毒，以日本参考品校算为国际单位。2.蛋白定量用Lowry法，以中国药品生物制品检定所的标准蛋白作标准测定。3.纯度测定用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，加样5.0μg，同时进行还原和非还原电泳，用银染法染色(图9)，在分光光度计上进行凝胶扫描，其结果见表5。由此看出它们的纯度都在95％以上。做法是作已知蛋白的分子量-泳动距离的标准曲线，再测定纯化产品的泳动距离，从曲线(图10)上查出它们的分子量。表5为三批样品的分子量，这与文献报导的17126接近。
表5 SDS-PAGE电泳测定γ-干扰素的纯度和分子量批号 纯度扫描 分子量2001-1 96.6％171002001-2 97.2％169002001-3 96.4％168005.高效液相色谱分析用Waters 650E高效液相仪，Protein-Pak 200SW柱，分析三批纯化样品，以10mM PB，pH7.0缓冲液为流动相。用归一化法计算结果，得到三批样品的纯度；分别是97.9％，98.5％，97.6％，图谱见图11。6.残余DNA含量测定用[α32p]dCTP标记的Pichia pastoris SMD1163(pPIC3.5K-ifn，his4 pep4△prb1)-181酵母菌全DNA作探针，与纯化的三批样品进行分子杂交，结果见图12，从图可见，每剂纯化的γ-干扰素所含残留DNA量都低于5pg。7.等电聚焦测定等电点范围用Phast System电泳仪，测定了三批样品的等电点范围，测定结果见图13，它们的等电点范围在8.65至8.45之间，符合文献报导γ-干扰素等电点是8.6的结果。8.紫外扫描三批样品用紫外分光光度计在200nm～320nm波长范围进行扫描，在279.5nm处有明显的蛋白吸收峰，在228.5nm附近也有肽链的强吸收峰，结果见图14，这与文献报导一致。9.肽图9.肽图用溴化氰处理γ-干扰素蛋白时，在蛋氨酸处可断裂肽链。γ-干扰素蛋白有4个蛋氨酸，故可产生5个肽段，但在电泳图中(图15)只能看到三条带，这是由于一个9肽已消失，另一个含较多碱性氨基酸，泳动速度与分子量较大的肽段重叠，而HPLC图谱中(图16)可清楚看到5个峰，与理论值一致。10.N-端氨基酸测定用Edman降解法，在ABI公司的470A氨基酸序列分析仪，分析了纯化的γ-干扰素的氨基末端15个氨基酸，其结果见图17，这与文献报导完全一致。11.免疫印渍试验为了证实所纯化的蛋白确实是人γ-干扰素，我们将三批纯化的样品进行了电泳，电泳后的凝胶用Western blotting方法将蛋白转移到硝酸纤维膜上，然后与Boehringer Mannheim公司的人γ-干扰素单克隆抗体作用，最后以Promega公司的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体与之反应，并显色，结果见图18，由此可见这三批样品都显示强阳性反应。12.鉴别试验人γ-干扰素的单克隆抗体能中和人γ-干扰素的活性，由此可鉴别纯化产物是否是人γ-干扰素。实验的做法是，将我们制备的人γ-干扰素和单克隆抗体(Boehringer Mannheim产品)作一系列稀释，然后各取100μl相混合，37℃保温1小时，并测定其效价。结果见图19-20，从图可见随着单抗浓度增加效价也随着降低，而α-干扰素的单克隆抗体无此中和活性，说明我们制备的干扰素的活性是人γ-干扰素活性，不是别的干扰素或其它蛋白质。
(1)一般信息(i)发明名称人γ-干扰素基因在毕赤酵母菌中的高效表达、发酵和纯化(ii)序列数目2(2)序列SEQID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度435bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(iii)序列描述SEQ NO.1ATG CAA GAC CCA TAC GTC AAG GAG GCA GAA AAC TTG AAG AAA TAT TTT AAC GCT GGT CATTCT GAC GTG GCA GAC AAT GGA ACA TTA TTT TTG GGT ATT TTG AAG AAC TGG AAA GAA GAGTCA GAT AGA AAG ATT ATG CAA TCC CAG ATC GTC TCC TTC TAC TTC AAG CTT TTC AAG AACTTC AAA GAT GAT CAA TCC ATC CAA AAA TCC GTT GAG ACA ATC AAA GAG GAT ATG AAT GTCAAG TTC TTT AAC TCT AAT AAG AAG AAG CGT GAT GAC TTT GAG AAG TTG ACC AAT TAC TCAGTT ACA GAC TTG AAT GTC CAA CGT AAG GCA ATC CAC GAG CTG ATT CAA GTG ATG GCA GAACTT TCT CCA GCT GCT AAA ACC GGA AAG AGA AAG AGG TCT CAA ATG TTG TTT AGA GGA AGACGT GCT TCT CAA TAG(3)序列SEQ NO.2的信息(i)序列特征(A)长度144AA(B)类型氨基酸(C)拓朴结构线性(ii)分子类型线性(iii)序列描述SEQ NO.2MQDPYVKEAENLK KYF N AGHSDVADNGTLFLGI LKN W KEESDRKIMQSQIVSF YFK L FKNFKDDQSIQKSVET IKE D MNVKFFNSNKKKRDDF EKL T NYSVTDLNVQRKAIHE LIQ V MAELSPAAKTGKRKRA QML F RGRRASQ
权利要求
1.一种由基因工程菌发酵制备人γ-干扰素的方法其特征在于基因结构如下的人γ-干扰素基因序列，ATG CAA GAC CCA TAC GTC AAG GAG GCA GAA AAC TTG AAG AAA TAT TTT AAC GCT GGT CATM Q D P Y V K E A E N L K K Y F N A G HTCT GAC GTG GCA GAC AAT GGA ACA TTA TTT TTG GGT ATT TTG AAG AAC TGG AAA GAA GAGS D V A D N G T L F L G I L K N W K E ETCA GAT AGA AAG ATT ATG CAA TCC CAG ATC GTC TCC TTC TAC TTC AAG CTT TTC AAG AACS D R K I M Q S Q I V S F Y F K L F K NTTC AAA GAT GAT CAA TCC ATC CAA AAA TCC GTT GAG ACA ATC AAA GAG GAT ATG AAT GTCF K D D Q S I Q K S V E T I K E D M N VAAG TTC TTT AAC TCT AAT AAG AAG AAG CGT GAT GAC TTT GAG AAG TTG ACC AAT TAC TCAK F F N S N K K K R D D F E K L T N Y SGTT ACA GAC TTG AAT GTC CAA CGT AAG GCA ATC CAC GAG CTG ATT CAA GTG ATG GCA GAAV T D L N V Q R K A I H E L I Q V M A ECTT TCT CCA GCT GCT AAA ACC GGA AAG AGA AAG AGG TCT CAA ATG TTG TTT AGA GGA AGAL S P A A K T G K R K R A Q M L F R G RCGT GCT TCT CAA TAGR A S Q Term克隆插入带有甲醇调节型启动子(AOX1)的载体pPIC 3.5K中，获得表达载体pPIC3.5K-ifn，采用蛋白酶缺陷的SMD1163毕赤酵母菌为宿主，用G418抗性浓度递增法筛选多拷贝克隆，得高表达毕赤酵母株PichiaPastoris SMD1163(pPIC 3.5K-ifn，his4 pep4 △prb1)-181(菌种保藏号为CGMCC NO.0758，菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)，经发酵，纯化得人γ-干扰素。
2.根椐权利要求1所述制备人γ-干扰素的方法，其特征在于重组载体pPIC3.5K-ifn含有权利要求1所述的人γ-干扰素基因序列。
3.根椐权利要求1所述制备人γ-干扰素的方法，其特征在于含有权利要求1所述的人γ-干扰素基因序列插入甲醇调节型载体pPIC3.5K中，而获得的表达载体pPIC3.5K-ifn。
4.根椐权利要求1所述制备人γ-干扰素的方法，其特征在于含有权利要求1所述的表达载体pPIC3.5K-ifn，电击转化蛋白酶缺陷的SMD1163毕赤酵母菌所获得的高表达毕赤酵母株Pichia Pastoris SMD1163(pPIC3.5K-ifn，his4 pep4 △prb1)-181。
5.根据权利要求1所述制备人γ-干扰素方法，其特征在于a、采用常规方法将等量24条寡核苷酸片段混合形成引物池，然后按比例混合成PCR反应液，用PCR扩增技术全合成同权利要求1所述完全一样的人γ-干扰素基因序列。b、将上述人γ-干扰素基因序列克隆导入带有甲醇调节型启动子AOX1的表达载体pPIC3.5K中，线性化后电击转化蛋白酶缺陷的SMD1163毕赤酵母菌，用G418抗性浓度递增法筛选多拷贝克隆得高表达毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1163(pPIC3.5K-ifn，his4 pep4 △prb1)-181；c、上述所得高表达的毕赤酵母株在不含甲醇的培养基YPD、YPB、BMGY中于28-30℃培养48小时，再在含0.5-1.5％的甲醇的诱导培养基培养36-48小时；d、培养液离心得菌体；菌体裂解后的上清液经DEAE Sepharose凝胶吸附，再经Sephacryl S-200分子筛层析，然后用DEAE Sepharose阴离子交换层析，最后经CM-Sepharose阳离子交换层析，得纯化产品；
6.根椐权利要求5所述制备人γ-干扰素的方法，其特征在于构建的pPIC3.5K-ifn表达载体能在蛋白酶缺陷的甲醇利用型酵母株Pichiapastoris SMD1163(his4 pep4 △prb1)中高效表达；
7.根椐权利要求5所述制备人γ-干扰素的方法，其特征在于毕赤酵母株先在不含甲醇的培养基YPD、YPB和BMGY中于28-30℃培养48-72小时，再在含有0.5-1.5％的甲醇诱导培养基培养36-48小时；
8.根椐权利要求5所述制备人γ-干扰素的方法，其特征在于将发酵液离心，收集酵母菌；加入酸洗玻璃珠至此菌体中，超声破菌；离心取上清液，经DEAE Sepharose凝胶吸附，Sephacryl S-200分子筛层析，DEAE Sepharose阴离子交换层析，CM-Sepharose阳离子交换层析，得纯化产品。
全文摘要
设计并人工合成了特别适合于毕赤酵母菌(Pichiapastoris)中表达的人γ－干扰素的基因序列，构建了胞内表达人γ－干扰素蛋白的载体pPIC 3.5K－ifn，采用蛋白酶缺陷的SMD1163毕赤酵母菌(Pichia pastoris)为宿主菌，用G418抗性浓度递增法筛选多拷贝克隆，得高表达克隆株PichiapastorisSMD 1163(pPIC 3.5K－ifn，his4 pep4 Δprb1)－181.该菌在28－30℃不含甲醇的培养基培养48小时，再在含1％的甲醇的诱导培养基培养36－48小时，γ－干扰素表达量可达菌体总蛋白的25％。每升含γ－干扰素初品约为1克左右。经DEAE－Sepharose凝胶吸附，Sephacryl S－200分子筛层析，DEAE－Sepharose阴离子交换层析，CM－Sepharose阳离子交换层析，得纯度为97.5％以上(HPLC)的人γ－干扰素蛋白。
文档编号C12N15/81GK1468953SQ0213685
公开日2004年1月21日 申请日期2002年9月6日 优先权日2002年9月6日
发明者陈国富 申请人:上海擎天生物制药技术开发有限公司