一种新型乳糖酶的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新型乳糖酶的制备方法及其应用，属于基因工程领域。具体的说 涉及比活高、稳定性好的新型乳糖酶的获得，此新型乳糖酶核苷酸序列依据毕赤酵母密码 子偏爱性的优化，包含乳糖酶核苷酸序列的组成型表达载体及重组毕赤酵母菌株的构建， 利用此重组酵母高密度发酵制备乳糖酶的方法，还涉及此新型乳糖酶在低乳糖牛奶制备中 的应用。
【背景技术】
[0002] 乳糖是由半乳糖和葡萄糖通过0-1，4-糖苷键连接而成的二糖。世界上约70% 的人种，尤其是亚洲人，患有"乳糖不耐受症"，主要表现为肠鸣、腹泻及肠梗塞和胀气等。 这是由于体内缺乏能降解乳糖的酶类，进入肠道的乳糖就成为微生物菌群的能源，从而导 致形成乳酸和二氧化碳。通过口服乳糖酶或将乳糖酶添加至乳制品中可以解决以上问 题。乳糖酶即0_半乳糖苷酶（0 _D-galactosedase, EC3. 2. 1. 23.)，是一种0半乳糖 苷半乳糖水解酶，能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，此外亦具有半乳糖苷转移作用。商品 化的乳糖酶主要用于治疗乳糖不耐受症、处理牛乳和乳清、生产低乳糖牛奶和低乳糖乳制 品及制备低聚半乳糖等领域。自然界中的乳糖酶广泛存在于幼小哺乳动物小肠，植物如扁 桃、杏等，微生物如细菌、酵母和霉菌等。食品工业中应用的乳糖酶主要源于克鲁维氏酵母 (Kliyveromyces sp.)和曲霉属（Aspergillus sp.)。克鲁维氏酵母乳糖酶多为胞内酶，最 适pH接近中性（pH6. 2~7. 0)，最适温度35~40°C，但热稳定性比较差。曲霉属乳糖酶多 为胞外酶，最适作用温度为50°C或更高，最适pH3. 5~4.0,热稳定性好及作用pH低等优 点，使曲霉乳糖酶在食品工业上具有更高的应用价值。
[0003]目前乳糖酶工业化生产中存在的难题主要表现在胞内酶提取困难和产量低这两 方面。在克鲁维氏酵母发酵产酶过程中，通过优化发酵条件能提高产酶量，但是其发酵通常 以乳糖作为主要碳源和诱导剂，而乳糖相对其他碳源价格偏高，另外胞内酶的存在形式也 不利于产品的获取。因此，国内外的研究均倾向于构建基因工程菌株的方式来生产和制备 乳糖酶产品。Berka等人将来自A.oryzae CCC28的乳糖酶基因导入其来源菌株构建得到 的米曲霉基因工程菌株，乳糖酶基因受GalA启动子控制，发酵液中酶活提高至500U/ml，蛋 白表达量为lg/L。张伟等(壳白曲霉乳糖酶基因在毕赤酵母中的商效分泌表达及酶学性质 研究，微生物学报，2005)将来自于A. candidus CGMCC3. 2919的乳糖酶基因导入毕赤酵母 GS115基因组中，利用醇氧化酶启动子Paoxl启动该基因的表达，发酵液中乳糖酶产量约为 6g/L，酶活力达3600U/ml，是目前国内外获得的乳糖酶的最高产量。但是该酶表达使用的 Paoxl启动子属于甲醇诱导型启动子，需要在发酵过程中加入大量的甲醇，其毒性不利于食 品安全，从而限制了重组蛋白在食品工业中的应用。
[0004] 在不同的原核、真核异源表达系统中，毕赤酵母表达系统具有其它表达系统所不 可比拟的优点，除了具有甲醇诱导型启动子-醇氧化酶A0X1基因启动子用于严格调控外 源蛋白的表达外，还具有另一个组成型的强启动子-甘油醛三磷酸脱氢酶启动子GAP，可在 菌体生长过程中组成型表达外源蛋白。另外，外源基因随染色体复制进行整合型表达，稳 定性高；菌体生长速度快，培养基成本低廉，易于进行高密度发酵；易于进行遗传操作和培 养，具有真核生物的转录后调控机制，如蛋白酶加工、折叠、二硫键的形成和糖基化，可获得 _广量的蛋白质。
[0005] 综上所述，寻求一种提取工艺简单、高产且具有食品安全性的生产方式仍然是目 前乳糖酶研究的重要方向。本发明将高效组成型启动子GAP与乳糖酶基因连接，构建包含 乳糖酶的重组毕赤酵母菌株，并利用该重组酵母高密度发酵制备乳糖酶，既能解决传统的 胞内乳糖酶提取困难和产量低的问题，又可避免利用甲醇诱导毕赤酵母大规模发酵而造成 的甲醇污染和毒性隐患，有利于食品、医药及工业化乳糖酶的大规模生产与制备。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一在于为了改善米曲霉乳糖酶比活低、稳定性差等缺点，提供一 种高活性、高热稳定性的新型乳糖酶，其氨基酸序列为含有序列号1的氨基酸序列。
[0007] 本发明的目的之二在于为了利于新型乳糖酶在毕赤酵母中的表达，提供一段依据 毕赤酵母密码子偏爱性优化得到的乳糖酶核苷酸序列，此核苷酸序列为含有序列号2的核 苷酸序列。
[0008] 本发明的目的之三在于为了解决乳糖酶生产中的胞内酶提取困难的问题，提供一 种用于分泌制备新型乳糖酶的重组毕赤酵母菌株。
[0009] 本发明的目的之四在于为了提高乳糖酶的工业化产量，提供一种用于制备乳糖酶 的重组酵母高密度发酵方法。
[0010] 本发明的目的之五在于为了满足乳糖酶在食品中的应用，而提供一种低乳糖牛奶 的制备工艺。
[0011] 本发明的上述目的通过以下技术方案达到：首先构建米曲霉乳糖酶成熟肽编码序 列随机突变体库，并筛选比活高、稳定性好的酶蛋白突变体，测序确定突变位点，然后将突 变序列按照毕赤酵母密码子偏爱性进行优化，构建用于表达乳糖酶的组成型表达载体，及 用于制备乳糖酶的重组毕赤酵母菌株，利用该重组酵母的高密度发酵制备此新型乳糖酶。 最后利用此新型乳糖酶水解牛奶中的乳糖，确定制备低乳糖牛奶的方法。
[0012] 本发明采用易错PCR方法构建序列号3所示米曲霉乳糖酶成熟肽编码序列随机突 变体库，利用毕赤酵母表达系统表达突变体蛋白，从中筛选比活高、稳定性好的突变株，测 序确定突变位点，对应的氨基酸突变为：231位丝氨酸突变为甘氨酸，401位异亮氨酸突变 为甲硫氨酸，970位天冬酰胺突变为天冬氨酸。
[0013] 本发明将序列号3所示的核苷酸序列进行相应突变后按照毕赤酵母密码子偏爱 性优化得到含有序列号2的核苷酸序列。
[0014] 将含有序列号2的核苷酸序列与组成型质粒pGAPZaA进行可操作性连接，将该 序列连入组成型启动子GAP下游，构建得到包含乳糖酶基因序列的重组表达载体，命名为 pGAPZaA-lac。
[0015] 本发明采用电穿孔的方法将包含乳糖酶核苷酸序列的组成型表达载体 pGAPZaA-lac整合入毕赤酵母SMD1168H菌株的基因组上，利用抗生素筛选得到包含乳糖 酶基因的重组毕赤酵母菌株。所得重组毕赤酵母菌株命名为毕赤酵母（Pichia pastoris) SMD1168H-pGAPZaA-lac，已于2013年10月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101)保藏，分类命名为毕赤酵母（Pichia pastoris)，保藏号CGMCC No. 8349。
[0016] 本发明利用上述重组酵母制备乳糖酶的高密度发酵工艺包括：将重组酵母接种培 养，然后按5%~10%的接种量接入含3%~6%葡萄糖的发酵基础盐培养基中；通气搅拌培 养，并在整个发酵过程中氧饱和度不低于20% ;培养15~18h至葡萄糖完全耗尽后，按照 12~18mV (h?L)的流量流加40%~80%葡萄糖：10%~50%甘油：0? 05%~0? 3%磷酸氢 二铵=1~4:1~4:0. 005~0. 05的混合溶液，继续培养30h以上。
[0017] 本发明采用新型乳糖酶制备低乳糖牛奶的方法包括：按l〇U/ml牛奶的添加量 60°C水解24h，或37°C水解48h;按30U/ml牛奶的添加量，25°C水解48h，或KTC水解108h。
[0018] 本发明由米曲霉乳糖酶改造得到的新型乳糖酶具有如下优点：
[0019] (1)新型乳糖酶比活由480U/mg提高至700U/mg，pH作用范围由4~7增宽至3~ 7;最适作用温度由55°C提高至60°C ;60°C保温30min由完全失活提高到残余酶活75%，更 适于乳品行业的应用；
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