一种蓝耳病疫苗抗原纯化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制品技术领域，具体地涉及一种蓝耳病疫苗抗原纯化的方法。
【背景技术】
[0002] 在我国，蓝耳病（猪繁殖与呼吸综合征病）疫苗的抗原由病毒接种细胞直接培养 得到，没有后续的抗原下游处理工艺，该生产工艺生产的抗原杂质较多，导致疫苗的免疫副 反应大，产品质量不稳定，影响疫苗免疫效果。近年来也有企业、学者在蓝耳病疫苗抗原下 游加工处理方面进行了研宄。唐艳玲等在2013年采用分子筛层析柱对蓝耳病灭活疫苗抗 原进行纯化，蛋白去除率达到96%，病毒回收率在76. 7%~82. 4%之间。该方法可有效的 去除抗原杂蛋白，但填充介质需要人工进行，受操作者的因素影响较大，工艺的可重复性较 差，且该方法成本较高，不适用于当前的疫苗生产。
[0003] 蓝耳病疫苗抗原通常来自于蓝耳病病毒感染细胞后进行细胞培养、获得的细胞培 养的裂解产物，其中含有大量大小不等的细胞裂解碎片，成分较为复杂，因此纯化蓝耳病疫 苗抗原的条件和方法较利用鸡胚生产的疫苗抗原的纯化方法更为复杂，需要对其纯化方法 进行更进一步的研宄和优化，以获得更高的抗原回收率。
【发明内容】
[0004] 为克服上述缺陷，本发明的目的是提供一种工序简单、利于操作、成本低廉的蓝耳 病疫苗抗原纯化的方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明利用分子量切割的超滤技术对蓝耳病疫苗抗原进行纯 化，该方法包括如下步骤：
[0006] (1)将收获的蓝耳病疫苗抗原经离心机离心澄清，收取澄清的抗原液；
[0007] (2)将步骤（1)得到的澄清抗原液泵入超滤系统进行纯化；
[0008] (3)用缓冲液将步骤（2)中纯化得到的抗原液稀释至原体积继续纯化；
[0009] (4)用缓冲液将步骤（3)中纯化得到的抗原液稀释至原体积继续纯化后，收获纯 化的蓝耳病疫苗抗原。
[0010] 本发明提供的对蓝耳病疫苗抗原进行纯化的方法中，步骤（1)所述的蓝耳病疫苗 抗原为经灭活剂灭活后的蓝耳病灭活疫苗抗原或蓝耳病活疫苗抗原。
[0011] 其中，步骤⑴采用差速离心的方法。
[0012] 所述差速离心为先采用4000-7000rpm离心20-40min，取上清弃沉淀，然后将上清 液以8000-12000rpm离心50_70min，取上清备用。
[0013] 优选地，所述差速离心为先采用6000rpm离心30min，取上清弃沉淀，然后将上清 液以lOOOOrpm离心60min，取上清备用。
[0014] 本发明提供的对蓝耳病疫苗抗原进行纯化的方法中，步骤（2)中超滤系统为切向 流超滤系统。
[0015] 所述切向流超滤系统为平板式切向流超滤系统。
[0016] 进一步地，切向流超滤系统膜包的分子量大小为100-500KD。
[0017] 优选地，切向流超滤系统膜包的分子量大小为300KD。
[0018] 其中，步骤（2)和步骤（3)中抗原液在超滤系统中进行纯化的同时需要将抗原液 浓缩至原体积1/10以上，收取回流液，弃去透过液。
[0019] 本发明方法中，所述的缓冲液为0. 01M pH值7. 2-7. 4的PBS缓冲液。
[0020] 抗原液泵入超滤系统进行纯化时，抗原液进入超滤膜包的流速不超过0. 8ml/min/ cm2。
[0021] 本发明的有益效果：本发明提供了蓝耳病疫苗抗原纯化的方法，为提高我国蓝耳 病疫苗质量提供新技术。该技术操作简单，可操作性强，工艺稳定，受人为因素影响较小，可 重复性强。纯化的疫苗抗原蛋白去除率达到90%以上，抗原回收率达到100%。在蓝耳病 疫苗生产中具有明显的优势和巨大的应用价值，对于降低蓝耳病疫苗的免疫副反应以及提 高疫苗产品质量具有积极的意义。
【具体实施方式】
[0022] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0023] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0024] 实施例1蓝耳病活疫苗抗原纯化
[0025] (1)将收获的蓝耳病活疫苗抗原先采用6000rpm离心30min，取上清弃沉淀，然后 将上清液以l〇〇〇〇rpm离心60min，取上清备用；
[0026] (2)将离心澄清后的抗原泵入分子量大小为300KD的切向流超滤系统进行纯化， 进液速率为〇. 4ml/min/cm2,同时浓缩至原体积的1/10,弃去透过液，保留回流液；
[0027] (3)用无菌的PBS缓冲溶液将抗原浓缩液稀释至原体积，继续泵入超滤膜包进行 纯化并将抗原液浓缩至原体积的1/10,进液速率为0. 4ml/min/cm2;所述PBS溶液pH值为 7.2，浓度为0.01111〇1/1;
[0028] (4)用无菌的PBS缓冲溶液（pH值为7. 2,浓度为0.0 lmol/L)将抗原浓缩液稀释 至原体积，继续泵入超滤膜包进行纯化并浓缩至原体积1/10,进液速率为0. 4ml/min/cm2， 用PBS缓冲溶液稀释至原体积，即可收获纯化后的蓝耳病活疫苗抗原。
[0029] (5)将纯化前后的蓝耳病活疫苗抗原进行10倍系列稀释后，接种96孔培养的单层 Marcl45细胞，每孔100 y 1，培养96小时，测定TCID5(I。根据纯化前后抗原TCID5(I的大小计 算抗原回收率，结果见表1。
[0030] (6)用Lowry法测定纯化前后总蛋白浓度，计算蛋白去除率，结果见表1。
[0031] 表1蓝耳病活疫苗抗原纯化结果
[0032]
【主权项】
1. 一种蓝耳病疫苗抗原纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 将收获的蓝耳病疫苗抗原经离心机离心澄清，收取澄清的抗原液； (2) 将步骤（1)得到的澄清抗原液泵入超滤系统进行纯化； (3) 用缓冲液将步骤（2)中纯化得到的抗原液稀释至原体积继续纯化； (4) 用缓冲液将步骤（3)中纯化得到的抗原液稀释至原体积继续纯化后，收获纯化的 蓝耳病疫苗抗原。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)所述的蓝耳病疫苗抗原为经灭活 剂灭活后的蓝耳病灭活疫苗抗原或蓝耳病活疫苗抗原。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)采用差速离心的方法。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述差速离心为先采用4000-7000rpm离 心20-40min，取上清弃沉淀，然后将上清液以8000-12000rpm离心50-70min，取上清备用。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)中超滤系统为切向流超滤系统。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，切向流超滤系统膜包的分子量大小为 100-500KD。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，切向流超滤系统膜包的分子量大小为 300KD。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)和步骤（3)中抗原液在超滤系统 中进行纯化的同时需要将抗原液浓缩至原体积1/10以上，收取回流液，弃去透过液。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为0. 01M pH值7. 2-7. 4的PBS 缓冲液。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)中抗原液泵入超滤系统进行纯 化时，抗原液循环进入超滤膜包的流速不超过0. 8ml/min/cm2。
【专利摘要】本发明涉及一种蓝耳病疫苗抗原纯化的方法，属于生物制品制备技术领域。该纯化方法包括如下步骤：(1)将收获的蓝耳病疫苗抗原离心澄清；(2)将步骤(1)得到的澄清抗原泵入超滤系统中进行纯化；(3)用缓冲液将步骤(2)中纯化得到的抗原液稀释至原体积继续纯化；(4)用缓冲液将步骤(3)中纯化得到的抗原液稀释至原体积继续纯化一段时间后，收获纯化的蓝耳病疫苗抗原。该方法对于降低蓝耳病疫苗的免疫副反应以及提高疫苗产品质量具有积极的意义。
【IPC分类】C12N7-04
【公开号】CN104673761
【申请号】CN201510056212
【发明人】黄文强, 丁锦茂, 潘德春, 杨君敬, 吴宗学, 王贺民
【申请人】乾元浩生物股份有限公司
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月3日