高致病性猪蓝耳病病毒重组质粒和遗传工程疫苗的制作方法

专利名称：：高致病性猪蓝耳病病毒重组质粒和遗传工程疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种病毒的重组质粒和遗传工程疫苗，更具体地说，涉及一种高致病性猪蓝耳病病毒重组质粒和遗传工程疫苗。
背景技术：
：猪繁殖与呼吸综合征(PorcineR印roductiveandRespiratorySyndrome,PRRS),又称蓝耳病，是一种由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)引起的高度接触性传染病。PRRSV基因组为大小约15kb、不分节段的单股正链RNA。由于RNA病毒易于发生遗传及抗原突变，近年来在世界各地出现了致病力增强的PRRSV变异株，另外，因为PRRSV靶细胞为免疫系统重要成员之一的肺泡巨噬细胞，感染猪大多呈现免疫抑制而致继发感染和混合感染。为了更深入的了解PRRSV的生物学特性和不断变化的现状，最有效的方法之一就是利用反向遗传操作系统对其基因组结构和生物学特性进行相应的研究，从而获取其结构与基因的直接证据。早在1998年Meulenberg就成功构建起欧洲株LV(LelystadVirus)的重组质粒，而后世界各国的科学家也纷纷构建起不同病毒株的重组质粒，而且试验证据也在不断证明，拯救出来的病毒一般都具有与野毒株相类似的生物学特性，但是这些野毒株和构建的重组质粒大多属于经典PRRSV株，感染率和致死率均不高，不能有效区分强毒株与弱毒株对动物体致病力的差异。2006年5月以来，中国爆发了高致病性PRRSV引发的所谓"猪高热综合征"，该病以传播迅猛、高致死率为特征，死亡率竟然高达80%-100%。尤其令人吃惊的是，高致病性PRRSV与典型株不同，表现于不仅仅感染仔猪死亡率可达100%，而且77日龄成年感染猪死亡率也高达57%。因此，很有必要构建出高致病性病毒重组质粒株，以便于对高致病性的PRRSV的生物学特性进行研究，同时，开发新型高效的蓝耳病疫苗也成为当务之急。但是，由于PRRSV基因组很长，是大小约15kb、不分节段的单链正股RNA，编码至少9个开放阅读框(ORF)，而且这些阅读框两两之间具有重叠区域，因此阅读框中的一个碱基的变化就有可能会影响整个基因组的结构从而导致整个全长质粒不具备感染性；此外，因为RNA病毒自身的特点，其基因组并不稳定，因此，利用传统的方法，很难从cDNA直接获得全长重组质粒，从而成为开发新型高效的蓝耳病疫苗的工作的瓶颈。PRRSV结构蛋白构成外观圆形有囊膜的病毒颗粒，其中，0RF5、0RF6和0RF7所编码的产物为病毒蛋白必需蛋白，而其他糖蛋白GP2、GP3、GP4等在病毒颗粒组装乃至激发机体内免疫过程中的作用还存在争议。GP5被认为是病毒的细胞结合蛋白，同时也是刺激机体产生中和抗体的主要蛋白，核衣壳蛋白N是免疫原性最强的蛋白，因此，针对这些在病毒感染过程中与激发机体免疫极其相关的这些蛋白，开发猪繁殖与呼吸综合征疫苗成为可能。另一方面，不同病毒株间遗传及抗原差异很大，如何提高疫苗毒株的交叉保护性以及研制针对目前优势流行株的高效疫苗是亟待解决的问题。利用反向遗传操作技术可以构建不同毒株间的嵌合病毒，使其具备多种病毒的免疫学特性；另外，这种嵌合疫苗是在基因水平上按照理想设计改造病原体，即将两种或多种相似的病原体的基因组或片段用基因工程的方法以不同形式连接或置换，从而可以得到减毒活疫苗。因此，利用嵌合疫苗开发新型高效的猪繁殖与呼吸综合征疫苗具有可行性。
发明内容本发明的目的在于，提供一种高致病性猪蓝耳病病毒重组质粒的构建方法。本发明还有一个目的在于，提供一种高致病性蓝耳病的遗传工程活疫苗。本发明还有一个目的在于，提供一种高致病性蓝耳病的遗传工程活疫苗的构建方法。本发明的从病毒cDNA获得高致病性蓝耳病病毒的重组质粒的方法，为根据蓝耳病病毒相对保守区的序列设计多对引物对，利用高致病性猪蓝耳病病毒cDNA为模板，分段扩增蓝耳病病毒基因序列，然后将扩增出的序列依次连接到合适的载体，从而获得了一种高致病性蓝耳病病毒重组质粒。本发明的高致病性蓝耳病的遗传工程活疫苗，是编码结构蛋白的序列和3'UTR基因被所述重组质粒的相应的编码结构蛋白的序列以及3'UTR基因所替代的弱毒疫苗株。本发明的高致病性蓝耳病的遗传工程活疫苗的构建方法包括以下步骤首先扩增出重组质粒的结构蛋白基因；然后将扩增出的结构蛋白基因和弱毒疫苗株进行酶切，最后将酶切后的结构蛋白基因和弱毒疫苗株进行连接，并转化T0P10，然后通过筛选获得遗传工程活疫苗，从而提供了相应的构建方法。使用本发明的重组质粒构建方法，可以将基于发病猪场获得的血清中分离出来的病毒构建成全长感染性cDNA质粒pJX143，该病毒及其拯救出来的病毒具有和野生亲本毒相似的生物学特性和动物宿主的感染力和致死率。而且后续的试验证实，该重组质粒确实是引起这次"猪无名高热"的主要致病病原。同时，基于上述重组质粒，构建的一株疫苗株pSX12对猪体具有较好安全性，免疫后可有效诱导产生机体免疫，并提供猪体免疫保护作用，对"猪高致病性蓝耳病"的免疫保护率高达100%，安全有效。图1是不同PRRS-F/PRRS-R引物对扩增PRRSV全基因组序列PCR产物电泳检测结果，其中，泳道l为由引物SF1392和SR6589获得的长度约为5kb的PCR片段，泳道2为由引物SF4344和SR9033获得的长度约为5kb的PCR片段，泳道3为由引物SF7682和SR13334获得的长度约为5.5kb的PCR片段，泳道4为引物STL和SR2573获得的长度约为2.5kb的PCR片段，泳道5为由引物SF11422和Qst获得的长度约为2.5kb的PCR片段。图2是PRRSV基因组全长cDNA质粒构建策略示意图。图3是全基因组质粒构建示意图。图4是用重组质粒转染细胞后出现的细胞病变结果。图5是拯救病毒的N蛋白免疫荧光照片，其中，A是被拯救病毒vJX143的N蛋白免疫荧光照片；B是被拯救病毒vJX143-M的N蛋白免疫荧光照片；C为阴性对照。图6是对照弱毒株、拯救病毒株与野毒株病毒滴度比较结果。图7是拯救病毒株、野毒株和阴性对照对猪的体温影响的结果。图8是嵌合质粒构建示意图。图9是嵌合病毒构建过程中结构蛋白扩增的电泳结果。图10是Smal酶切嵌合质粒pSX12、p5NX12和p56N12的电泳结果，其中，泳道1是Smal酶切的pSX12，泳道2是Smal酶切的p5NX12，泳道3是Smal酶切的p56N12，泳道4是Smal酶切的阳性对照pAPRRS。图11是试验及对照组猪在PRRSVSX12株病毒接种及PRRSVJX143株病毒攻毒后每天体温变化。图12是在vSX12株病毒接种后第0，3，5，7，10，14，21，28天抗体变化图。具体实施例方式在本发明中，所述猪蓝耳病病毒或猪繁殖与呼吸综合征病毒株指的是，猪繁殖与呼吸综合征病毒vJX143株。在本发明中，所述重组质粒指的是，利用反向遗传操作技术，由上述野毒株获得的cDNA质粒pJX143。在本发明中，所述嵌合病毒指的是，利用基因嵌合技术获得的全长重组质粒pSX12、p5NX12和p56N12。在本发明中，所述的反向遗传操作指的是相对于经典遗传学而言的，是在获得高致病性蓝耳病基因组全部序列(JX143)的基础上，通过对病毒基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等，再按组成顺序构建全长病毒基因组，让其装配出具有生物活性的病毒粒子，研究高致病性蓝耳病基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对病毒的表型、性状有何种影响等方面的内容。在本发明中，所述北美株和欧洲株代表株指的分别是，北美株经典毒株VR2332(Genbankaccession抑Q217415)和欧洲株经典毒株LV(Genbankaccession棚96262)。在本发明中，所述弱病毒株pAPRRS指的是，参考文献孙志，王金勇，张建武，秦爱健，袁世山，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒3'UTR的反向遗传操作.微生物学报[J]，2007，47(5):774-778.的方法，利用系列传代获得的一株弱毒株的感染性克隆。以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验室手册》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件进行。在本发明的实施例中，使用的病毒和细胞Marc-145细胞(美国细胞保藏中心ATCC，保存号为CRL-2378.1);高致病性的PRRSV病毒vJX143株(中国普通微生物保藏管理中心保存号为CGMCCNo.1964)，利用其感染正常猪仔710天后取血清待用。在本发明的实施例中，使用的质粒与菌株:pBlueScript1ISK(+)载体购自Invitrogen公司，pBS-T载体、T0P10感受态细胞购自TIANGENE公司。在本发明的实施例中，使用的其他试剂QIAampViralRNAMiniKit购自QIAGENE公司，DNA胶回收试剂盒和QuantReverseTranscriptase购自TIANGENE公司，rTaqDNA聚合酶，dNTP和限制性内切酶购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，DMRIE-C转染试剂购自Invitrogen公司，Opti-MEM购自Invitrogen公司。在本发明的实施例中，Marc-145单层细胞采用以下方法制备Marc-145细胞在含有6%FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍后加入维持液(2%FBS的DMEM)培养基，37°C5%0)2培养箱中培养。在本发明的实施例中，细胞回归试验过程如下利用试验猪体内各组织脏器的病料研磨匀浆上清感染单层Marc-145细胞，然后进行传代，以观察是否可以出现细胞病变，如出现，则证明猪体内各组织脏器中含有具有生物活性的病毒粒子。实施例l、高致病性蓝耳病病毒重组质粒的构建根据GenBank登录号为EF488048的高致病性蓝耳病病毒基因JX143的碱基序列，设计出5对引物，分别作为PCR扩增的引物；然后将从使用PRRSV病毒vJX143株感染的猪仔的血清中提取高致病性病毒RNA，反转录合成为野毒株cDNA，以其作为PCR的模板，进行PCR扩增，获得野毒株cDNA的5条特异性片段l-5，并将第5条特异性片段进行突变，获得特异性片段5';然后将特异性片段l一5或特异性片段l一4+5'依次插入到pBlueScriptIISK(+)载体中，构建获得重组质粒pJX143和pJX143-M，过程如图3所示，然后分别通过细胞实验和动物体实验，验证了获得的重组质粒具有高致病性，具体过程如下1.1、引物设计根据GenBank登录号为EF488048的JX143碱基序列，设计在PRRSV基因组中的相对保守区引物，分别命名为STL，SF1392,SR2573,SF4344,SR6589,SF7682，SR9033，SF11422，SR13334和Qst，其中，STL和SR2573，SF1392和SR6589,SF4344和SR9033,SF7682和SR13334，SF11422和Qst分别构成相应的引物对，其序列分别如下所示-ACATGCATGCTAATACGACTCACTATAGGTATGACGTATAGGTGTTGGC-3'-GCCGCGCTTTGCCCGTTCGT-3'-CTGCCCAGGCCATCATGTCCGAAGTC-3'-GCCCCGTCGGTCTCAGTCTTGCCATTTTT-3'-ACCGAGGCTGTAAAAGGCAAGTGACC-3'-CTTTCCGTTGAGCAGGCCCTTGGTATGA-3'-GGCGGCAAACCAGCGGACAA-3'-TTTATAAGGCCACTGCCACC-3'STL:5，SF1392:5，SR2573:5,SF4344:5，SR6589:5，SF7682:5，SR9033:5，SF11422:5，SR13334:5，Qst:5，1.2、高致病性病毒重组质粒的构建1.2.1、血清样品中病毒RNA的提取使用vJX143株感染仔猪，然后取发病猪的血清样品140u1，参照QIAampViralRNAMiniKit中病毒细胞培养上清的方法，提取病毒的RNA。1.2.2、高致病性病毒cDNA的合成取上述获得的病毒RNA12.5"1，加入dNTP(2.5mM)4u1，lOXBuffer2ul，Qst反转录弓l物(10mM)0.5yl，QuantReverseTranscriptase(购自Invitrogen公司)1wl,混合均匀后置37t:水浴1小时，获得高致病性病毒cDNA。1.2.3、高致病性病毒cDNA片段的PCR扩增以上述合成的cDNA为模板，每次以一对实施例1.1中相应的上下游引物对作为引物，分别进行PCR扩增，其反应体系如下cDNA模板lul，上下游引物对(10uM)各lul,lOXBuffer2ul，2.5mMdNTP2ul，rTaqDNA聚合酶5units,加水至20u1。PCR反应完成后，将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图l所示，根据图l的结果，分别获得了大小为2.5Kb、2.5Kb、5.1Kb、5.3Kb、5.2Kb的目的条带。然后参照说明书，使用胶回收试剂盒回收目的片段，获得5条特异性片段，然后对上述5条特异性片段测序，其序列分别如SEQIDNO:1-5所示。1.2.4、特异性片断的克隆将上步获得的各特异性片断，参照pBS-TMiniKit(TIANGEN公司)中片段连接的方法，分别克隆到pBS-T载体中，通过蓝白斑筛选及其琼脂糖凝胶电泳，获得重组质粒，分别命名为pBS-INKpBS-IN2、pBS-IN3、pBS-IN4、pBS-IN5。获得的5个重组质粒经测序验证，克隆进去的5条特异性片段正确。1.2.5、病毒全长cDNA重组质粒的构建利用生物医学软件DNASTAR(http:〃enfu11.com/china/Profession/{E37D28C4-9991-4AA1-B76A-016A046CD62D}.htm)，对pBS-INl、pBS-IN2、pBS_IN3、pBS-IN4、pBS-IN5中目的片段的重叠区域进行分析后，选取合适的酶切位点(分别为SphI、Mfel、AflII、Agel、AscI和NotI)进行酶切，如图2所示，使用Sphl和Mfel双酶切pBS-IN1，Mfel和AflII双酶切pBS-IN2，AflII和Agel双酶切pBS-IN3，Agel和Ascl双酶切pBS-IN4，Ascl和Notl双酶切pBS-IN5，然后将上述酶切后的片段按照pBS-INlpBS-IN5的顺序依次插入到经相同酶切的pBlueScriptIISK(+)载体中，构建成为全长重组质粒。获得的全长重组质粒用BamHI鉴定，出现了预期大小的片断，然后将该片段测序，结果显示序列如SEQIDNO:6所示，表明重组质粒构建成功。同时，还将pBS-IN5上的特异性片段(即SEQIDN0:5)上对应全长的第14680位的碱基A突变为G，获得pBS-IN5-M片段，然后采用上述相同的方法，将pBS-IN5-M替代pBS-IN5片段插入到pBlueScriptIISK(+)载体中，构建了重组质粒pBLJX-5-M。1.3、病毒RNA的制备1.3.1、质粒的NotI线性化于37°C，用NotI分别对质粒pBLJX-5和pBLJX_5-M进行线性化酶切(反应体系为突变质粒30pL，2pL，ddH2013pL，10xNEBBuffer25pL)，酶切过夜。参考说明书的方法，用QIAquickPCRPurificationKit纯化酶切产物，分别获得纯化的线性化质粒。1.3.2、体外转录参考说明书的方法，使用T7mMESSAGEHighYieldCa卯edRNATranscriptionKit(购自Ambion公司)体外转录纯化后的线性化质粒，并采用RNA电泳鉴定，根据鉴定结果，获得了vJX143和VJX143-MRNA。1.4、高致病性蓝耳病病毒重组质粒的检测1.4.1、RNA的转染接种Marc-145细胞(罗猴肾细胞系，购自美国ATCC)于六孔板中培养，待细胞密度为80-90%时，向每孔中分别加入2ii1vJX143和vJX143-MRNA和2u1DMRIE-C转染i式剂，在lml的Opti-MEM中振荡混匀，然后根据转染试剂说明书的方法，转染Marc-145细胞，并且逐日观察细胞病变。待出现如图4所示的细胞病变(CPE)后，收取上清并传代，上清收取及传代过程具体如下Marc-145细胞在含有6%FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍，吸取转染过后五天的上清液，将其与维持液(含2%FBS的DMEM)按照1:10的比例接种上清液200^1，置37'C继续培养并采用上述方法继续传代，并收取第五代的病毒上清，然后按照QIAGEN公司RNA提取试剂盒中的操作方法提取上清病毒RNA，获得病毒vJX143和vJX143-M。根据上述结果，获得的重组质粒pJX143和pJX143-M具有感染性，能够从单一的基因组序列成功转变为具有活性的病毒粒子并具有相应的病毒感染性。1.4.2、间接免疫荧光检测按照实施例1.4.1中的RNA转染步骤，分别以纯化后1000倍稀释的病毒vJX143和vJX143-M，感染单层Marc-145细胞，然后于感染36h后弃去培养基，用冰甲醇固定lOmin，1XBSA室温封闭30rain，PRRSV核衣壳蛋白的特异性单抗(1:800稀释)室温孵育2h，再加入FITC标记的羊抗鼠的二抗室温孵育lh，PBS洗五遍后，在荧光显微镜下观察，结果如图5所示。根据图5的结果pJX143和pJX143-M于转染后第5天出现了明显的CPE，以无限稀释法传代纯化嵌合病毒vJX143和vJX143-M，并且以间接免疫荧光分别检测感染嵌合病毒vJX143或vJX143-M36h后的Marc-145细胞，出现了特异性荧光。同时，利用RT-PCR技术检测原代(P)和子代(P5)病毒，结果显示，分子标记依然稳定存在。上述结果说明利用反向遗传操作系统获得了和野毒具有相似生长特性的全长重组质粒，而且同时说明在0RF5下游插入的遗传标记并不影响整个病毒的生长，是可行的。1.4.3、病毒细胞半数感染量(TCIDs。)测定参照Pizzi，M.，5"柳joZi/7《ra77'3"o"oft力e/"i/Yy/erce/te/7^-/7W./7t,0^er历i/e^6/^eyeec/-M/e/7C力^e/re/s,鹏t力odHumBiol，1950.22(3):p151-90.中的方法，用96孔组织培养板方法进行感染性滴度的测定。将上述感染细胞后收取的病毒上清用维持液(2%FBS的DMEM)作10倍系列稀释后，将l(T连续稀释的病毒接种96孔细胞培养板上的MARC-145单层细胞，每稀释度接种4L，每孔0.20ml，再设2孔对照(即用维持液代替病毒液)，置37"C5%的二氧化碳培养箱中培养，逐日观察感染细胞，记录出现细胞病变的孔数，当停止出现细胞病变后，停止观察，并按Reed-Muench法计算TCID50，1.4.4、病毒多步生长曲线的绘制分别以低剂量(0.1MOI)病毒(野毒、vJX143和vJX143-M)感染MARC-145细胞，分别在感染后不同的时间段(6h、12h、24h、36h、48h、72h、84h、96h、108h、120h)收取细胞上清，并进行病毒滴度的测定，收取的每个时间点病毒用TCIDs。计算滴度，并根据不同时间点病毒的滴度，绘制病毒多步生长曲线，结果如图6所示，根据该图，在感染10h后病毒形成第一个复制高峰期，随后在第50h出现第二个复制高峰期;野毒株vJX143与嵌合病毒vJX143及vJX143-M之间的差异不显著。结果说明利用反向遗传操作技术，获得的全长重组质粒质粒拯救出来的病毒和野生毒株在病毒的复制，增值，各个时间的病毒滴度等及其平台期，指数增长期，平台期等生长曲线方面具有相似的生物活性。1.4.5、动物回归试验将12头35日龄PRRSV血清阴性猪分成4组，每组三头，以鼻腔接种分别接种野毒(A组)、嵌合病毒vJX143(B组)和vJX143-M(C组)及生理盐水(D组)，每头接种lml(TCID5I)lOVml)，同时肌肉注射lml，隔离词喂，每天测量体温并进行临床症状的观察，结果如图7所示。攻毒25天后，扑杀试验猪，采取肺、肾脏、脾、肠、淋巴结及血清，利用RT-PCR及细胞回归试验检测上述各组织器官中的病毒组分，实验结果如下A组和B组试验猪在攻毒5天后体温升高，攻毒猪均见消痩,腹式呼吸，食欲不振，精神沉郁,有部分猪发现水样稀粪，并伴有咳嗽症状，死亡猪尤其可见消瘦，腹式呼吸。A组猪分别在第13天和第16天死亡，B组猪分别在第14和15天死亡。对死亡猪剖检可见肺部症状明显，淋巴结出血明显，部分猪肾脏有出血点，少数猪伴有整个消化道广泛性出血、水肿，肠内容物为红色，含有大量气泡和粘液。C组猪体温、精神状况均正常，剖检未见上述变化。具体体温变化如图7所示。上述实验结果，说明拯救出来的病毒与野毒具有相似的生物学特性，而且在动物试验中也证实，这次猪高热综合症的病原确实是由vJX143为代表的病毒。在实施例1中，通过分子操作技术获得了正在中国大面积爆发的"猪高热综合征"的主要病原-高致病性PRRSV的全长序列，而且在此基础之上成功构建了高致病性全长重组质粒pJX143，并证实拯救出来的病毒与原毒具有相类似的生物学特性，更重要的是在动物回归试验中，该重组质粒pJX143呈现出与亲本毒相似的高致死率。此外，加入了遗传标记MluI的全长质粒具有相似的特征，而且在传代之后依然能够稳定存在，可以成为鉴定野毒与拯救病毒可靠的遗传标记，从而证实该株PRRSV是引起"猪高热综合征"的主要病原，而且也是中国这次大面积暴发的代表株；同时，根据反向遗传操作系统构建的该重组质粒可以为后续试验及其应用提供有效的操作平台。实施例2、蓝耳病嵌合病毒构建及检测2.1、引物设计根据pJX143株的序列，设计引物SPEF，NDE5F，Qst，SRS0E6,SFS0E7，SF12670,SR14365,SF14413和SR15497,其序列及序列说明如表1所示表l、克隆以及测序所用引物<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.2、结构蛋白嵌合质粒的构建以pJX143重组质粒的结构蛋白为对象，通过PCR扩增出pJX143的结构蛋白基因GP4-GP5-M-N和GP5-M-N，然后分别使用Spel/Xhol和Ndel/Xhol进行双酶切，再与经过相应的内切酶切过的弱病毒株pAPRRS的大片段通过T4DNA连接酶连接，经测序鉴定后筛选出阳性克隆，获得pSX12和p5NX12，构建策略如图8所示，具体构建步骤如下2.2.1、扩增结构蛋白GP4—GP5—M—N基因以pJX143作为模板，弓l物SPEF和Qst分别作为上游引物和下游引物，PCR扩增结构蛋白GP4—GP5—M—N基因，具体如下PCR反应体系为:pJX143模板lu1，上下游引物对(IOuM)各1ii1，10XpfuBuffer5iil，2.5mMdNTP2ul，PFUTurboDNA聚合酶5units,加水至50lU。PCR反应参数为95。C预变性2min，94。C变性45s，62。C退火45s，72。C延伸2min30s，共进行35个循环，然后72'C延伸10min。取PCR反应产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图9所示，根据检测结果，获得的目的片段大小为2.4kb。2.2.2、扩增结构蛋白GP5—M—N基因以pJX143作为模板，引物NDE5F和Qst分别作为上游引物和下游引物，PCR扩增结构蛋白GP5—M—N基因，具体如下PCR反应体系为'pJX143模板lul，上下游引物对(IOuM)各lul，10XpfuBuffer5ul，2.5mMdNTP2yl，PFUTurboDNA聚合酶5units,加水至50iil。PCR反应参数为95。C预变性2min，94。C变性45s，52。C退火45s，72。C延伸2min，进行6个循环，再95。C预变性加in，94。C变性45s，62。C退火45s，72。C延伸2min，进行25个循环，再72'C延伸10min。取PCR反应产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图9所示，根据检测结果，获得的目的片段大小为1.6kb。2.2.3、扩增结构蛋白基因的酶切利用小量胶回收试剂盒分别纯化实施例2.3.1和2.3.2中获得的PCR产物，然后分别以SpeI/XhoI双酶切GP4—GP5—M—N基因的PCR产物，以NdeI/XhoI双酶切GP5—M一N基因PCR产物，将获得的酶切产物分别用1%琼脂糖凝胶电泳后，使用胶回收试剂盒纯化酶切产物，获得大小分别为2.4kb的GP4—GP5—M—N基因片段和1.6kb的GP5—M—N基因片段。2.2.4、载体pAPRRS、p5NDE的双酶切分别以SpeI/XhoI双酶切pAPRRS，以NdeI/XhoI双酶切p5NDE。再将酶切产物分别以1%琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒纯化，分别获得大小分别为16kb的pAPRRS双酶切片段和17kb的p5NDE双酶切片段。2.2.5、嵌合质粒的连接和鉴定将回收的PCR双酶切产物和相应的质粒双酶切产物，以T4DNA连接酶连接，然后转化T0P10，筛选大小合适的阳性质粒，测序鉴定。具体步骤如下将PCR产物和相应的载体片段以摩尔比3:1的比例，以T4DNA连接酶连接，转化TOPIO，挑取独立的菌落进行纯培养，提取质粒DNA，1%凝胶电泳，挑取大小为18kb的质粒进行测序，结果分别如SEQIDNO:7和8所示。将GP4—GP5—M—N嵌合的全长质粒(即SEQIDNO:7对应的质粒)命名为pSX12,GP5一M—N嵌合的全长质粒(即SEQIDNO:8对应的质粒)命名为p5NX12。2.3、GP5—M的嵌合质粒质粒的构建及鉴定参考KarinLHeckmanetal.GenesplicingandmutagenesisbyPCR-drivenoverlapextension.NATUREPROTOCOLS.2007VOL.2NO.4,通过S0EPCR法，把p5NX12的N蛋白以及3'UTR基因置换成弱毒疫苗株全长重组质粒pAPRRS的相应部分，从而获得GP5—M的嵌合质粒，具体步骤如下在M蛋白和N蛋白基因重叠区域设计S0EPCR内引物(即SRS0E6和SFS0E7)，外引物采用SPEF和Qst。以p5NX12为模板，SPEF和SRS0E6为上下游引物，采用S0EPCR扩增，其中PCR反应体系为:p5NX12模板U1，上下游引物对(10pM)各1"1，10XpfuBuffer5ul，2.5mMdNTP2ul，PFUTurboDNA聚合酶5units,加水至50ul。PCR反应参数为:95°C预变性2min，94。C变性45s，62。C退火45s,72。C延伸2min，共进行35个循环，然后72'C延伸10min。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图9所示，然后用胶回收试剂盒回收，获得大小为1.9kb目的片段。然后，以pAPRRS为模板，SFS0E7和Qst为上下游引物，PCR扩增，其中PCR反应体系为:pAPRRS模板lii1，上下游引物对(IOuM)各1"1，lOXpfuBuffer5ul，2.5mMdNTP2ul，PFUTurboDNA聚合酶5units,加水至50ul。PCR反应循环参数为95°C预变性2min，94。C变性45s，68。C退火延伸2min，共进行35个循环，然后72T:延伸10min。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图9所示，然后用胶回收试剂盒回收，获得大小为0.5kb目的片段。最后，以上述两个PCR产物为模板，SPEF和Qst为上下游引物，PCR扩增，其中PCR反应体系为模板各lul，上下游引物对(10nM)各lul，10XpfuBuffer5ul，2.5mMdNTP2ul,PFUTurboDNA聚合酶5units,加水至50iU。PCR反应循环参数为95°C预变性2min，94。C变性45s，62。C退火45s，72'C延伸2min45s，共进行35个循环，然后72。C延伸10min。将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图9所示，然后用胶回收试剂盒回收，获得大小约为2.5kb目的片段。将回收获得的PCR产物和pAPRRS经SpeI/XhoI双酶切后连接，通过1%凝胶电泳筛选，将获得的大小约为18kb的质粒，命名为p56N12并进行测序，结果如SEQIDN0:9所示，根据该结果，p56N12构建成功。pSX12，p5NX12，p56N12以SmaI酶切鉴定，结果如图10所示，根据该结果，这三个嵌合质粒的Smal酶切图谱与预期的一致，没有发生结构缺失。根据上述实验结果，通过反向遗传操作，以pJX143株重组质粒pAPRRS质粒为基础构建了把JX143株GP4—GP5—M—N基因置换入pAPRRS而得到三个嵌合质粒的pSX12、p5NX12和p56N12。经Smal酶切鉴定，与pAPRRS比较，无缺失；经测序分析显示质粒SX12的序列为SEQIDNO:7，质粒5NX12的序列为SEQIDNO:8，质粒56N12的序列为SEQIDNO:9，根据该结果成功获得了3个变异株结构蛋白嵌合的嵌合质粒。2.5、嵌合质粒的拯救2.5.1、嵌合质粒转染细胞将MARC-145细胞传代至六孔板上，使每孔细胞数达到2乂105个，当细胞密度达到60%80%左右时即可进行转染。将pSX12，p5NX12，p56N12按Roche公司FUGeneHD转染试剂的方法转染MARC-145细胞，然后置37'C，5%002培养箱中培养，并观察细胞病变，待细胞病变达80%时，收集细胞上清。2.5.2、转染上清的传代与RNA的提取MARC-145细胞在含有10%FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍，将细胞病变上清与维持液(2%FBS的DMEM)按照1:10的比例接种上清液200yL，置37。C继续培养。传代5次以后，待产生80%CPE后，吸取病毒上清，按照QIAgen公司ViralRNAminiKit说明书的方法，提取病毒RNA。2.5.3、RT-PCR鉴定将提取的3个嵌合病毒上清RNA模板，按AMV(购自Takara公司)和rTaq(购自Takara公司)说明书进行RT-PCR反应，获得病毒cDNA序列，其中，cDNA第一链合成引物是Qst,PCR引物是SX12以SF12670、SR14365为上下游引物、5NX12以SF14413、SR15497为上下游引物、56N12分别以SF12670、SR14365和SF14413、SR15497为上下游引物进行PCR扩增，并测序鉴定，根据测序结果，3个嵌合病毒构建成功。将嵌合病毒在MARC-145细胞上连续传代5次后，取细胞上清用于抽提病毒基因组，并进行RT-PCR扩增重组质粒与弱毒重组质粒的嵌合交叉区域。经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统可见并测序，采用DNAstar软件与亲本重组质粒pAPRRS序列进行比对，结果显示3个嵌合病毒变异株序列都能稳定存在。根据实施例2，本发明在高致病性蓝耳病重组质粒和经典弱毒蓝耳病重组质粒的基础之上，将高致病蓝耳病病毒的GP4—GP5—M—N，GP5—M，GP5—M-N基因分别替换到经典弱毒蓝耳病重组质粒中，从而构建出3个嵌合质粒，经病毒拯救，获得了活病毒，经RT-PCR鉴定，嵌合病毒能够稳定的传代而不发生缺失，因此，上述3个嵌合病毒，可作为新型蓝耳病疫苗。从上述三个嵌合病毒中，任取一个进行动物实验，以验证其对蓝耳病具有免疫作用，在本发明的实施例3中，使用的是pSX12。实施例3、蓝耳病嵌合病毒免疫保护性试验3.1试验猪的选择及分组选取29日龄健康仔猪10头，经采集血清进行PRRSV抗体及抗原检测，确定为PRRSV抗体阴性和抗原阴性，称重后随机将其分为2组，5头/组，隔离饲养。3.2蓝耳病嵌合病毒接种选取TCIDs。为IO"的PRRSVSX12株病毒的Marc-145细胞培养物，用灭菌PBS液做IOO倍稀释后，颈部肌肉接种一组5头试验仔猪，104°TCID5。/ml，2ml/头；另一组5头猪颈部肌肉接种灭菌PBS液作为对照，2ml/头。3.3蓝耳病嵌合病毒免疫后的攻毒试验组仔猪在PRRSVSX12株病毒接种后28天，接种PRRSVvJX143株病毒用灭菌PBS液做10倍稀释的Marc-145细胞培养物，10"TCID5。/ml，颈部肌肉接种3ml/头。对照组5头猪也做同样剂量和途径的接种。3.4试验猪的体温测定试验及对照组猪在PRRSVSX12株病毒接种后至用PRRSVvJX143株病毒攻毒14天后，每天进行体温测定，测定结果如图11所示。根据测定结果，试验组在接种PRRSVSX12株病毒后未出现可观察到的体温反应;PRRSVvJX143株病毒攻毒后SX12株病毒接种组出现一过性体温升高，而对照组则出现明显的体温升高，并且比SX12株病毒接种组的高体温水平持续更长的时间。3.5试验猪血清抗体的测定在PRRSVSX12株病毒接种后第0，3，5，7，10，14，21，28天对SX12株病毒接种组采集血清，并利用IDEXXPRRSV抗体检测试剂盒(购自美国HerdChekIDEXX)进行抗体检测，同时对未免疫组定期采集血清,并进行抗体检测作为对照，结果如图12所示，根据该结果，试验组在接种PRRSVSX12株病毒后第10天抗体开始产生，14天达到阳性值(ELISAS/P》0.4)，攻毒后抗体继续升高并达到峰值，到剖杀时(免疫后52天)，抗体一直维持在高水平(ELISAS/P》3)，说明PRRSVSX12株有良好的免疫原性，可刺激机体产生很强的免疫反应。在PRRSVvJX143株病毒接种后第0，2，4，6，8，10，14天对SX12株病毒接种组和未免疫攻毒组采集血清并利用IDEXXPRRSV抗体检测试剂盒进行抗体检测，结果如图12所示，根据该结果，PRRSVvJX143株攻毒后，可有效刺激机体的免疫记忆细胞，使机体产生更高水平的抗体。3.6试验猪攻毒后的症状观察试验及对照组猪在PRRSVSX12株病毒接种后至用PRRSVvJX143株病毒攻毒后21天，每天进行症状观察。根据观测结果，试验组在接种PRRSVSX12株病毒后未出现可观察到的症状反应；PRRSVvJX143株病毒攻毒后SX12株病毒接种组5头中有两头出现轻微的呼吸症状和咳嗽，未出现典型的腹式呼吸；而对照组5头猪则出现严重的呼吸症状和咳嗽，呈现典型的腹式呼吸；并有一头猪在攻毒后14天死亡。3.7试验猪的各组织器官的病理学观察在PRRSVvJX143株病毒攻毒后21天，剖杀试验组和对照组的仔猪，其中对照组5头猪均出现肺脏水肿，部分猪出现有坏死；其中2头猪出现心、肺粘连和腹膜炎；全部猪腹股沟淋巴结和扁桃体淋巴结出现不同程度的出血；部分猪肝脏出现有黄白色的坏死灶；部分猪脾脏出现边缘性梗死；肾脏很少见到出血点，部分猪脑有出血，但未见肠道等消化系统的病变。而试验组仔猪，除2头仔猪出现轻微的肺部水肿外，未见到其他组织器官眼观病理变化。同时，观察其肺部病变，根据HalburPG，PaulPS，FreyML，etal，ComparisonofthepathogenicityoftwoUSporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolateswiththatoftheLelystadvirus.VetPathol，1995，32:648-660.的方法，对肺部的肺炎病变进行评估，结果如表2所示。表2、PRRSVSX12株肺脏的病理学评价<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注表中数据为肺炎病变部位占整个肺脏比例百分比的平均数士标准差；其中，"ND"指没有评价，a为SX12株免疫攻毒后5头猪的肺脏的病理学评价，b为未免疫组攻毒后14天死亡猪的肺脏的病理学评价，c为未免疫组攻毒后21天剖杀其余4头猪的肺脏的病理学评价。根据表2的评价结果，PRRSVSX12株免疫组肺部病变得分为12.00±8.37，远低于未免疫对照组的肺部病变得分(55.00±12.91)，说明PRRSVSX12株对成活猪保护性也很高，肺部病变轻微，说明该毒株对强毒的攻击有良好的保护作用。在实施例3中，对构建的蓝耳病嵌合病毒SX12株对29日龄仔猪进行了免疫保护性试验，其中SX12株病毒接种组在接种SX12后，未出现明显的体温反应和呼吸症状，说明该PRRSVSX12对猪致病力很低，PRRSV抗体在SX12株免疫后10天开始上升，14天达到并超过阳性水平(ELISAS/P〉0.4)，说明该PRRSVSX12对猪有良好的免疫原性，能刺激机体产生很强的免疫反应。在攻毒PRRSVvJX143株后，SX12株病毒接种组出现一过性体温升高，出现轻微的呼吸症状，剖检各组织脏器未出现明显的病理变化；而未免疫攻毒组则持续更长时间的体温升高，出现严重的呼吸症状和咳嗽，呈现典型的腹式呼吸；剖检可见典型的肺部病理变化，其他组织脏器部分可见典型的损伤，说明PRRSVSX12株免疫后可抗击强毒PRRSVvJX143株的攻击，具有明显的保护作用。综上所述，基于发病猪场获得的血清中分离出来的病毒构建的全长感染性cDNA质粒pJX143及其拯救出来的病毒具有和野生亲本毒相似的生物学特性和动物宿主的感染力和致死率。而且后续的试验证实，该重组质粒确实是引起这次"猪无名高热"的主要指病病原。基于上述重组质粒，构建了数株疫苗候选株(pSX12，p5NX12，p56N12)，其中的一株疫苗株pSX12对猪体具有较好安全性，免疫后可有效诱导产生机体免疫，并提供猪体免疫保护作用，对"猪高致病性蓝耳病"的免疫保护率高达100%，安全有效。序列表〈110〉中国农业科学院上海兽医研究所〈120〉高致病性猪蓝耳病病毒重组质粒和遗传工程疫苗〈130〉P5071073〈160〉9〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉2600<212>DNA〈213〉蓝耳病病毒〈400〉1atgacgtataggtgttggctctatgccacggcatttgtattgtcaggagctgtgaccatt60ggcacagcccaaaacttgctgcacgggaacaccctcctgtgacagccctcttcaggggga120ttaggggtctgtccctaacaccttgcttccggagttgcactgttttacggtctctccacc180cctttataccatgtctgggatacttgatcggtgcacgtgtacccccaatgctggggtgttt240gtggcggagggccaggtctactgcacacgatgtctcagtgcacggtctctccttcctctg300aatctccaagttcctgagcttggggtgttgggttttttttataggcccgaagagccactc360cggtggacgttgccacgtgcttt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