鳞片脱落疾病(sdd)致病病毒及其衍生物的制作方法
【专利说明】鱗片脱落疾病（SDD)致病病毒及其衍生物
[0001] 本发明涉及分离的造成鱼的鳞片脱落疾病的病毒，涉及包含所述病毒的细胞培养 物，涉及基于所述病毒的疫苗和这样的疫苗的制备方法，涉及与所述病毒反应的抗体，涉及 用于检测该病毒的诊断测试试剂盒，和涉及所述病毒的用途。
[0002] 在过去的数十年中，全世界范围可见鱼类消耗的剧烈增加。这同样关于冷水鱼(诸 如鲑鱼、比目鱼、大比目鱼和鳕鱼）以及热带鱼(诸如亚洲海鲈（尖吻鲈）、罗非鱼、遮目鱼、 黄尾鱼、琥珀鱼、石斑鱼和军曹鱼）的消耗。因此，见到养鱼场的数目和大小的增加，以便满 足日益增加的市场需要。
[0003] 如由例如畜牧业已知的，紧密生活在一起的大量动物易受各种各样的疾病影响， 甚至是几乎不知道或没见过的疾病，或甚至是在大规模商业养殖期之前未知的疾病。这对 于鱼类养殖同样适用。
[0004] 近年来，在养殖的亚洲海解（?卢鱼（ZaiescaJcari/kr))中发现了一种新疾病综 合征。该疾病的最显著特征在于鳞片脱落，并因此经常被称作"鳞片脱落综合征"(SDS)。在 马来西亚槟榔屿（Penang)养殖的亚洲海鲈中首次报道了该疾病。以后发现该新疾病的爆 发也在2002年、2006年和2009年发生在新加坡。更近的病例于2010年报道自印度尼西亚 Bantam的养鱼场和再次来自新加坡，以及在2011年也来自StraitsofMalaka的养鱼场。 该疾病的发病率当前正在增加。
[0005]Gibson-Kueh,S.，等人（JournalofFishDiseases35; 19-27 (2012))最近 描述了该疾病综合征。
[0006] 该疾病最初见于成年笼养鱼中，且也见于苗圃的鱼苗中。死亡率被描述为慢性的、 拖延的，且在最初的30%至总体的75%之间变化。
[0007] 遭受该综合征的鱼的主要临床征象首先是如上所述的鳞片脱落、昏睡行为和有时 肿大的眼睛。鱼有时也显示出神经学征象：一些受影响的鱼显示出螺旋游泳，可能是由于脑 中的血管损伤，其导致多病灶脑软化。
[0008] 主要组织学征象具体地是所有重要器官(包括皮肤）中的血管内皮变性（血管 炎）。该血管炎导致组织坏死，其也影响胃腺、脾、肾和心脏。也如Gibson-Kueh所述，覆盖 鳞片床的真皮经常是坏死的，且与鳞片脱落有关。
[0009] 但是，没有发现该疾病的成因。Gibson-Kueh声称，病鱼中的组织病理学以及在 组织中观察到的大六角形病毒粒子和小得多的六角形病毒粒子可能提示病毒病原学的 可能性，但是她的结论是，总体上，在检查的组织中的病毒粒子数目较低。基于大小和形 态学，一些观察的病毒粒子类似于虹彩病毒，但是使用抗-真鲷虹彩病毒（RedSeabream Iridovirus，RSIV)单克隆抗体M10(Nakajima,Κ·等人，FishPathology30: 115-119 (1995))的免疫组织化学给出了阴性结果。
[0010] 使用已知靶向大范围的已知虹彩病毒的RSIV引物的PCR测试也给出了阴性结果。
[0011] 通过使鱼组织与蓝仿石自卢（/&67??^〇/7scii/TiAs·Shaw) (GF)细胞和亚洲海自卢细胞 接触来分离病毒的尝试（Chong，S.等人，SingaporeVet.J.1; 78-89 (1987))也没有成 功。
[0012] 鉴于观察到的非常低数目的病毒样颗粒，Gibson-Kueh提示，该疾病可能是对病毒 抗原的免疫超敏反应的结果，而不是由病毒造成。例如，提示这样的反应是鲑鱼（salmonid) 的草莓病的成因。
[0013] 除此以外，血管炎和有关的坏死(其为SDS的标志）对于虹膜疾病并不是通常的。
[0014] 此外，在SDS中看到的病变在几个方面不同于在虹彩病毒疾病中看到的病变。
[0015] 尽管有上述的尝试，没有发现病毒起源，且甚至没有发现病毒涉入的证据，该事实 将Gibson-Kueh引导至低数目的不同病毒的存在的以下解释："病毒样颗粒相对难以发现。 此外，全身性虹彩病毒疾病现是Z.cahari/ei#鱼场中的地方流行病，所以它们的存在可 以是共同病原体的偶然发现"。
[0016] 因为这些原因，该疾病的病原体直到现在仍然完全不明。
[0017] 本发明的一个目的是，提供该疾病的病原体以及以战胜该疾病为目标的疫苗。此 外，本发明的一个目的是，提供检测和鉴别所述病原体的装置。
[0018] 现在已经确定，该疾病的病原体是具有约140nm直径的二十面体病毒。
[0019] 发现该病毒属于双链DNA病毒，且现在已经确定该病毒的DNA序列的大部分。
[0020] 该新病毒的序列与基因组数据库中的其它序列的对比意外地揭示，在核苷酸水 平，该病毒与虹膜病毒科（/riobKirii/ae)的病毒具有特定尽管低的相似性水平，所述虹膜 病毒科是具有二十面体形状、具有120-350nm之间的大小且具有双链基因组的病毒科。
[0021] 由于现在已经鉴别出该疾病的病原体，该疾病在描述中不再被称作鳞片脱落综合 征，而是被称作鳞片脱落疾病（SDD) (#义》)。
[0022] 该病毒的代表已经在登录号CNCM1-4754下保藏在CollectionNationalede CulturesdeMicroorganisms(CNCM),InstitutPasteur, 25RueduDocteurRoux, F-75724ParisCedex15，France〇
[0023] 基于序列对比，可以鉴别编码主要衣壳蛋白的基因和编码该病毒的ATP酶的基 因，其与已知的虹膜病毒科具有某种相似性。
[0024] 编码主要衣壳蛋白的基因和编码ATP酶的基因的DNA序列的例子分别描述在SEQ IDNO: 1和SEQIDN0: 3中。SEQIDN0: 2代表主要衣壳蛋白的氨基酸序列。SEQID NO: 4代表ATP酶的氨基酸序列。
[0025] 虹膜病毒科目前包括5个属：蛙病毒属（Ranaviruses)、肿大细胞病毒 (Megalocytiviruses)、淋巴囊肿病毒属（Lymphocystiviruses)、绿虹彩病毒属 (Chloriridoviruses)和虹彩病毒属（Iridoviruses)(JunKurita和KazuhiroNakajima， Viruses4; 521-538 (2012))〇
[0026]Kurita和Nakajima的论文具体地显示了 5个属的共计20个已知种的系统树中的 5个属的概要（另外，添加了 3个囊泡病毒同系物作为外群体）。该系统树给出了不同种的 相互亲缘关系/距离的指示，并且使为什么将这些病毒中的每一种归类为5个属之一的成 员形象化。
[0027] 基于根据本发明新发现的SDD病原体的MCP和ATP酶编码DNA序列，可以做出新 的系统树(基于邻接方法)，且发现编码序列中的MCP和ATP显示与虹膜病毒科的系统树的 某种匹配。
[0028] 使用程序MEGA，第5版，使用标准设置，制作这些树（MEGA5:Molecular EvolutionaryGeneticsAnalysisUsingMaximumLikelihood,EvolutionaryDistance,andMaximumParsimonyMethods.锦趣chiroTamura,DanielPeterson,Nicholas Peterson,GlenStecher,MasatoshiNei和SudhirKumar.Mol.Biol.Evol. 28 (10): 2731-2739.2011doi:10.1093/molbev/msrl21AdvanceAccesspublication，2011年5月 4曰）。
[0029] 基于该新病毒的二十面体形状、120-350nm之间的基因组大小和双链基因组，且 基于主要衣壳蛋白邻接树(使用MEGA5得到，其具有指示推论的分支模式的稳健性的统计 支持，如使用自举测试评估的)，发明人认为该病毒是虹膜病毒科的一个成员。
[0030] 基于MCP序列的树描绘在图8中。基于ATP酶序列的树描绘在图9中。
[0031] 非常令人惊奇的是，基于它与5个已知属的距离，新发现的SDD的病原体似乎没有 匹配5个属中的任一个，如从图8可以容易地看出的。
[0032] 因而，基于它的主要衣壳蛋白和它的ATP酶的编码DNA序列，可以特别地将该病毒 与虹膜病毒科的已知成员区分开。
[0033] 经证实，根据本发明的病毒的主要衣壳蛋白与甚至虹膜病毒科的其它种中的最接 近的MCP具有仅65%的序列同一性水平。
[0034] ATP酶与虹膜病毒科的其它种的最接近的ATP酶具有仅68%的序列同一性水平。
[0035] 使用主要衣壳蛋白和ATP酶编码DNA序列，开发了对根据本发明的病毒特异性的 引物。
[0036] SEQIDNO: 1显示了编码根据本发明的病毒的主要衣壳蛋白的基因的核苷酸序 列的通常例子。
[0037] 应该理解，对于本文中包括的具体蛋白而言，天然变异可以存在于所述病原体的 各个代表之间。导致例如主要衣壳蛋白序列中的微小变化的遗传变异确实存在。这对于ATP 酶而言同样适用。首先，存在所谓的"第二和第三碱基中的摇摆"，其解释了核苷酸变化可 能发生，其在它们编码的氨基酸序列中不引人注意：例如三联体TTA、TTG、TCA、TCT、TCG和 TCC都编码亮氨酸。另外，可以在氨基酸序列中看到根据本发明的SDD病毒的代表之间的微 小变异。这些变异可以由整个序列中的一个或多个氨基酸差异反映，或由所述序列中的一 个或多个氨基酸的缺失、置换、插入、倒位或添加反映。已经描述了基本上不会改变生物活 性和免疫学活性的氨基酸置换，例如Neurath等人在"TheProteins"AcademicPressNew York(1979)中。有关的氨基酸之间的氨基酸置换或在进化中已经频繁发生的替换尤其是 Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、Ile/Val(参见Dayhof，M.D. ,Atlasofprotein sequenceandstructure,Nat.Biomed.Res.Found. ,WashingtonD.C. , 1978,第 5 卷， 增刊 3)。其它氨基酸置换包括Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、 Th;r/Phe、Ala/P;ro、Lys/A;rg、Leu/Ile、Leu/Val和Ala/Glu。基于该信息，Lipman和Pearson 开发了一种用于快速和灵敏的蛋白对比（Science227，1435-1441，1985)以及确定同源 蛋白之间的功能相似性的方法。本发明的示例性实施方案的这类氨基酸置换以及具有缺失 和/或插入的变异是在本发明范围内。
[0038] 这解释了为什么MCP和ATP酶（当分离自根据本发明的SDD病毒的不同代表时)可 能具有显著低于100%的同源性水平，但是仍然代表SDD病毒(鳞片脱落疾病的病原体）的 MCP或ATP酶。
[0039] 这明显地反映在例如Kurita和Nakajima的论文的图4中，其中表明，即使在由高 度相关的淋巴囊肿疾病病毒（LCDV)组成的淋巴细胞病毒属内，所有LCDV仍然具有显著不 同的MCP氨基酸序列。
[0040] 因而，本发明的第一个实施方案涉及一种分离的病毒，其是包含MCP基因和ATP酶 基因的虹膜病毒科的一个成员，其特征在于： a) 所述病毒是鱼的鳞片脱落疾病的病原体，且 b) MCP基因的核苷酸序列与在SEQIDNO: 1中描绘的核苷酸序列具有至少80%的同 一,性水平。
[0041] 就本发明的目的而言，同一性水平应理解为SEQIDNO: 1的序列与必须要确定其 同一性水平的病毒的主要衣壳蛋白的对应区域的同一性水平。
[0042] 用于确定同一性水平的合适程序是NCBI'sBasicLocalAlignmentSearchTool 的核苷酸blast程序（blastn)，其使用"比对2个或更多个序列"选项和标准设置（http:// blast,ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 〇
[0043] 就本发明的目的而言，分离是指：脱离所述病毒在自然界中伴随的组织。分离的病 毒的一个例子是存在于细胞培养物中的病毒。
[0044] 该实施方案的一种优选形式涉及具有主要衣壳蛋白（MCP)基因的病毒，所述主要 衣壳蛋白（MCP)基因与SEQIDNO: 1所示的MCP的核苷酸序列具有至少82%的同一性水 平，更优选 84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或甚至 100%，以该 优先次序。
[0045] 表征根据本发明的病毒的另一种可选方式涉及所述病毒的ATP酶的序列。
[0046]SEQIDN0: 3显示了根据本发明的病毒的ATP酶基因的核苷酸序列的一个通常例 子。但是，如上面所解释的，发现了导致ATP酶序列的微小变化的天然变异。
[0047] 因而，本发明的该实施方案的另一种形式涉及一种分离的病毒，其是包含MCP基 因和